L_精氨酸产生菌的选育及其发酵条件

L_精氨酸产生菌的选育及其发酵条件
L_精氨酸产生菌的选育及其发酵条件

药 物 生 物 技 术

Pharmaceutical Biotechnology 2001,8(4):210~212

L2精氨酸产生菌的选育及其发酵条件①

王 霞,许正宏,敖宗华,孙志浩,陶文沂

(无锡轻工大学生物制药研究室,无锡214036)

摘 要 以谷氨酸棒杆菌(Glutamicum corynebacterium)J HA5(His-,SG r)为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(N TG)逐级诱变处理,获得一株精氨酸高产菌JDN28250(His-SG r D2Arg r L2HA r)。在以120g/L葡萄糖为碳源、50g/L硫酸铵为氮源的培养基中培养4d,产酸可达30g/L。

关键词 L2精氨酸;诱变育种;谷氨酸棒杆菌

中图分类号:TQ922 文献标识码A 文章编号:100528915(2001)0420210203

L2精氨酸是一种具有胍基的人和动物的半必需碱性氨基酸,也是生物体尿素循环中的一种重要中间代谢物。L2精氨酸在医药工业上具有广泛的用途[1]。它是复方氨基酸输液的主要成分之一,也被广泛用于氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能的促进剂,对病毒性肝炎疗效显著,同时对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精等症状都有一定的治疗效果[1]。采用传统的提取法生产L2精氨酸远不能满足其日益增长的需要,因此国内外许多学者致力于L2精氨酸生产菌的选育、工程菌的构建以及生产工艺等方面的研究。国外采用发酵法生产L2精氨酸较早,日本在这方面的研究处于领先水平,他们对黄色棒杆菌进行诱变,突变株产酸可达40~50g/L[2~5],国内在这方面的研究主要是80年代,中科院微生物研究所以谷氨酸产生菌钝齿棒杆菌为出发菌株,经N TG多次逐级诱变,获得了一株能够积累大量精氨酸的菌株97111。该菌株培养96h,产酸达34g/L。但由于该菌株产酸水平不稳定等原因,未能实现该品种生产的国产化[6~8]。本文报道了以谷氨酸棒杆菌(Gl utam icum corynebacteri um)J HA5为出发菌的诱变育种及高产突变株产酸条件的初步研究结果。

1 材料和方法

111 菌株

谷氨酸棒杆菌(Gl utam icum corynebacteri um J HA5)(His-,SG r)112 培养基

11211 琼脂完全培养基(%) 葡萄糖210,牛肉膏110,蛋白胨110,酵母膏015,NaCl015,琼脂210,p H710~712

11212 琼脂基础培养基(%) 葡萄糖110, (N H4)2SO4013,KH2PO4011,MgSO4?7H2O0105, FeSO4?7H2O01002,MnSO4?H2O01002,琼脂210,p H710~712(另外加入生物素30μg/L,硫胺素200μg/L)

11213 摇瓶种子培养基(%) 葡萄糖310,玉米浆210,(N H4)SO4210,KH2PO4011,MgSO40105,尿素0115

11214 摇瓶发酵培养基(%) 葡萄糖1210, (N H4)2SO4415,KH2PO4011,MgSO40105,CaCO3 310,玉米浆215,p H710~712

如无特别说明,所有摇瓶培养条件均为30℃、往复式摇床上96r/min,96h。

113 主要试剂

硫酸二乙酯(DES):上海试剂厂生产;亚硝基胍(N TG):瑞士Fluka公司产品;D2Arginine、L2 Homoarginine:Sigma公司产品。

114 DES和N TG诱变方法

取试管斜面培养物一环,接入装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中于往复式摇床上,96r/ min,30℃培养14h后离心收集菌体,无菌生理盐水洗涤3次,用011mol/L p H710磷酸盐缓冲液调整菌浓度达1×109个/ml。加入DES至终浓度为

012

①收稿日期:2000210210

作者简介:王霞(1974年生),女,山东省泰安人,无锡轻工大学硕士,主要从事生物制药研究

1%,30℃处理30min 。

N TG 诱变的基本步骤同DES 诱变,N TG 浓

度为015mg/ml ,磷酸缓冲液为011mol/L p H

610。115 药物抗性株的检出方法将上述经诱变处理过的菌液涂布含有一定浓度药物的基本培养基平板后,置于30℃培养3~5d ,挑选长出的大菌落,即为药物抗性变异株。116 分析方法11611 菌体生长测定 吸012ml 菌液,加入0125mol/L HCl 5ml 摇匀以蒸馏水作空白于562nm 处测OD 值。11612 L 2精氨酸测定[9,10] 纸层析法、比色定量法

