植酸梅高产菌株的筛选及其基因分析

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13(1):108~113

*基金项目：重庆市科委攻关项目（No.20016755）资助。

彭远义:男，1965年生，博士，副教授。E-mail:.

**通讯作者。Author for correspondence.E-mail:.收稿日期：2004-02-18接受日期：2004-03-22·研究论文·

植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析*

彭远义1，2**马丽苹2李春明2刘生峰2周泽扬1**

（1.西南农业大学重庆市蚕桑学重点实验室微生物中心,重庆400716;

2.西南农业大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室,重庆400716）

摘要：从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的黑曲霉()菌株03214，其植酸酶最适pH值为1.5和2.5，最适温度为50℃，植酸酶表达量为345U/mL发酵液。通过对黑曲霉03214植酸酶基因进行PCR扩增，获得了1条长约1.5 kb的特异性产物。以pMD18-T为载体，构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明，目的基因片段含有植酸酶基因的完整序列，基因全长1506bp，其中包含一段长102bp的内含子，编码467个氨基酸，有10个潜在的糖基化位点，5’端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶的进一步研究提供了新的材料。

关键词：植酸酶;黑曲霉03214;基因;序列分析

Screening of03214Strain Producing Phytase and

Sequence Analysis of Its Phytase Gene

PENG Yuan-Yi1,2**MA Li-Ping2LI Chun-Ming2LIU Sheng-Feng2ZHOU Ze-Yang1**

(

)

A total of102phytase-producing microorganisms were screened from the soil.The most active fungal isolate of them, 03214,was identified as.The optimal pH values for the activity of the phytase produced by03214 were found to be in pH1.5to2.5and the optimal reaction temperature of the phytase for its activity was about50℃.Cultivated with a shaking method,the phytase of the strain was produced at345U/mL fermented liquid.The gene encoding phytase was cloned from03214by PCR.Nucleotide sequence analysis of the gene revealed that the coding region was1506bp in length included with a102bp intron,and encoded a peptide of467amino acid residues.A signal peptide encoding19amino acids was found at the5'end.There were ten potential N-glycosylation sites in the

phytase.

phtase;03214;gene;sequence analysis

植酸是一种广泛存在于植物籽实的有机络合

物，它常和二价或三价阳离子结合形成不溶性盐。谷

物饲料及其加工产品中60%~80%的磷以植酸磷

（六磷酸肌醇）形式存在，单胃动物(猪、禽等)由于

缺乏分解植酸磷所必需的酶而不能有效地利用植酸

磷，造成磷源浪费，同时未被消化的植酸磷经动物排

出体外后易造成有机磷富积，引起环境污染。植酸还

是一种重要的抗营养因子，它在动物胃肠道消化过

程中会与多种金属离子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及

蛋白质螯合形成相应的不溶性复合物，从而降低动

物对这些营养元素的有效利用。

植酸酶是近年出现的一种新型绿色添加剂，它

可催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐，目

前主要用于饲料工业和食品工业，以消除植物性饲

料（或食品）中植酸的抗营养作用，提高机体对蛋白

质及多种微量元素的利用率，促进生长发育，提高动

第1期彭远义等:植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析

物生产性能，减少粪便中磷的排放量，降低磷对环境的污染(Hurrell.,2003;Lim.,2003;Lei and stahl,2001)。

植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，已成为世界性的研究热点之一(姚斌等,1998;王红宁等,2001;Eric .,2000;Tomschy.,2002)。本实验通过从土壤中筛选植酸酶高产菌株，并对其植酸酶基因进行克隆分析，以期为植酸酶的进一步研究提供新的资源。

1材料和方法

1.1培养基

1.1.1初筛培养基1%植酸钙，3%葡萄糖，0.5% NH4NO3，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.05% MgSO4·7H2O，0.003%FeSO4·7H2O，1.4%琼脂，pH 5.5。

1.1.2复筛培养基 1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，

0.003%MnSO4·4H2O，0.003%FeSO4·7H2O，pH5.5。

1.2试剂

DNA聚合酶、RⅠ和Ⅰ购自TaKaRa公司，DNA聚合酶购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司，植酸钠（P3168）购置Sigma公司。

1.3菌种和质粒

大肠杆菌()DH5α（西南农业大学蚕桑学重点实验室保存），pMD18-T Vector购自TaKaRa公司。

1.4植酸酶产生菌的筛选

取土样按传统方法稀释后涂布于固体筛选培养基，28℃培养3d，挑取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，平板划线法进行分离纯化。将初筛菌株接种于液体发酵培养基，28℃、220r/min摇床发酵5d后，测定各样品发酵上清液酶活。植酸酶活性的测定参照张若寒(1997)报道方法略加改进后进行。酶活性单位（U）定义为：在一定条件下，每分钟从0.0051mol/L的植酸钠溶液中释放出1nmol无机磷所需要的酶量为1个酶活单位。

