极濒危树种的遗传拯救

悬崖勒马：对一种极濒危树种的遗传拯救

A. FINGER, C. J . KETTLE, C. N. KAISER-BUNBURY, et al.

生境片断化的增加导致了种群变小和相互隔离，稀有的植物往往容易遗传流失和近交。这些问题对种群的影响程度至今仍备受争议。我们探讨了一种非洲塞舌尔群岛片断化分布的特有极濒危长寿命热带树种水母柱树的遗传和繁殖进程。这个物种在其存在的4个种群中有3个种群更新困难。我们对其更新困难是否与生境片断化所导致的遗传问题相关进行了探讨，并分析了遗传拯救是否可以减缓上述问题。水母柱树现存4个种群由90个体组成，其中仅有最大的种群能够顺利更新。利用10个微卫星位点，我们证明了3个种群具有较高的遗传多样性（H E: 0.48–0.63；H O: 0.56–0.78），只有最小的种群遗传多样性较低（H E: 0.26；

H O: 0.30）。所有种群都具有特有的等位基因、较高的遗传分化以及显著的种群遗传结构。花粉和种子扩散距离小于100米。小种群中的个体比大种群中的具有更大的相关性，因此自交可以解释小种群中的更新困难。事实上，比起种群内的杂交，大种群的花粉传授到小种群中的种群间的花粉杂交具有更高的繁殖成功率。我们的研究表明对于自然片断化分布的物种其种群间维持基因流的重要性。我们论证了对具有有限基因流的植物物种进行保护的潜在的遗传和生态拯救。

引言

生境片断化对濒危植物潜在的负面结果是残存小种群间的基因流受限，这可能使得遗传变异丧失并减小个体的适合度(Charlesworth & Charlesworth 1999; Leimu et al. 2010; Angeloni et al. 2011)。在小种群中，遗传漂变和近交能够固定隐性的有害等位基因，从而使得种群遗传多样性的减少并进一步通过近交衰退降低适合度(V an Geert et al. 2008)。大部分根据经验的研究证实，在野生植物种群中，遗传多样性的降低与近交的增加和适合度的下降有关Leimu et al. 2006 and Lowe et al. 2005)。理解遗传变异丧失的进程有助于制定种群和物种的管理策略。森林中的树种也表现出对森林片断化的较大反应(Kramer et al. 2008; Bacles & Jump 2011)，表现在物种繁育系统和统计学特征上的脆弱(Ghazoul 2005)。例如，当种群处于片断化生境时，基因流受限的树种可能更易受到近交的影响(Jones & Comita 2008; Kettle et al.

2011)。

遗传拯救是一种对遗传上存在问题的种群通过利用移入新个体（或基因型）而减缓遗传变异丧失进而提高种群适应能力的辅助措施(Thrall et al. 1998)。对一年生和短命的多年生植物的研究已经证实，对于以花粉为媒介的种群间基因流，引入一个新的个体到一个种群中可以增加适应性组分和种群的遗传变异，这对于小种群更为有效(Richards 2000; Newman & Tallmon 2001; Tufto 2001; Bossuyt 2007; Willi et al. 2007)。尽管长寿命树种受威胁的数量在不断增加，然而对于其潜在的遗传拯救的研究却很少，这可能是由于许多树种都普遍具有较高的基因流的原因(Petit & Hampe 2006)。

我们通过对一种极濒危(IUCN 2010)特有种水母树的研究对这些问题进行探索，水母树在塞舌尔群岛上仅有90个成年个体分布在4个隔离的地方。仅有一个最大的种群尚处于可更新状态，其余的种群仅由极少数个体组成。这种在分类学上地位特殊的物种(Fay et al. 1997)是许多塞舌尔岛特有的濒临灭绝的物种之一，但被认为是最需要优先保护的物种。尽管在自然状态下处于片断化分布，水母树种群由于受到人为活动（火与入侵物种）的影响正处于进一步减小趋势。此外，水母树被认为是许多濒临灭绝植物的典型，也是全世界8753种濒临灭绝的物种之一(Oldfield et al. 1998)。许多热带种群都存在较高程度的生境分化，这也或多或少存在于片断化分布的由少数个体组成的亚种群中(Ghazoul & Shiel 2010)。这些小种群尤其容易受到生境退化的影响，而这些种群的进一步隔离会由于数量较少而受到负面遗传效应的影响(Lowe et al. 2005)。

