毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
菌体的准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；
2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；
3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬
5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；
备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
?KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的
?对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?
菌种保存：
挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存
（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O 重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：
1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀
2)-20℃20分钟沉淀
3)13200rpm，20min，离心后弃上清
4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清
5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
6)20ul ddH2O重溶）
电击转化：
8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；
9. 将电转化杯冰浴5min；
10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；
11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）
12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。
推荐：电压1.5kV ；电容25μF ；电阻200 Ω。电击时间为4 ～10msec。
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用
做pcr的模板了
3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。
3. 用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，
利用5’AOX 1和3’AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichia pastoris基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kb（KM71为3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。) Each 50 μl aliquot of competent Pichia cells with 3 μg linearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium.
Muts 表型重组酵母的诱导表达实验
As a general rule when inducing expression, never allow cultures to be more than 10-30% of your total flask volume.
1. 挑选一单菌落，置于装有50ml MGY、BMG 或BMGY培养基的500ml 摇瓶中，于28-30°C /250-300 rpm 培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；
2. 室温下1500~3000g 离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM, BMM或BMMY重悬菌体（约2.5~5ml ）；
3. 将步骤2 所得的菌液置于100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30 °C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；
4. 每24h 向培养基中添加100 ％甲醇至终浓度为0.5 ～1.0%；
5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP 管中，最大转速离心2~3min ，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0 、24、48、72、96和120h；
6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80 °C 保存备用；
7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；
2. 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100~200ml）；
3. 将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续生长；
4. 每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；
6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；
7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。
2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10-1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。
通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
Mut+/Mut s的筛选
用Sac I，Sal I or Stu I 线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Mut s的转化子存在（见Invitrogen protocol p36），Not I or Bgl II线性化插入AOX I 位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Mut s。
Use the plates containing the His+ transformants and screen for the Mut+ and MutS phenotype as described below.
1. Using a sterile toothpick, pick one colony and streak or patch one His+ transformant in a regular pattern on both an MM plate and an MD plate, making sure to patch the MM plate first.
2. Use a new toothpick for each transformant and continue until 100 transformants have been patched (2-3 plates).
3. To differentiate Mut+ from MutS, make one patch for each of the controls (GS115/His+ MutS Albumin and GS115/His+ Mut+ β -gal) onto the MD and MM plates.
4. Incubate the plates at 30°C for 2 days.
5. After 2 days or longer at 30°C, score the plates. Mut+ transformants will grow well on both MD and MM plates. MutS transformants will grow well on MD plates, but show little or no growth on the MM plates.
We recommend purifying your His+ transformants to ensure isolation of a pure clonal isolates. You may do this before or after testing for the Mut phenotype.
Replica-Plating Procedure
This procedure gives a lower rate of misclassifications, but it increases the overall Mut+/MutS screening procedure by 2 days. You will need equipment to replica-plate.
1. Using sterile toothpicks, patch 100 His+ transformant on MD plates (2-3 plates). For controls, make one patch from each of the strains GS115/His+ MutS Albumin and G S115/His+ Mut+β -gal onto the MD plates.
2. Incubate the plates at 28-30°C for 2 days.
3. After 2 days, replica-plate the patches from the MD plates onto fresh MM and MD plates to screen for MutS transformants.
4. Incubate the replica plates at 28-30°C for 2 days.
5. After 2 days at 28-30°C, score the replica plates. Look for patches that grow normally on the MD replica plates but show little or no growth on the MM replica plates. Including His+ Mut+ and His+ MutS control patches on each plate will provide examples of Mut+ and MutS phenotypes.
Screening by Functional Assay
Some researchers have used a functional assay to directly screen for high expressing Pichia recombinant clones without first screening for MutS or Mut+ phenotypes. If you elect to screen directly for high-expressing recombinants, be sure to also check the Mut phenotype. This will help you optimize expression of your recombinant clone.