1.5植酸酶产生菌的鉴定参照魏景超(1997)方法进行。

1.6植酸酶基因的克隆与分析

1.6.1植酸酶产生菌基因组DNA的提取以筛选出的植酸酶高产菌株黑曲霉() 03214为供试菌株，采用改良氯化苄法提取其基因组DNA。将黑曲霉03214菌株接种于马铃薯固体培养基，28℃培养48h，然后转接入马铃薯液体培养基中，28℃摇床培养至长出大量菌丝。收集菌丝体，加入液氮研磨成粉末状。在1.5mL离心管中加入约0.1g菌丝粉末和500μL DNA抽提液（100mmol/L Tris-Cl，pH9.0；40mmol/L EDTA，pH8.0），振荡混匀，再加入10%SDS100μL和氯化苄300μL，剧烈震荡使管内混合物成乳状。50℃保温1h后，加入300μL3mol/L NaAc（pH5.0）混匀，冰水浴15 min，10000r/min离心15min，收集上清液，加入RNase（终浓度为100μg/mL）37℃消化30~60 min。酚氯仿抽提1~2次，取上清液，加入等体积无水乙醇沉淀20min，10000r/min离心15min，沉淀用70%乙醇洗涤2次，TE缓冲液溶解DNA。用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提效果。

1.6.2黑曲霉植酸酶基因的PCR扩增与回收引物设计：根据GenBank中已有的黑曲霉植酸酶基因序列，并结合已报道的黑曲霉植酸酶phyA基因PCR引物序列设计引物，由上海生物工程公司合成。

上游引物：5'ATAGGCATCATGGGCGTCTCT3'；

下游引物：5'CAGCTAAGCAAAACACTCCGC3'。

植酸酶基因的扩增与回收：以黑曲霉03214基因组DNA为模板，用Pyrobest DNA聚合酶扩增植酸酶基因。反应体系：Buffer5μL，dNTP4

μL，DNA1μL，Pyrobest DNA聚合酶0.25μL，上下游引物各1μL，ddH2O37.75μL。反应条件：94℃5 min，（94℃1min，55℃45s，72℃1.5min）×30，72℃延伸10min。扩增产物用DNA回收试剂盒回收。

1.6.3植酸酶基因的克隆将回收产物两端加A 后与pMD18-T载体在4℃下连接过夜。取连接反应液转化DH5α感受态细胞，涂布于含有Amp、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上，37℃培养24h，采用碱裂解法抽提质粒DNA，并进行电泳检测、酶切鉴定和PCR鉴定。

1.6.4植酸酶基因的序列测定与分析所获阳性克隆菌株质粒DNA由宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定，采用相关软件对测序结果进行分

109

农业生物技术学报2005年

析。

2结果和分析

2.1菌种筛选

利用植酸钙平板选择培养基从土壤中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定，其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL。经鉴定，该菌株为黑曲霉（图1,2）。

图1.黑曲霉03214在植酸钙平板上形成的透明圈

Fig.1.The hydrolysis bound resulted by

03214in plate containing calcium phytate

图2.黑曲霉03214的产孢结构（400×）

Fig.2.The conidiogenous structure of

03214(400×)

2.2黑曲霉03214菌株植酸酶pH适性和温度适性

黑曲霉03214菌株经28℃摇瓶发酵5d后，离心取上清液进行植酸酶活性测定。pH适性的测定为将底物（植酸钠）经一系列不同pH值的缓冲液配制，37℃下测定酶活性。结果表明，黑曲霉03214菌株植酸酶在pH1.5和2.5时分别有一酶活性峰值，其中在pH2.5时酶活性最高，随着pH值的升高，酶活性逐渐下降（图3）。经不同温度保温处理，在pH2.5条件下检测的植酸酶温度适性结果表明，其最适温度为50℃（图4）。

图3.黑曲霉03214植酸酶的pH适性

Fig.3Effect of pH on the phytase activity of

03214

图4.黑曲霉03214植酸酶的温度适性

Fig.4.Effect of temperature on the phytase activity of

03214

2.3黑曲霉03214植酸酶基因的PCR扩增与回收

用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到一条长约1.5kb的特异性条带，与报道的黑曲霉植酸酶基因大小基本一致。用DNA回收试剂盒回收扩增产物，电泳检测结果表明，1.5kb左右的特异性扩增产物回收纯度较高。