本研究的目的在于确定水母树由于小种群和隔离而受到遗传效应损害的程度。此外，我们研究了通过潜在的遗传拯救来提高繁殖输出从而在这些小种群中实现成功更新。我们希望对于受到人类活动的影响，种群间的基因流能够减缓由于小种群造成的影响，然而，当前的基因流由于种群衰退已不足以维持现存种群间的连通。在这种情况下，我们提出了以下几个问题：（1）水母树是否在遗传学上已受到损害？（2）剩余种群的遗传结构如何？（3）在什么情况下当前的基因流能够连通当前的种群？为了回答上述问题，我们采集了现存的4个种群中的所有成年个体以及在最大种群中的大约25%的幼树，由此确定基因流中的种子流和花粉流，同时估算历史的基因扩散。

最后，我们回答了遗传拯救是否能够在小的隔离种群中增加适合度。我们通过受控的花粉实验来确认，与种群内杂交相比，将大种群的花粉授于小种群是否能够增加诸如坐果率、结实率、萌发率以及幼苗存活率等繁育系统适合度。

材料与方法

研究的物种和种群

水母柱树（金莲木科）是一种小型的但寿命较长的树种，是塞舌尔群岛中马埃岛的特有种，以前曾为水母柱科中仅有的一种，现在被划入金莲木科(Fay et al. 1997; Bremer et al. 2009)。由于其果实形态与水母较象，所以大家普遍称之为水母树。

水母柱树通常生长在花岗岩基质的特殊生境中，在其生长的周边地区至今没有其发现的记录。水母柱树天然的片断化分布反映了岛屿植物分布的特点。自从18世纪早期人类开始在塞舌尔群岛上定居以来，许多特有的物种其种群大小不断下降。在马埃岛上许多特有物种至今保存相对完整，这可能是由于这些珍稀的特有种能够忍受干旱严酷的环境，从而使得许多特有的物种能够在这个避难所中生存下来。然而，岛屿上的一些种群由于入侵物种和火灾的影响已经基本上消失了。

现在，仅有90个水母柱树成年个体存在：78个在Bernica，7个在Sebert山，3个在Copolia，2个在Jasmin山，这些生境大约有1公倾大小（Fig. 1）。虽然这些小种群中的水母柱树也会结果，但均没有发现幼苗，而不能更新的原因至今尚不清楚。现在仅有一个地方的水母柱树能够成功更新，那就是Bernica，在那里幼苗可以在岩石表面生长。先前的研究表明，在马埃岛的另外一处地方有水母柱树存在，但是本研究的野外调查并没有发现其它的种群存在。

水母柱树的雄花和两性花在同一花序中共存，而且开花是同步的。花粉由本地的和外来的蜜蜂（主要为东非蜜蜂）、黄蜂以及苍蝇传播。在此项研究之前，对这一物种繁育系统的研究至今未见报道。每一个果实中有大约40颗小有翼的种子（2 mm 长，1 mm厚），易于进行风力传播。仅Bernica的种群能够更新可2006年采集到156棵籽苗和幼苗得到证实。采样和遗传分析

在2009年，我们从所有已知的4个种群中90个水母柱树个体中采集叶片用于DNA的提取，另外还采集了Bernica的39个幼苗。采集的叶片马上置于硅胶中进行保存。DNA采用QIAGEN DNeasy 96 Plant Kit进行提取，方法依照产品说明书。所有的样品用10个核微卫星位点(B107, C107, D12, D118, D6, B112, A9, B8a, A4, A7)进行分析，详细信息见Finger (2009)。采用ABI3730测序仪进行片段分析，Genemapper 3.5软件进行基因型分析。两两位点间没有检测到显著的连锁不平衡。因此，利用全部的10个微卫星位点作进一步的多位点分析。