毕赤酵母基因组提取方法
⑴接种重组和空质粒转化子于5ml YPD+k抗生素培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。
⑵室温下，1500 g离心5-10min收集菌体
⑶100 ul TE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
⑷10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。
⑸200ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。
⑹加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；
⑺10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；
⑻干燥后，加入15 μl的TE或H2O溶解，-20℃备用。
重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。
Pichia 菌落PCR 破壁方法（史飞）：
30 ul培养液，0.2% SDS
Votex 15 sec
离心1min
取上清，稀释5-10倍
用于PCR模板
GS115的鉴定方法
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变
毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4 ℃保存。
34g 酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g 硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌，或134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过虑除菌or 115℃15-20 min灭菌。
注意毕赤酵母在高浓度YNB 下生长更好，所用YNB 的量是酿酒酵母中的两倍。
500*B（0.02%生物素Biotin）20mg的生物素溶于100ml 水中，水浴加热溶解，温度不能高于50度。过滤除菌。4℃保存保存期为1 年。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitamin H。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素），所以肯定要加的。
100*H（0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1 年。400mg 的L-组氨酸溶于100ml 水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D（20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1 年。200g 葡萄糖溶于1000ml 水中，115℃灭菌15-20min 或过滤除菌。
10*M（5%Methanol 甲醇）保存期为2 个月。将5ml 的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY（10%Glycerol 甘油）保存期为1 年以上。将100ml 甘油和900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA（0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1 年。分别将500mg 的L- 谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L- 异亮氨酸溶于100ml 水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L 的K 2HPO 4溶液132ml 与1mol/L 的KH2PO4溶液868ml 混匀，其pH 为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1M 山梨醇
毕赤酵母表达的培养基配制
2.1 LB （Luria－Bertani）培养基：
Trypton l％
Yeast Extract 0.5 ％
NaCl l ％
PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。
2.2 LLB（Low Salt LB ）培养基：
Trypton l ％
Yeast Extract 0.5 ％
NaCl 0.5 ％
PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min 。可于室温保存数月。
2.3 YPD 完全培养基（又称YEPD ）（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/ 胰蛋白胨/ 右旋葡萄糖培养基）
Yeast extract 1% 10g/L
Trypton 2% 20g/L
dextrose (D glucose) 2% 20g/L
+agar 2% 20g/L
液体YPD 培养基可常温保存；琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
YPD 或YEPD：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基.
YPD培养基配制方法：
1.溶解10gYeast Extract(酵母膏), 20gPeptone(蛋白胨)于900ml水中，如制平板加20g琼脂粉
2.高压121度20min
3.加入100ml 20% （10X，共20g）的Dextrose (glucose)(葡萄糖)，(葡糖糖溶液灭菌后加入)
注：葡萄糖，yeast extract ,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15-20min灭菌。YPD培养基用途：用于酵母菌的培养，及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。YPEG：除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD;YPDZ 是在YPD 的基础上加上ZEOCIN抗生素;YPDA 是在YPD的基础上加0.003%的腺嘌呤硫酸盐。
2.4 MD 与MDH 选择培养基
Minimal Dextrose Medium + （Histidine ）最小葡萄糖培养基+（0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；；4X10-5% 生物素；2%葡萄糖）
1.灭菌800ml 的ddwater，冷却到60℃左右，加入
2ml 的500*B，
100ml 的10*YNB
100ml 的10*D 母液，4 ℃保存
2. 如配制MDH ，可在上述的MD中加入10ml的100*H 即可，4 ℃保存；
3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15g的琼脂。4 ℃可保存数月。
2.5 MM 和MMH培养基
Minimal Methanol Medium + （Histidine ）（含有：1.34%YNB；4X10-5% 生物素；0.5%甲醇）1.灭菌800ml 的ddwater，冷却到60℃左右，加入
2ml 的500*B，
100ml 的10*YNB
100ml 的10*M，4 ℃保存
2. 如配制MMH ，可在上述的MM中加入10ml的100*H 即可，4 ℃保存；
3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15g的琼脂。4 ℃可保存数月。
MM or MD是筛选mutS和mut+表型的。
2.6 BMG和BMM培养基
Buffered Minimal Glycerol，Buffered Minimal Methanol （含有100mM potassium phosphate pH 6.0, 1.34%YNB；4X10-5% 生物素1% glycerol or 0.5% methanol）
1.灭菌700ml 的ddwater，冷却到室温，加入
2ml 的500*B，
100ml 的10*YNB
100 ml的1M potassium phosphate buffer