2.4植酸酶基因的克隆

重组质粒DNA用RⅠ和Ⅰ双酶切，酶切产物经电泳检测，在1.5kb处呈现特异性条带。以重组质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物在1.5kb处呈现特异性条带，说明已成功克隆了植酸酶基因。

2.5植酸酶基因的序列分析

测序结果表明，黑曲霉03214植酸酶基因全长1506bp（图5），其中+45~+146位的102个核苷酸序列为真菌内含子序列。黑曲霉03214植酸酶基因中G+C含量达54.76%，而密码子第3位碱基的G+C含量更高达67%，在密码子第3位碱基上高

频110

第1期彭远义等:植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析使用G 和C 碱基是曲霉高效表达蛋白编码序列所具有的特征之一(Llyd and Sharp,1991)。该基因编码467个氨基酸，根据信号肽切割位点的预测原则(von Heijine,1986)并结合已知的植酸酶核苷酸序列分析，N 端的19个氨基酸为信号肽，信号肽切割位

点位于第19个氨基酸残基之后，

其余的448个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。氨基酸序列中含有植酸酶的活性位点序列(Ullah and Dischinger,1993)：CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK ，它位于氨基酸序列的+71~+93位，其中RHGARYP 是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列。黑曲霉03214植酸酶基因与已报道植酸酶phyA 基因有不同程度的同源性（表1），其中与目前报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株NRRL3135（来源于（）var.）的同源性为96.48%（1453/1506），有53个核苷酸的不同，二者在结构基因的长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、编码植酸酶活性位点序列、内含子序列及位置等均相同；所编码的氨基酸同源性高达

97.21%（454/467），

有13个氨基酸的差异。与黑曲霉N25植酸酶基因同源性为96.55%（1454/1506），

氨基酸同源性为97%（453/467），

有14个氨基酸残基不同。进一步采用Expasy/Protparam 等软件对黑曲霉03214植酸酶基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉03214phyA 基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要(Yanming .,1999)；理论pI 为4.99，分子量为51022.9，分子式为C 2259H 3474N 600O 719S 15；负电荷氨基酸残基（Asp+Glu ）有50个，占10.7%；正电荷氨基酸残基（Arg+Lys ）

有34个，占7.3%。黑曲霉03214与NRRL3135二者基因的差异主要表现在+729~+1444位核苷酸序列上（43/53），在此区间黑曲霉03214与N25二者基因的差异为32/52（图6）。

图5.黑曲霉03214植酸酶基因核苷酸序列及推导出

的氨基酸序列

Fig.5.The nucleotide sequence of

gene and its deduced amino acid sequence of

03214strain

The intron is indicated by lower-case letters and the intron donor ，lariat and acceptor consensus sequences are underlined.Signal peptide cleavage site is indicated by arrow.Potential N-glycosylation sites are indicated by amino acids N underlined.The active-site amino acid

sequence is underlined.

3讨论

目前用于提取真菌DNA 的方法主要有CTAB

法和氯化苄法。张莉莉等(2000)认为采用氯化苄法提取真菌DNA 时，可以省略蛋白质抽提过程，但我们在实验中发现，若不采用酚氯仿抽提，蛋白质过多，为此我们采用改良氯化苄法，并在抽提前先进行

表1黑曲霉03214

基因与其它菌株

基因的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列同源性比较

Table 1Homology comparison of nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of

genes

among

03214strain and other strain s

基因核苷酸/%氨基酸/%GenBank 登录Gene Nucleotide identities Amino acid identities GenBank accession

（NRRL3135）96.48（1453/1506）97.21（454/467）M94550（N25）

96.55（1454/1506）97（453/467）AF218813（）

96.15（1448/1506）95.9（448/467）L02421（

）91.49（1386/1515）

94（443/467）

AB022700

111

农业生物技术学报2005年

图6.黑曲霉03214与N25、NRRL3135基因的比较

https://www.360docs.net/doc/ef4526048.html,parison of

gene among

03214,

N25and NRRL3135strain

*indicated the same

base

RNase 消化，以便采用酚氯仿抽提时将RNase 一并除去，以节省时间。本实验采用此法获得的DNA

纯度较高，

适合作PCR 扩增模板。单胃动物胃中pH 值为1.5~3.5，肠道pH 值为5.0~7.0，植酸酶作为饲料添加剂使用时，要求植酸酶在37℃和酸性条件下必须有较高的酶活性。本研究筛选出的黑曲霉03214菌株植酸酶在37℃、pH 2.5时酶活性高达345U/mL ，植酸酶基因G+C 含量以及密码子第三位碱基的G+C 含量与姚斌等(1998)报道的