遗传多样性和近交的估算

采用MICRO-CHECKER (V an Oosterhout et al. 2004)程度检测存在的无效等位基因(Selkoe & Toonen 2006)。等位基因数(NA)，有效等位基因数(NE)，等位基因频率以及特有等位基因数(PA)采用GenAlEx 6 (Peakall & Smouse 2006)进行计算。利用FSTA T 2.9.3.2 (Goudet 1995)计算等位基因丰富度(RS)。连锁不平衡、观测杂合度和期望杂合度(HO, HE)以及近交系数(FIS)采用Arlequin 3.5 (Excoffier et al. 2005)进行计算。由于本研究是对全部的个体进行采样，所以不存在种群间比较时的采样误差(Leberg 2002)。对NE, HO, HE, RS的方差分析应用R语言 2.10.1版本(R Development Core Team 2010)进行。

物种遗传结构的估算

总的FST值利用Arlequin 3.5进行计算。采用FSTA T计算种群间遗传分化的两两之间的FST值。为了检测所有现存地理种群间的关系，我们对所有个体采用STRUCTURE (Pritchard et al. 2000)软件进行Bayesian聚类分析。计算共运行100次，10个聚类每个进行10次(K1 to K10)。对于每一次运行，burn-in和simulation length分别为150 000和500 000。由于K值在其它研究中有所不同，所以本研究计算ΔK值(Evanno et al. 2005)。计算公式为：ΔK = ([mL(K + 1) ) 2 mL(K) + mL(K ) 1)])/SDL(K)，L(K)为对数值，K为矫正的聚类数，m为平均值，SD为标准差。

估算种群内的空间遗传结构和个体间的关联度

在最大种群(Bernica)中，利用Mantel检验和SPAGEDI 1.3 (Hardy & V ekemans 2002)计算空间遗传结构，检验空间距离和多位点同源关系(F)无相关性的零假设。为了形象的表示FSGS (小尺度空间遗传结构)的结果，F值共设计了15个距离等级。距离等级的范围为：从0–10 m到200–280 m，10-m间隔于0–100 m, 20-m间隔于100–140 m, 30-m间隔于140–200 ，180-m间隔于200–280。同时也计算所有种群中所有成年个体中位点间的关联系数F(Loiselle et al. 1995)以及估算每一个种群的平均关联系数值。

利用亲本分析估算基因流

通过对39个幼苗的多位点(10 loci)基因型分析，利用CERVUS 3.0对全部的90个成年植株进行最大似然法排除分析，由此确定两个最可能的亲本(Marshall et al. 1998; Kalinowski et al. 2007)。采用所有成年植株的等位基因频率进行父本分析，相关的设置如下：10000次循环；最小位点数设为5，双亲未知；所有的成年个体都设为幼苗的候选双亲；1%的可能位点错配率，以及87%的位点基因型比例。候选双亲的比例设为99%，这是在我们认为所有已知个体的基因型都知道的前提下。LOD分值标准设定为95%和80%。花粉的扩散距离的

推测根据每一棵幼苗最大可能双亲之间的距离。种子扩散距离的计算为幼苗到它们关系最近亲本的距离(Dow & Ashley 1998; Bacles et al. 2006; Nakanishi et al. 2009)，这是基于种子扩散距离要小于花粉扩散距离的假设。为了比较，我们也计算了种子扩散距离中到最远母树的距离。