100ml 的10*GY，4 ℃保存
2.如配制MMH ，可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml 的10*GY即可，4 ℃
保存，可保存2个月。
2.7 BMGY 和BMMY
Buffered Glycerol complex Medium, Buffered Methanol complex Medium (含有1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate pH 6.0, 1.34%YNB；4X10-5% 生物素1% glycerol or
0.5% methanol)
1.溶解10g 的yeast extract （1%），20g peptone（2%）在700ml 的ddwater，灭菌
2.冷却到室温，加入
2ml 的500*B，
100ml 的10*YNB
100 ml的1M potassium phosphate buffer
100ml 的10*GY，4 ℃保存
3.如配制BMMY ，可在上述的BMGY中用100ml的10*M取代100ml 的10*GY即可，4 ℃
保存，可保存2个月。
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
You will need either BMGY/BMMY (buffered complex glycerol or methanol medium), BMG/BMM (buffered minimal glycerol or methanol medium) or MGY/MM (minimal glycerol or minimal methanol medium) for expression. BMG, BMM, BMGY, and BMMY are usually used for the expression of secreted proteins, particularly if pH is important for the activity of your protein.
Unlike MGY and MM, they are all buffered media. Because these media are buffered with phosphate buffer, a wide range of pH values may be used to optimize production of your protein. BMGY/BMMY contain yeast extract and peptone which may help stabilize secreted proteins and prevent or decrease proteolysis of secreted proteins. Inclusion of yeast extract and peptone act as a "mixed feed" allowing better growth and biomass accumulation.
2.8 YPDS培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose sorbitol Medium酵母浸出粉/ 胰蛋白胨/ 右旋葡萄糖培养基/山梨醇）：山梨醇:稳定的渗透压，在电击过程中保护宿主细胞, 改变细胞膜的通透性
yeast extract 1%
peptone 2%
dextrose (glucose) 2%
sorbitol 1 M
+agar 2%
不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + G418培养基，必须存放4℃条件下，有效期1 ～2 周。
2.9 MGY
Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1% 甘油；4*10-5%生物素）。将800ml 灭菌水、100ml 的10*YNB 母液、2ml 的500*B 母液和100ml 的10*GY 母液混匀即可，4 ℃保存，保存期为2 个月。
2.10 MGYH
Minimal Glycerol Medium + Histidine（最小甘油培养基+ 0.004% 组氨酸）在1000ml 的MGY 培养基中加入10ml 的100*H 母液混匀，4℃保存，保存期为2 个月。
2.11 RDB 转化培养基(酵母原生质体转化用)
Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5% 生物素；0.005%AA氨基酸）
1. 将186g的山梨醇定容至700ml ，高压灭菌；
2. 冷却后于45℃水浴；
3. 将100ml 的10*D 、100ml 的10*YNB；2ml 的500*B；10ml的100*AA 等母液和88ml 无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。4 ℃保存。
2.12 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (酵母原生质体转化用) （葡萄糖再生培养基+ 0.004% 组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H 母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4 ℃保存。
2.9 RDB 及RDH平板的制备(酵母原生质体转化用)
1. 将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml ，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml 的10*D、100ml 的10*YNB；2ml 的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H 母液）和88 （78 ）ml无菌水混匀，预热至45 ℃后，与步骤1 的山梨醇/ 琼脂液混匀；
3. 迅速制备平板。4 ℃可保存数月。
2.13 RD 及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）(酵母原生质体转化用)
1.将186g的山梨醇和7.5~10g 琼脂粉定容至700ml ，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2.参照RD/RDH 液体培养基配制的步骤4，将100ml 的10*D、100ml 的10*YNB ；2ml 的500*B；10ml的100*AA 等母液、（10ml的100*H 母液）和88 （78）ml 无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1 的山梨醇/ 琼脂液混匀；
3.将该TOP 琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。
Pichia yeast culture details
The growth temperature of Pichia pastoris is 28-30°C for liquid cultures, plates, and slants. Growth above 32°C during induction can be detrimental to protein expression and can even lead to cell death. Other important facts: Doubling time of log phase Mut+ or MutSPichia in YPD is ~2 hours
?Mut+ and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol
?Doubling time of log phase Mut+ Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
?Doubling time of log phase MutS Pichia in MM is ~18 hours
?One OD600 = ~5 x 107 cells/ml
Note: Growth characteristics may vary depending on the recombinant strain.