2 结果与讨论

211 L 2精氨酸产生菌JDN28250的选育

以J HA5(His -,SG r )为出发菌株,经DES 诱变

以及D 2Arg 平板筛选,共获得D 2Arg r 变异株190株,经摇瓶筛选,获得两株精氨酸产量较高的菌,分别命名为JD19025和JD190228,其L 2精氨酸产量分别为918g/L 和914g/L ,比出发菌株增长近1倍。

分别对JD19025和JD190228进行N TG 诱变,并结合L 2HA 抗性平板筛选,最终获得一株L 2HA r 变异株JDN28250,其L 2精氨酸的产量达2514g/L 。具体选育谱系如下图

:

L 2精氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏,选育结构类似物抗性变异株以解除L 2精氨酸自身的反馈调节使L 2精氨酸得以积累。根据这一基本原理,我们采用选育L 2精氨酸结构类似物D 2Arg 、L 2HA 抗性变异株的方法,获得了能够积累大量L 2精氨酸的变异株菌JDN28250,其产量有了大幅度提高。

将变异株JDN 228250在新鲜斜面上连续传代5代,考察它们的产酸情况,结果如表1。

Tab 1 The genetic stability of mutant JDN28250G eneration 12345Productivity (g/L )

2615

2714

2715

2517

2613

由上表可见,该突变株的遗传稳定性较好,连续传代5代,其产酸未见明显变化。212 碳源对JDN28250产酸的影响碳源是构成菌体和合成精氨酸碳架及能量的来源,不同的菌种对碳源的利用情况不同。分别考察不同碳源对JDN28250产精氨酸的影响,结果表明:该菌株在以葡萄糖、蔗糖为碳源时,精氨酸的产量较高。进一步考察葡萄糖浓度对其精氨酸产量的影响,当葡萄糖浓度由6%增加到12%时产酸量显著增加,12%到15%产酸量趋于平缓。213 硫酸铵浓度对精氨酸产量的影响

由于发酵产物精氨酸分子中氮元素的含量高达32115%,所以发酵培养基中必须含有较高比例的氮源以满足菌体生长及精氨酸合成的需要。考察硫酸铵浓度对产酸的影响,结果如图1所示

:

Fig 1 E ffect of concentration of (NH4)2SO 4on production of L 2arginine

由图2知随着硫酸铵浓度的增加精氨酸产量显著增加,但当硫酸铵浓度超过5%时产酸又显著下降。

214 玉米浆对L 2精氨酸产量的影响

玉米浆中富含B 族维生素、生物素、嘌呤、嘧啶等微量有机物质,这些物质对前期菌体生长和中后期产酸都是很重要的,考察玉米浆浓度对产酸的影响如图2所示。随着玉米浆浓度的增加产酸增加,玉米浆浓度为215%时,产酸最高达33g/L ,进一步增加玉米浆浓度,其产酸量反而降低。215 碳酸钙浓度对L 2精氨酸产量的影响

1

12王 霞等:L 2精氨酸产生菌的选育及其发酵条件

Fig 2 E ffect of concentration of corn steep liquor on production of L 2arginine

发酵液中硫酸铵的消耗会引起发酵液生理酸

性,对产酸不利,必须用碳酸钙中和,以维持发酵过程中的一定的p H 值。考察发酵液中碳酸钙的用量对精氨酸产量的影响,结果如图3所示

:

Fig 3 E ffect of concentration of CaCO 3on the production of L 2arginine

由图3知随CaCO 3用量的增加产酸量增加,当达到30g/L 时产酸量最大,由30g/L 增加到50g/L 时产酸有下降趋势。

参考文献

[1] Barbul A 1精氨酸:生物化学、生理学及治疗学意义[J ]1氨基

酸杂志,1987,2:39.

[2] Y oshida H ,Araki K ,Nakayama K 1Mechanism of L 2Arginine

Production by L 2Arginine 2producing Mutants of

Corynebacterium glutarmixum [J ]1A gric Biol Chem ,1979,43

(1):105.

[3] Y oshida H ,Araki K ,Nakayama K 1L 2Arginine Production by

Arginine Analog 2resistant Mutants of Microorganisms [J ]1

A gric Biol Chem ,1981,45(4):959.

[4] Takayasu T ,Ajinomoto 1Process for Producing L 2arginine by

fermentatiion [P ]1European Patent ,02378223A1.

[5] Azuma T ,Aoyagl S ,Toshigide A 1Process for producing L 2

arginine [J ]1A gric Biol Chem ,1972,36:1675.