通过花粉实验的遗传拯救证据

为了检测种群间花粉扩散对适合度的影响，我们应当对所有现存种群间进行间实验。然而，种群开花是不同步的，同时选址和树的位置受到限制，我们的实验只能选择一个较为容易的种群。在2009年，在Sebert山的种群中的3个个体中，我们选择了5–10个花序，每个花序中有10–30朵花用于花粉实验。在两棵树上(1-005 and 1-007)，每棵树用了10个花粉袋，在第三棵树上(1-006)用4个花粉袋。在每一个袋中进行4种处理：（1）自交，所用的花粉来自于同一棵树的花中；（2）种群内的杂交，所用的花粉来自于Sebert山的另外一棵植株；（3）种群间杂交，采用来自于Bernica的4到5棵树上的混合花粉；（4）未经人工处理（没有授粉）。作为控制，我们决定将未经人工处理的花置于花粉袋之外，因此可接受传粉者的授粉。花粉的转移刷取雌雄同体植株中雄花的花柱。不同处理的花进行单独标记。总计有466朵花用于种群间、种群内以及自交处理的授粉，795朵没有授粉，从2棵树上采集了23个果实用于受控实验。花粉袋一直保留至果实成熟采集。将成熟的种子分为可育的（成型并饱满）或者是不可育的（成型但是空的）。为了确定每一个授粉处理的适合度值，我们记录了坐果率（受处理的花发育成果实的比例）、可育种子数（可育的种子占所有成型种子的比例）以及产种率（可育的种子占胚珠数量的比例）。

可发育种子最后播种在马埃岛的生物多样性培育中心，记录萌发数。总计播种5218颗种子：18颗来自于自交处理，1780颗来自于种群内杂交，2296颗来自于种群间杂交，391颗来自于未授粉处理，733颗来自于对照。种子的萌发在未经施肥的土壤中进行。我们采用托盘进行种子的萌发实验，当幼苗高度至少达2cm时再重新进行移栽。记录萌发日期和死亡日期用于计算种子存活率。

确认花粉处理与亲本分析

在野外的花粉实验中，非计划中的花粉转移可能会导致一定程度的污染。为了定量污染的程度，确定我们的处理对遗传拯救的作用，我们对所有经授粉处理后萌发的幼苗进行基因型分析和父系比对。我们利用CERVUS 3.0进行最大似然法分析，将所有成年个体作为候选者并给出确定的母本，从而确定最有可能的父本。我们通过父本分析的遗传矫正处理作为分析遗传拯救的基础。

数据分析

花粉实验的数据分析在R, version 2.10.1 (R Development Core Team 2010)中进行。我们采用一般的线性混合效应模型(GLMM)中的二项式误差分布来分析坐果率和结实率。GLMM 可用于巢式实验设计，其中包括了我们在树上授粉包在内的随机效应(Bolker et al. 2009)。我们采用来自于lme4包的lmer功能(Bates 2005)。由于每一棵树上花和果实的数量不同，结实率的数据也是不平衡的。我们采用cbind功能对不平衡的数据进行稳健的分析(Bolker et al. 2009)，由此根据采样大小来计算坐果率和结实率。我们采用两种模型：处理上具有固定影响的主效应模型确定自交的水平，完整模型的处理（仅种群内和种群间杂交）以及Tree ID 作为固定效应来看待遗传拯救的问题。模型的选择是基于Akaike Information Criterion (AIC)，同时最小的AIC值决定最小的可适用模型。经过分析，我们决定种子从自交和无花粉处理中的移除，以此增加我们模型的可信度，同时我们主要的兴趣在于种群内和种群间杂交的比较。

由于只有从2棵树上采下来的23个果实可用于控制实验组，我们对23个果实的结实率进行了随机取样，不将其放回，同时根据辅助程序重复取样10000次(Efron & Tibshirani 1998）。受控果实的结实率与辅助程序的平均值和由此估算的两个处理的置信区间进行比较。

苗圃中种子萌发的存活率和幼苗的基因型的计算采用R进行(R Development Core Team 2010)。我们采用核查后的数据，1代表幼苗在萌发过程中死亡，0代表在整个实验过程一直存活。采用Weibull存活回归参数（表示随着年龄降低的死亡风险）。

