用菌草培养食线虫真菌淡紫拟青霉
福建农林大学学报(自然科学版)第37卷第5期Journa l of Fujian A griculture and Forestry U n i versity(N a t ura l Sc i ence Ed iti on)2008年9月
用菌草培养食线虫真菌淡紫拟青霉
肖 顺,刘国坤,张绍升
(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002)
摘要:分别比较了菌草+麸皮培养基、麦粒培养基、谷壳+麸皮+虾壳粉培养基、营养珍珠岩培养基和菌草+麸皮+虾壳粉培养基培养食线虫真菌淡紫拟青霉(P aecilo my ces lilacinus)的产孢能力.培养14d后,淡紫拟青霉在菌草+麸皮培养基上的产孢量达86.80亿个 g-1,明显优于供试的其他培养基.菌草+麸皮培养基具有疏松、通气、比表面积大、菌丝生长迅速、产孢量大等优点,具有良好的应用前景.
关键词:菌草;淡紫拟青霉;食线虫真菌;固体发酵
中图分类号:S476+.1文献标识码:A文章编号:1671 5470(2008)05 0460 03
Culturing the nematophagous fungi Paecilo myces lilacinus by using Jun cao
X IAO Shun,LIU Guo kun,Z HANG Shao sheng
(K ey L aborato ry o f B i opestic i de and Che m ical B io l ogy ofM inistry o f Education,
F uji an A g ricu lt ure and F orestry U niversity,Fuzhou,Fuji an350002,Ch i na)
Abstrac t:In orde r to seek a new s ubstra te and extend utili zati on approach o f J un cao,the so li d substrate o f J un cao bran,kerne,l nutrition perlite and Jun cao bran pra w n she ll powder cultur i ng t he nema tophagous fung i Paecilo my ces lil acinus was compared.A fter 14day s,the sporulati on y i e l d of P.lil acinus PL89cu lt ured on Jun cao bran substrate w as8.680109per g ram.Jun cao bran sub strate had t he advantages i nc l ud i ng l ooseness,ventilati on,large spec ifi c surface area,fast grow th,large sporulati on y i e l d.T he re s u lts i nd i cated that Jun cao wou l d be a potenti a l substrate to be used t o cu lt ure t he nem atophagous f ung i P.lilaci nus.
K ey word s:J un cao;Paecilo my ces lilacinus;nem atophagous f ung;i soli d state fer m enta ti on
菌草指可用于食用菌和药用菌栽培的杂草,主要包括芒萁、类芦、斑茅、芦苇、五节芒、菅等野生杂草,还有人工栽培的象草、大米草等草本植物[1].利用菌草栽培食用菌和药用菌已获得成功并大面积推广应用[2].在真菌农药生产上,传统的固体发酵基质原料为麸皮、米糠和玉米粉等.为了开辟新的真菌农药培养基质,拓宽菌草的利用途径,本文以菌草为主要培养基质培养食线虫真菌淡紫拟青霉,取得了良好的效果.
1 材料与方法
1.1 供试菌株
淡紫拟青霉(P aecilo m yces lilacinus)菌株PL89由福建农林大学植物线虫学实验室分离和保存.
1.2 培养基
1.2.1 培养基原料 菌草粉由类芦(N eyraud i a reynaudiana)、五节芒(M iscan t h us flori d ulus)和象草(P enn iset u m pur pureum)混合,由福建农林大学菌草研究所提供;麸皮、麦粒和珍珠岩等,购自市场;虾壳粉由福建农林大学植物线虫学实验室制备.
1.2.2 培养基的制备 (1)液体培养基为虾壳粉培养基,由福建农林大学植物线虫学实验室配制.(2)5种固体培养基配制如下.!麦粒培养基.麦粒泡在水中充分吸胀,捞出,在搪瓷盘上将其摊开并沥干水分.按麦粒干重1%加入C aSO4粉末,充分拌匀,分装于组培瓶中,每瓶85g.?菌草+麸皮培养基.将菌草粉、麸皮以干重1#1混合,分别加入干重2%和1%的蔗糖及C aSO4,混匀,加适量水使混合后含水量为20%,分装于组培瓶中.?菌草+麸皮培养基+虾壳粉.将菌草粉、麸皮和虾壳粉以干重1#1#1混匀,加水调节含
收稿日期:2008-02-26 修回日期:2008-06-18
基金项目:福建省青年科技人才创新基金(2006F3018);福建省科技厅重点项目(2003N030)资助.