[6] 路志强,龚建华,丁久元1L 2精氨酸产生菌诱变育种的研究

[J ]1微生物学报,1988,28(2):1311

[7] 龚建华,丁久元,路志强1L 2精氨酸发酵条件的研究[J ]1微

生物学报,1988,28(3):257.

[8] 龚建华,丁久元,陈琦1发酵法生产L 2精氨酸放大过程的工

艺研究[J ]1微生物学报,1991,31(6):460.

[9] 蒙绮芳,赖碧清,周锡梁1精氨酸测定方法的研究[J ]1氨基

酸和生物资源,1998,20(3):1.

[10] 北京师范大学生物系生化教研室主编1基础生物化学实验

[M ]1北京:高等教育出版社,1982.

The B reeding of L 2Arginine H yper 2producing Mutant

WAN G Xia ,XU Zheng 2hong ,AO Zhong 2hua ,SUN Zhi 2hao ,TAO Wen 2yi

(School of biotechnology ,W uxi U niversity of L ight I ndust ry ,W uxi 214036)

Abstract A L 2arginine hyper 2producing mutant JDN28250(His 2SG r D 2Arg r L 2HA r )was obtained by the combination treatment with diethylsulfate (DES )and N 2methyl 2N ,2nitroso 2guanidine (N TG )1When it was cultured at 30℃for 96h ,it could accumulate 25230g/L L 2arginine in the medium containing 120g/L glucose and 50g/L (N H 4)2SO 41

K ey w ords L 2arginine ,breeding ,Gl utam icum corynebacteri um

2

12药物生物技术第8卷第4期

第十二章鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸发酵 L-精氨酸(L-Arginine, L-Arg)是具有胍基的碱性氨基酸,是合成蛋白质和肌酸的重要原料。精氨酸是人体和动物体的半必需氨酸,在医药和食品工业上具有广泛的用途。L-鸟氨酸(L-Ornithine, L-Orn)和L-瓜氨酸(L-Citrulline, L-Cit)是精氨酸生物合成的前体物质。L-精氨酸是生物体尿素循环中的一种重要中间代谢产物,临床上除作为复合氨基酸输液的主要成分之一外,L-精氨酸及其盐类广泛用作氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能促进剂。对病毒性肝炎疗效显著,对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精病等症都有治疗效果。它也是配制营养支持用或特殊治疗用要素膳的重要原料。 第一节生物合成途径和代谢调节机制 一、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸的相互转化 图12-l 鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸的结构 从结构(见图12-1)上看,鸟氨酸虽与谷氨酸都是五碳酸,但是鸟氨酸却是一羧基二氨基的氨基酸。如果在鸟氨酸末端氨基的氮上接上氨甲酰基,则生成瓜氨酸。瓜氨酸经过精氨琥珀酸,将瓜氨酸的酮基转换成亚氨基,则成为精氨酸。当然,精氨酸放出尿素,就转变为鸟氨酸。 因此,鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸的生物合成,可认为是从谷氨酸出发,逐步合成鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸,从而组成以精氨酸为最终产物的不分支代谢途径。但是,如果精氨酸发生分解,放出尿素,则生成鸟氨酸。这样在代谢途径上,就使所谓的终产物精氨酸与鸟氨酸相衔接,形成一个循环,即尿素循环或鸟氨酸环(图12-2)。

图12-2 尿素循环 二、生物合成途径和代谢调节机制 从谷氨酸经鸟氨酸、瓜氨酸生物合成L-精氨酸,由八个酶催化的反应组成(见图12-3),第一步和第五步反应因微生物的种类不同而不同。 谷氨 酸N-乙酰谷氨乙酰谷氨酸磷酸 乙酰谷氨酸半醛 N-乙酰鸟氨 鸟氨酸 精氨酰琥 珀 NADPH NADP × 酸 α-酮 瓜氨 门冬氨 × 氨基甲酰磷酸 × × ⑴ ⑶ ⑸ ⑹ 精氨酸 反丁烯二酸 I 型大肠杆菌、枯草杆菌 × 谷氨酸N-乙酰谷氨酸N-乙酰谷氨酸磷酸 N-乙酰谷氨酸半醛 N-乙酰鸟氨酸 精氨酰琥珀酸精氨酸 × × × × ⑴⑵ ⑶ ⑷ 鸟氨酸 瓜氨酸 × ⑸ ⑹ ⑺⑻ × 反馈抑制×阻遏×可能存在的阻遏 II型谷氨酸产生菌、酵母菌 × 图12-3 L-精氨酸生物合成途径及调节机制