结果

遗传多样性与近交

在物种水平，10个位点共得到2到15个等位基因，共得到86个等位基因。所有位点和种群的遗传多样性比较见表1。总体来说没有检测到显著的近交(FIS)(0.014, P = 0.316)。HE 值的范围从Jasmin山种群的0.26 (±0.09 SE)到Bernica种群的0.63 (±0.05 SE)。基于两个二倍体的个体，等位基因丰富度的范围从Jasmin山种群的1.70 (±0.26 SE)到Copolia的2.73 (±0.13 SE)。Bernica具有最大的等位基因多样性和最高的特有等位基因数(20)。

遗传分化

总体的FST值为0.15 (P < 0001)，表明15%总的分子变异存在于种群间，85%存在于种

群内。绝大多数种群两两之间的遗传距离(Nei 1978)值差异极显著（表2），地理距离最远的Sebert和Jasmin种群间遗传距离较大(0.36, P = 0.058; 13.5 km），而地理距离较近的Bernica 和Copolia遗传距离较小(0.10, P = 0.008; 2.5 km)。STRUCTURE分析显示有4或5个独立的遗传聚类，其中K4和K5为Bernica中的亚结构。这一分析也区别出其它的3个种群，这与当前的地理结构是相一致的。

种群内的小尺度空间遗传结构和同源关系

Bernica的成年植株中检测到显著的小尺度空间遗传结构(FSGS)(Fig. 2)，表明空间距离与同源关系具有显著的关系。在50 m的等级范围内，同源系数(F)与0差异显著(P < 0.001)。Bernica中所有个体的个体间同源系数的平均值与0差异不显著(F = 0.004 ±0.002 SE)。在Copolia，个体间同源系数较高(F = 0.17 ±0.047 SE)，但更高的值出现在Sebert(F = 0.41 ±0.029SE; 21 pairs)和Jasmin(F = 0.57; 1 pair)种群中(Fig. 2)。

当前的花粉和种子扩散

利用亲子关系鉴定，我们可以在95%的置信区间上区分出所采集的39个幼苗。现实的花粉扩散距离介于2.9 m到207 m，其中将近一半的幼苗低于25 m(Fig. 3a)。假定最近的亲本总是母树的话，Bernica中81.6%的幼苗出现在母树周围的50 m内，总体扩散距离为36.5 m。甚至假定最远的亲本为母树的话，所有幼苗中的76%出现在100 m 范围内(Fig. 3b)。

利用花粉实验的遗传拯救

结果率和结种率

种群间杂交的结果率(0.86 ±0.06 SE)要显著高于种群内的杂交(0.72 ±0.09 SE; z = -1.93, P= 0.05)。自交和未经花粉处理的结果率较低(分别为0.16 ±0.07 SE and 0.10 ±0.03 SE)。

结种率包括种群间杂交(0.37 ±0.02 SE)和种群内杂交(0.32 ±0.02 SE)，虽然种群内杂交中有1棵树的结种率较低，容易在比较中产生混淆，但两者差异不显著(z = -1.61, P = 0.10)。种群间杂交和种群内杂交的平均结种率与接受花粉的受控组差异不显著(受控组: 0.46; 种群间杂交: 0.44, bootstrapped 95% CI 0.35–0.52;种群内杂交: 0.48; bootstrapped 95% CI0.40–0.55)。自交和未经花粉处理的结种率较低(分别为0.003 ±0.001 SE and 0.01 ±0.01 SE)。

在所有植株中，种群间杂交中可发育的种子所占比例（为成熟种子中的一部分）较高(0.77 ±0.03 SE)，其显著高于种群内杂交(0.52 ±0.03 SE)(z = -10.7, P < 0.0001; Table S1)。与结种率不同，不同处理的相互间作用效果差异不显著。受控组的平均可发育的种子也比种群间杂交的低(受控组: 0.79; 种群间杂交: 0.92, bootstrapped 95% CI 0.86–0.96)，与种群内杂交接