To store cells for weeks to months, use YPD medium or YPD agar slants (see page 55).
?Streak for single colonies of GS115, KM71, or a His+ transformant on YPD.
?Transfer one colony to a YPD stab and grow for 2 days at 30°C.
?The cells can be stored on YPD for several weeks at +4°C.
To store cells for months to years, store frozen at -80°C.
?Culture a single colony of GS115, KM71, or a His+ transformant overnight in YPD.
?Harvest the cells and suspend in YPD containing 15% glycerol at a final OD600 of 50-100 (approximately 2.5-5.0 x 109 cells/ml).
?Cells are frozen in liquid nitrogen or a dry ice/ethanol bath and then stored at -80°C.
After long-term storage at +4°C or -80°C, we recommend checking the His+ transformants
for correct genotype and viability. Streak on MM, MD or MGY plates before using again.
TCA沉淀方法；
培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳。表达上清很少有直接考染能看得到条带的，1ml表达上清浓缩到20ul直接电泳。一般表达量大于1mg/ml 可以看到明显条带，但重复性不好。
具体步骤：
0. make 100% (M/V)TCA:454 ml H2O/Kg TCA, maintain in dark bottle at 4 oC, Be careful, use gloves!
1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。
2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA (Trichloroacetic acid)，颠倒10次混匀。
3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。
4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还
残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。
6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。
7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。
8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个
操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。
或者第5步和第6步改为丙酮洗:
5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.)
样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用Loading buffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解，很可能是TCA没有除干净。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比较少，一般用丙酮洗一步后很好溶。
胞内蛋白：
反复冻融多次，然后15000 rpm 离心4度即可
ELISA protocol；原位双膜法快速检测阳性表达株
用BMMY培养基一般表达1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测
1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。
3.加封闭液（TPBS加1％脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。
4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision 的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。
5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS 洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag 抗体，不加二抗直接显色。
6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。
7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。
TCA沉淀考染看不到条带，可以打算作ELISA，但可能上清里面杂蛋白太多，抗原（目的蛋白）不可能包被到板子上，所以几乎不可能检测到的。他们建议作点杂交，就是把少许上清点到PVDF膜上，以后就按照western blot 就可以了。ELISA使用多抗，意义不是很大，因为确实阴性对照也显色，和阳性结果差不了太多，特别是蛋白表达水平不高的话，两者区别很不明显，一抗是自己制备的多抗,空白值在0.2左右,阴性对照(即空白宿主自身表达的上清)OD 值大约在0.35-0.4之间,目的蛋白测的值却在0.6-0.65.可见效果还是比较明显的.因为是多抗阴性对照难免会对结果产生影响.没有单抗也只能这样了.
原位双膜法快速检测阳性表达株：
1 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡, 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.
2在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜, 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His 平板上, 4 ℃保存
3 将硝酸纤维素薄膜取下, 6 %小牛血清37 ℃封闭2 h , TBS-T ( Tris-NaCl 缓冲液加0105 %吐温20) 洗3 次( 每次10 min) . 加一抗室温孵育2 h , TBS－T 洗膜3 次. 然后二抗室温孵育2 h , TBS2T 洗膜3 次. 最后显色。
在强弱不等的颜色中挑选染色最强的克隆，做诱导表达进一步验证。操作时，一定要记好位置，以免不能将膜上的克隆和板上的克隆对上。
以后的步骤就基本上是做western，所以用硝酸纤维素膜通过虹吸将醋酸纤维素膜上的菌落分泌的液体转到硝酸膜上，相当于western的转膜过程。
蛋白降解
分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.