作者简介:肖顺(1978-),男,博士,讲师.研究方向:植物病害生物防治.通讯作者张绍升(1951-),男,教授,博士生导师.研究方向:植物线虫和生物防治.Em ai:l shaos h engzhang@126.co m.
水量为20%,分装于组培瓶中.%营养珍珠岩培养基.称取一定量的珍珠岩,倒入制备好的马铃薯蔗糖液(PS),让其充分吸附,沥去多余的PS.放入60&恒温干燥箱适当烘干,然后分装于组培瓶中.?谷壳+麸皮+虾壳粉培养基.将谷壳、麸皮和虾壳粉以干重1#1#1混匀,加水调节含水量为20%,分装于组培瓶中.
1.2.3 培养基的灭菌 液体培养基采用121&高压湿热灭菌20m in ;固体培养基采用121&高压湿热间歇灭菌2次,每次45m in .
1.3 双相培养
1.3.1 液相培养 用已培养6d 的斜面菌种接种3%的虾壳粉液体培养基,使培养液中分生孢子初始浓
度为106个 mL -1,500mL 三角瓶装量200mL 培养基,置于150r m in -1、(29(1)&恒温振荡培养箱中振荡培养.
1.3.2 固相的接种与培养 无菌条件下,取培养48h 发酵液,摇匀后以每瓶18mL 的接种量进行接种,接种后培养料的含水量为50%左右.置于29&、相对湿度85%-90%的恒温培养箱中培养,每处理重复4次.
1.4 产孢量计数
培养第5天起,每隔3d 取样1次,每处理重复3次.将称量好的培养料加入一定量0.15%吐温 80溶液,用微型旋涡混合仪充分振荡.稀释成一定倍数后用医用血球计数板进行孢子计数.
2 结果与分析
2.1 不同固体培养基的产孢能力
通过液固双相发酵培养淡紫拟青霉PL89,考察不同固体培养基的产孢能力.固体培养3d 后,5种配方固体培养基表面及内部均长满白色菌丝,且略带淡紫色,镜检均可观察到分生孢子的产生.
培养5d 后,不同配方培养基的产孢能力差异显著.其中,菌草粉+麸皮培养基产孢量最大,达到32.44亿个 g -1,与其他各处理的差异达极显著,其次为营养珍珠岩培养基,产孢量为15.00亿个 g -1,谷壳+麸皮+虾壳粉培养基和菌草+麸皮+虾壳粉培养基的产孢能力最弱,分别仅4.43亿个 g -1和3.38
亿个 g -1(表1).
表1 不同固体培养基的产孢量1)
Table 1 Sporu lati on y i el d s of d ifferent soli d state fer m entati on s ubs trat es
培养基
产孢量/(亿个 g -1)5d
8d 11d 14d 菌草+麸皮
32.44(0.19a A 49.60(0.80a A 60.90(0.70a A 86.80(5.20a A 麦粒
13.90(0.20cC 13.40(1.70bB 12.10(1.00bB 24.15(0.85bB 营养珍珠岩
15.00(1.00bB 14.10(2.10bB 14.85(0.45c C 22.45(1.05bB 谷壳+麸皮+虾壳粉
4.43(0.045dD 产刺激性气味气体,菌丝自溶产刺激性气味气体,菌丝自溶产刺激性气味气体,菌丝自溶菌草+麸皮+虾壳粉
3.38(0.075e D 产刺激性气味气体,菌丝自溶产刺激性气味气体,菌丝自溶产刺激性气味气体,菌丝自溶 1)采用Dun can 新复极差法对相同培养时间不同培养基配方的产孢能力进行方差分析.其中,不同小写字母表示差异显著(P <0.05),不同大写母表示差异极显著(P <0.01).