近(受控组: 0.79; 种群内杂交: 0.77; bootstrapped 95% CI 0.72–0.83)。自交的和无花粉处理的可发育的种子率较低（分别为0.03 ±0.01 SE和0.07 ±0.01 SE）。

发芽和存活率

在Sebert采集的全部种子发芽率较低。种群间杂交的种子(49棵幼苗, 2%发芽率)和种群内杂交(32棵幼苗, 2%发芽率)具有较低的发芽率，其概率低于自交处理的种子(4棵幼苗, 22%; P < 0.001)，虽然自交所得到的种子数较少。种子萌发后的平均存活时间分别为：种群间杂交190 ±18.5 SE，种群内杂交155 ±14.8 SE，自交处理101 ±60.1 SE，只有种群间杂交和种群内杂交间的差异显著(种群间杂交和种群内杂交: z = -1.95, P = 0.05; 种群间杂交和自交: z = -1.71, P = 0.09, 种群内杂交和自交z = -0.82, P = 0.41)。无花粉处理的果实和受控组的种子均没有萌发。

讨论

本研究为遗传侵蚀和近交导致处于种群隔离和基因流受限的珍稀树种增加了灭绝的风险提供了证据，尽管其在自然状态下处于片断分布。我们的结果表明，遗传拯救可以缓和这些影响，使得基因流受限的受威胁树种后代的生存能力增加。

水母柱树是否存在遗传衰退

水母柱树3个小种群具有较高水平的遗传多样性，表明尽管这些种群规模较小且处于隔离状态，但这些种群对于保护物种的遗传多样性非常重要(也可见Schneller & Holderegger 1996)。这可能是类似隔离和濒危物种的一般特征，如同水母柱树成年种群间的遗传多样性格局，处于自然隔离、稀少、热带、特有的岛屿树种(Dutech et al. 2004; Ueno et al. 2005; Kettle et al. 2007; Born et al. 2008; Sebbenn et al. 2011)。相似的结果在温带植物中也可见到。例如，地中海Minorcan栓皮栎仅存67个个体，但其遗传多样性较高(Lorenzo et al. 2009)。较高的遗传多样性也可保留在曾经广泛分布但在近期种群快速减少和片断化的物种中(Yao et al. 2007)。类似的，如来自于非洲Madagascar的稀少的棕榈树（如Beccariophoenix madagascariensis），尽管由于人类活动导致其种群减少和片断化，但其仍保留着较高的遗传多样性(Shapcott et al. 2007)。与此相反，也门山谷中处于自然片断化但快速减少的棕榈树却观测到较低水平的遗传多样性(Shapcott et al. 2009)。

水母柱树3个种群具有较高的遗传多样性表明，这些种群没有经历持续的遗传瓶颈和随

机遗传漂变。然而，Bernica种群中幼苗和成体间的遗传多样性比较表明，成体中的稀有的等位基因在幼苗中是不存在的（Table S2)。连同在最小种群(Mt. Jasmin)中具有较低的遗传多样性表明，种群有正在经历早期的遗传侵蚀征兆。Copolia和Sebert的成年种群必需具有和当前Bernica成年种群相近的规模才能够维持观测到的等位基因丰富度。这表明，种群规模的减少已在最后一代的成年个体中出现。

虽然本文所用的核微卫星位点不能评估整体的适应能力或者局部的适应能力，我们的结果为这一进程（遗传漂变和近交）提供了早期的警告，这可能导致适应能力的降低进而影响物种长期的生存能力(Reed & Frankham 2003)。利用中性的遗传标记评估遗传多样性和基因流连同花粉实验能够使我们将后代的生存能力与种群间的基因流联系在一起。近年来保护基因组学的进展可以让我们更具体的检测诸如水母柱树那样受威胁树种的适应特性(Ekblom & Galindo 2010; Ouborg et al. 2010; Tautz et al. 2010)。结合常规的栽培实验和后代特性，这些信息可以帮助这些寿命较长的植物与遗传拯救和子代迁移关联用于评估当地适应和远交衰退。然而，在短期内，这一研究表明了立即对现存成年种群采取保护措施的必要性。