963相当，植酸酶基因核苷酸序列及编码氨基酸序列与NRRL3135菌株同源性高达96.48%和97.21%，具备了进一步开发研究的优良潜质。尽管黑曲霉03214植酸酶基因与已有报道植

酸酶

基因有较高的同源性，但其编码的植酸酶分子量大小、

氨基酸组成、温度适性及pH 适性等特性与其它来源的植酸酶均有所不同(姚斌和范永六;2000)，其中黑曲霉03214植酸酶理论分子量为51022.9，在pH 值为1.5和2.5时酶活性最高，最适反应温度为50℃；而NRRL3135菌株植酸酶分子量为51075，最适pH 为2.5和5.5，最适反应温度为55℃；Aspergillus niger963植酸酶分子量为51142，最适pH 为1.8和5.7，最适反应温度为57℃。研究结果为植酸酶产生菌的进一步诱变选

育、工程菌构建、

在分子水平上研究植酸梅结构与功能的关系以及在分子水平上改造植酸酶基因提供了新的材料。目前作者已将黑曲霉03214的诱变突变株N14的植酸酶基因在毕赤酵母中获得高效表达，经摇瓶发酵酶活性高达1伊105U/mL 发酵液，表达产物在pH 值为 2.5~3.0和5.5时酶活性最

112

第1期彭远义等:植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析

高，并且在pH2.5~6.5之间均有相当高的酶活性，优于目前已有报道(彭远义等,2004)。

参考文献

Eric R,Edward J M and Xin G L.Expression of the

phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme,

,2000,268(2): 373~378

Hurrell R F,Reddy M B,Juillerat M A and Cook J D.

Degradation of phytic acid in cereal porridges improves iron absorption by human subjects.

,2003,77:1213~1219

Lim H S,Namkung H and Paik I K.Effects of phytase supplementation on the performance,egg quality,and phosphorous excretion of laying hens fed different levels of dietary calcium and nonphytate phosphorous.

2003,82:92~99

Lei X G and Stahl C H.Biotechnological development of effective phytases for mineral nutrition and environmental protection.,2001,57: 474~481

Lloyd A T and Sharp P M.Codon usage in.

1991,230:288~294 Peng Y Y(彭远义),Liu S F(刘生峰),Li Ch M(李春明)and Zhou Z Y(周泽扬),et al.Over expression of Aspergillus niger N14Phytase Gene in.

(生物工程学报),2004,20:967~971(in Chinese with English abstract)

Tomschy A,Bruqqer R,Lehmann M,Svendse A,Vogel K, Kostrewa D,Lassen S F,Burger D,kronenberger A,van Loon A P,Pasamontes L and Wyss M.Engineering of

phytase for improved activity at low pH.

,2002,68:1907~1913

Ullah A H J and Dischinger J H C.Identification of active-site residues in extracellular pH2.5optimum acid phosphatase.,1993,192: 754~759

Von Heijine G.A new method for predicting signal cleavage sites.,1986,14:4683~4690

Wang H N(王红宁),Wu Q(吴琦),Liu S G(刘世贵),Xie J(谢晶)and Ma M G(马孟根).Cloning and sequence analysis of the phytase gene of N25.

(微生物学报),2001,41:310~314(in Chinese with English abstract)

Yanming H,David B W and Xin G L.Expression of an

phytase gene(phyA)in

.,1999,65: 1915~1918

Yao B(姚斌)and Fan Y L(范云六).Molecular biology and gene engineering of phytase.

(生物工程学报),2000,16:1~5(in Chinese)

Yao B(姚斌),Zhang C Y(张春义),Wang J H(王建华),Fan Y L(范云六),Shi X Y(史秀云),Wang Y R(王亚茹)and Li Sh-M(李淑敏).Isolation of963with phytase activity and cloning its phytase gene A2,

(农业生物技术学报),1998,6: 1~6(in Chinese with English abstract)

Zhang L L(张莉莉),Zhang L H(张苓花),Shi J F(史剑斐)and Wang Y J(王运吉).Iso1ation and mo1ecu1ar biological analyses of genomic DNAs from fungi using benzyl chloride.

(大连轻工业学院学报),2000,19(1):45~47(in Chinese with English abstract) Zhang R H(张若寒).Determination methods of phytase activity.

(中国饲料),1997,5:30~32(in Chinese)

113