含有虾壳粉的2种培养基培养8d 后打开培养瓶口可闻到刺激性气味,用蒸馏水湿润的p H 试纸靠近培养物表面,p H 值上升,达到8.0以上,初步推测其产生的气体为氨气.可能由于培养基中碳氮比例不合适,菌株的生长代谢途径改变所致.
培养14d 后产孢量最大的为菌草+麸皮培养基,达到86.80亿个 g -1,与其他2种培养基的产孢量
差异极显著.麦粒培养基和营养珍珠岩培养基的产孢能力差异不显著,分别仅24.15亿个 g -1
和22.45亿个 g -1.
2.2 淡紫拟青霉在不同配方固体培养基上的生长
从图1可以看出,淡紫拟青霉菌株PL89在菌草麸皮、麦粒和营养珍珠岩等3种培养基上均能很好生长.培养15d 后,物料表面显淡紫红色,镜检可观察到菌丝及分生孢子布满物料的表面,翻动培养料可观察到物料表面漂起)孢子雾?.461 第5期肖顺等:用菌草培养食线虫真菌淡紫拟青霉
A .菌草培养物;B.麦粒培养物;C.营养珍珠岩培养物.
图1 淡紫拟青霉PL89在不同固体培养基上培养15d 的生长状态
Fig .1 P.lilacinu s PL89cu lt ured i n d ifferent soli d substrates
本结果表明,以菌草和麸皮为原料的培养基培养淡紫拟青霉,具有疏松、透气性好、利于菌丝生长和产孢量大的优点,是淡紫拟青霉固体发酵的优良培养基(图1).
3 讨论
淡紫拟青霉菌株PL89(FZ0289)对南方根结线虫的卵有较强的致病性,对黄瓜根结线虫病也显示出良好的防效[3],菌剂的生产成为开发和利用该菌株的关键.由于固体发酵可以模拟自然生长环境,使微生
物保持与自然界相似的生长状态,有可能产生一些通常在液体发酵中不产生的酶、毒素或分生孢子等[4].
真菌生物农药的生产目前主要采用液固两相发酵技术[5],这一技术体系中,固体发酵阶段因其固体基质
内颗粒的混合不易实现,影响传质及氧的传递,存在发酵不均匀,营养利用不充分等问题.营养合适、成本低廉、来源稳定和透气性能良好是真菌固体发酵培养基选用的主要原则,目前可培养淡紫拟青霉的培养
基原料有米糠、麸皮、麦粒、谷壳、陈米、虾蟹壳等[6].菌草具有来源广泛、价格便宜、质地疏松、总碳含量较
高且主要以粗纤维形态存在、碳氮比(C /N)较大
[7]等特点.本研究通过添加一定量麸皮、蔗糖改善菌草的营养成分比例设计的菌草麸皮培养基,具有透气性好、培养基比表面积大、产孢性能好等优点,显示出良好
的应用前景.
参考文献
[1]林占熺,林辉.菌草学[M ].2版.北京:中国农业科学技术出版社,2003:1-3.
[2]王豫生,周毕芬.菌草技术发明与发展的社会学价值[J].福建农林大学学报:哲学社会科学版,2006,9(1):1-5.
[3]肖顺,张绍升,刘国坤.淡紫拟青霉对根结线虫的防治作用[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(5):463-
465.
[4]陈洪章,徐建.现代固态发酵原理及应用[M ].北京:化学工业出版社,2004:5-6.
[5]刘杏忠.昆虫病原真菌研究现状、问题及展望[C ]+刘杏忠,殷幼平,黄勃.中国虫生真菌研究与应用(第5卷).北京:
中国农业科学技术出版社,2003:4.
[6]张绍升.一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法:中国,200510042141[P].2005-09-28.
[7]赵燕,战琨友.常见菌草的碳氮比测定[J].食用菌,2006(2):29.(责任编辑:陈幼玉) 462福建农林大学学报(自然科学版)第37卷