残留的种群具有遗传结构吗？

水母柱树仅局限分布于4个隔离的种群中，这些种群间至少相隔2.4 km。水母柱树种群间观测到显著的遗传分化，这与观测到的这些种群间历史的基因流受限是一致的。除距离隔离外，马埃岛的地势，种群内和种群间开花不同步的特征（这可以进一步的减少种群的有效规模），同时其授粉者与其它植物存在竞争（特别是一些开花丰富的外来物种），这也可能与水母柱树种群的遗传隔离有关。

遗传亚结构显示Bernica种群中也存在明显的繁殖隔离。昆虫传粉和风媒散播种子被认为可以促进基因的远距离扩散(Dick et al. 2003; Lander et al. 2010)，但是Bernica种群中较强的小尺度空间遗传结构和野生幼苗与双亲间较短的距离表明，对于水母柱树事实并非如此。对此的解释可能是由于孤岛的地形限制了通过花粉和种子进行的基因流。因此最大的种群(Bernica)主要在孤岛中围绕凸起的山峰各个侧面分布，种子和花粉可能不能有效的从一侧扩散至另一侧。由当地地形导致的隔离可能由此而成为基因流的障碍，从而导致在小种群中的遗传聚集，进而增加了近交。

当前的基因流应达到什么程度可以连通残留种群

对野生幼苗的亲本分析表明，Bernica的花粉和种子扩散的现实基因流较低。繁殖个体间的最远距离为280 m，花粉扩散的最大距离为207 m，虽然85%的花粉扩散事件均小于100 m。种子扩散也受到相同的限制，在假设母树为两个亲本中距离采样幼苗较近的前提下，绝大多

数的种子扩散距离小于50 m。如此受限的基因流，加上观测到的种群遗传亚结构，表明当前基因流在岛屿之间是不存在的。

同源关系分析表明，3个小种群中成年个体的相关性大于Bernica种群中相同的的空间范围(2–200 m)。在Jasmin种群，残留的2棵树具有较高的同源系数(F = 0.57)，这远大于完全亲缘关系的期望值(F = 0.25)。这一较高的同源系数可能来源于相关亲本间连续的交配，表明是一个历史上的近亲交配种群。即便在Sebert山，每棵树之间的相距较远（相互间约隔200 m），其关联性还是较高(F = 0.31)，这些残存成年植株间的杂交可以导致进一步的近交而产生近交衰退。

遗传拯救能否在一个小的隔离的种群中增加适合度

水母柱树种群间的人工异花授粉增加了可发育种子的比例，同时种群间的杂交(190.7 days ±18.5 SE)比种群内的杂交(155.5 days ±14.8 SE)具有更高的幼苗存活率。种群间的杂交较高的可发育种子的比例和幼苗存活率表明，种群间授粉对适合度有利。这种收益并没有在岛内受限的野生种群间通过基因流实现。我们的结果揭示了通过人工异花授粉的遗传拯救可以成功的增加可育种子的产量。为此，不仅要鼓励重建，当然这在当前的种群还没有实施，还应当给这些种群提供特有等位基因用于保护。此外，我们的结果也表明，较低的基因流和种群隔离会使具有较小规模的种群的物种后代生活力受到严重影响。因此，维持连续的生境和种群间的遗传联系是稀有树种在制定保护管理时最为重要的策略。