2）、The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation. The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.
毕赤酵母表达实验手册
xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：
配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）
毕赤酵母化学转化
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
毕赤酵母表达系统研究进展
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
2021年毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达系统 欧阳光明（2021.03.07） Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
https://www.360docs.net/doc/e516438125.html, GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞 组成规格： 货号名称规格数量 GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支 GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支 GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支 为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求，华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。 毕赤酵母感受态细胞试剂盒 1 介绍 本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞，需-70度低温保存；Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂，均为无菌，需-20度保存，使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态，有别于传统山梨醇制备的感受态细胞，并配有Solution 1和Solution 2，可直接用于热击法转化，而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法，也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA，经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。 2 转化步骤 2.1 线性化质粒片段的制备 取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中（保证有100μg的质粒片段）。 2.2 转化 2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中，以获得最大转化率；（注意加入至冻结的细胞中，而不是解冻的细胞中）； 2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 2.2. 3. 取出离心管，加入1.5ml Solution 1，彻底混匀；(注意可以弹或移液器轻轻混合，不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ； 2.2.4. 30℃水浴孵育1h； 2.2.5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中； 2.2.6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中； 2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板（例如MD板），于30℃孵育3～4天后，鉴定；
酵母转化问题参考
5 Ways to Destroy Your Yeast Transformation by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E. coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip. Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid… 1. Forgetting to add single stranded DNA While E. coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment. If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation. 2. Using old PEG PEG (polyethylene glycol) is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer. Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly. The percentage of PEG will make or break the success of your transformation; an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off. If you can stand it, make new PEG for every transformation. Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation. 3. Using cells in stationary phase Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency. This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed –only that your successful transformation rate will be much lower. Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation. 4. Using the wrong selective marker A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit. Double check to save yourself some tears! 5. Cutting corners when heat-shocking This is a major difference between E. coli and yeast transformations: while E. coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock. Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes. I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced. If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minut es, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作 1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。 2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。 3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。 4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。 5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。 6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。 7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。 7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。 8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。 毕赤酵母电击法转化 1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。 2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。 3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。 4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。 5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。 6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。 要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母转化
酵母转化（By HMM） 1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL 的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min； PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。（30℃ 250rpm）。 2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。 PS: a.要求OD600在至之间。 b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。 3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。 PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。 b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个管中。 4.待ssDNA溶化后根据所需量在无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。 PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。 b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120. 5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min; PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。 b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。 6.在超净台中配制mix，vortex混匀。
毕赤酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor （α-factor ）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ 系列选用的是Zeocin 抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG 便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang ：pPICZ 系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K 还是pPICZ 系列？pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ 系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin 筛选（PIC9K 操作麻烦一点，大肠用amp 抗性，而毕赤酵母先用His 缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD ）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie ：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD ，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET 系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA 片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA 片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor 可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N 端不能出现任何多余的aa （比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor 序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题； ④无论pPICZ 还是pPICZα都有TGA （终止密码子），但是pPICZ 系列没有ATG （起始密码子），有人认为酵母启动
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜； 2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 ?KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 ?对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性? 菌种保存： 挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存 （一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。 乙醇沉淀主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀 2)-20℃ 20分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清 5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶） 电击转化： 8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板） 12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备
酵母重新转化及对照制备
酵母重新转化及对照制备(20181213) 背景： 前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。 实验设计： 实验流程： 1.复苏及培养酵母 1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3 天 2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm 摇8h 3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3 4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min 5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5 2.制备酵母感受态 6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min 7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min 8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s 9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中 3.转化 10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng 10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却） 11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀 12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀 13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次 14)加入20ul DMSO，温和混匀 15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次