较小种群中缺乏幼苗更新的另一种解释是授粉者受到限制。这与我们没有检测到受控组和种群内杂交的结种率或者可育种子存在显著差异不符。不同步开花也会使繁殖受限，因而会限制交叉花粉的资源，这可能在小种群中由于开花的个体较少而表现的更为明显。然而，结种率在受控组和种群内杂交以及种群间杂交授粉时没有差异，表明授粉本身并不是一个限制因素。相反，种群杂交授粉得到较高的可育种子产量表明更新受限更可能是由于花粉的质量而不是花粉的数量导致的。

我们的结果证明，通过种群间人工异花授粉的遗传拯救对于水母柱树是可行的，这可能是一种对其他3个更小的种群比较种群内杂交更好的生态和遗传拯救的思路。然而，遗传拯救也应当考虑到，在种群中引入新的等位基因可能会破坏敏感种群中所逐渐形成的对当地环境环境的适应性，甚至可能在后续的生活史阶段表现出远交衰退(Edmands 1999; Tallmon et al. 2004)和遗传覆没(Hufford & Mazer 2003)。然而，对于孤岛的生境而言，地质相近，都在250 m海拔之内，每个之间相隔15 km之内，环境条件的差异很小，因此通过破坏对当性的适应性的远交衰退发生的可能性很小，当然也不能排除这种可能性。即便如此，当种群处于

濒危灭绝时，仅有少量的几个个体残存，遗传拯救和人工异花授粉为一起保护多个具有独特遗传多样的种群提供了唯一的方法。

有一点需要指出的是，结种率与结实率和可育种子产量不同，它在种群间杂交和种群内杂交时是没有差异的。这种缺乏差异是一个真实的结果，我们也必须认识到种群间杂交包含了孤岛间的基因交流，可能导致比种群内杂交减小了可用的花粉。此外，总的萌发率较低表明苗圃的条件可能不理想。水母柱树很难在苗圃的条件中维持，同时萌发率较低也有可能是其内在的其它生物学原因导致的。

保护和管理的应用

4个水母柱树种群中有3个种群中的个体数小于10个，因而容易受到诸如风暴、干旱、火灾或者疾病的影响。外来入侵植物的持续扩散已开始进入岛屿生境中(Kaiser-Bunbury et al. 2011)，这可能会导致物中间竞争传粉者而进一步降低繁殖成功率(Ghazoul 2004)。对于许多濒危植物而言的种子库，对于水母柱树并不是一种可行的保护策略，这是因为其种子在经过几个月的保存后发育能力会显著下降。我们的结果表明，水母柱树本身的种子发育能力、萌发成功率以及幼苗存活率是较低的（可能是由于遗传的原因），同时外界的其它因素（如存储等）会进一步降低种子的发育能力，从而会对物种的保护带来不利的影响。

我们建议通过在苗圃中萌发种子来建立幼苗种群从而起到保护的作用。3个已完全丧失更新能力的小种群需要迫切采取保护行动以维持其包含的特有的遗传多样性。小种群中的自然更新已经确定不可能存在了，部分原因在于成年个体的关系较近，对这些种群的拯救应当利用来自Bernica个体的花粉进行人工花粉杂交。通过遗传拯救观测到适合度的增加为这些种群确保有长期的生存力提供了保障，从而使该物种成为一个整体。如果没有这样的行动，可能会在若干年内或者几十年内，水母柱树只能在Bernica种群中存在了，同时这个物种大量的遗传变异将会丢失。

我们的结果证明，潜在的遗传拯救可用于受威胁的寿命较长树物的就地和迁地保护。受控的花粉和幼苗移植可用于增加小种群中的个体数量，从而增加迁地保护的遗传资源。本研究强调了受威胁树种个体间和种群间维持基因流的重要性，特别是通过花粉扩散的重要性。在其它具有受限花粉扩散的受威胁树种和具有较高关联度的残存种群中，不论其是否是最近处于片断化生境的热带物种(Collevatti et al. 2010; Eckert et al. 2010; Collevatti & Hay 2011)还是处于长期片断化下的温带物种(Dubreuil et al. 2010)，遗传拯救可能是唯一能够阻止种群甚至物种灭绝的方式。