L-精氨酸 中文同义词:L-精氨酸;2-氨基-5-胍基戊酸;L-蛋白氨基酸;胍基戊氨酸;精氨酸;L-2-氨基-胍基戊酸;L-胍基戊氨酸;L-精氨酸碱 英文名称: L(+)-Arginine 英文同义词: L(+)-ARGININE;L-ARGININE;L-ARGININE BASE;L-ARG;L-2-AMINO-5-GUANIDINOVALERIC ACID;ARG;ARGININE, L-;FEMA 3819 分子式 : C6H14N4O2 分子量 : 174.2 相关类别: 氨基酸和衍生物;pharmacetical;chiral;Arginine [Arg, R];Amino Acids;Amino Acids and Derivatives;for Resolution of Acids;Optical Resolution;alpha-Amino Acids;Biochemistry;Synthetic Organic Chemistry;L-Amino Acids;L-型氨基酸;Amino Acids;食品添加剂;食品和饲料添加剂;营养性添加剂;氨基酸及其衍生物;生化试剂;生物化学品;氨基酸;营养强化剂(营养增补;Nitric Oxide L-精氨酸性质 L-精氨酸用途与合成方法

L-精氨酸产品详细描述 L-Arginine(L-1-Amino-4-guanidovaleric acid) 对成人为非必需氨基酸,但体内生成速度教慢,对婴幼儿为必需氨基酸,有一定解毒作用。 天然品大量存在于鱼精蛋白等中,亦为各种蛋白质的基本组成,故存在十分广泛。 分子式:C6H14N4O2 分子量:174.20 性状:白色斜方晶系(二水物)晶体或白色结晶性粉末.熔点244℃(分解).经水重结晶后,于105 ℃失去结晶水.其水溶性呈强碱性,可从空气中吸收二氧化碳.溶于水(15%,21℃),不溶于乙醚,微溶于乙醇. 质量标准: 外观性状:白色结晶粉末

1000吨/年L-精氨酸(食品添加剂) 项目建议书 一、项目

1、项目名称:1000吨/年L-精氨酸(食品添加剂)项目。 2、项目规划:由于生产工艺的同一性,可以逐渐形成多品种氨基酸食品添加剂系列的工厂。 3、建设单位:名称待定 二、产品--L-精氨酸(食品添加剂) 英文名称:L-Arginine 中文名称:L -精氨酸 化学分子式:C6H14N4O2 特性:白色斜方晶体(二水物)晶体或白色结晶性粉末。熔点244℃(分解)。经水重结晶后,于105℃失去结晶水。其水溶液呈强碱性,可从空气中吸收二氧化碳。溶于水(15%,21℃),不溶于,微溶于乙醇。天然品大量存在于鱼精蛋白等中,亦为各种蛋白质的基本组成,故存在十分广泛。除鱼精蛋白外,亦较多存在于乌贼、绿茶、蒜等中,并成为他们特殊的呈味物质。 用途:增味剂;营养强化剂。主要用于水产加工品、绿茶风味增加剂等。 与糖进行加热反应可获得特殊的香味物质。 氨基酸输液及氨基酸制剂的重要成分。 质量标准:FCC ,aji09—日本味之素09版标准

功用:对成人为非必需氨基酸,但体内生成速度较慢,对婴儿为必须氨基酸, [包装]:牛皮纸袋或纸桶包装,每袋(桶)净含量为25kg,还可根据用户需要包装。 [运输]:轻装轻卸以防包装破损,防日晒雨淋,不能与有毒,害物同运。为非危险品。 [贮存]:本品应贮存在阴凉、干燥、清洁、遮光的环境中,严禁与有毒、有害物质混放,以免污染。 三.产品主要用途: 国际上开展对精氨酸的研究已经有50多年的历史。大量的研究结果表明,精氨酸具有增加人类生长激素(Human Growth Hormone HGH)、恢复疲劳、增强肌肉力量、抗衰老、增强性功能以及提高免疫力等多种功能。 精氨酸是人体和动物体中的"半必需"氨基酸,即在人和动物体内合成

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/ed18292993.html, L—精氨酸发酵条件中溶氧、PH控制的优化 作者:马腾何连顺米造吉李斌水马静张仲良 来源:《中国科技纵横》2017年第09期 摘要:精氨酸作为人体的扮必需氨基酸,其功能性作用及药理作用逐渐被人们所重视, 发酵法以其成本低、生产清洁等优势,成为当前精氨酸的主流生产方法。本文主要通过研究发酵过程中的OD、PH、补料、溶氧等过程的控制,实现精氨酸发酵水平的提高,实验发现在PH=7的条件下,一次补料,高溶氧有利于发酵的进行。 关键词:L-精氨酸;发酵;过程控制;优化 中图分类号:TQ922 文献标识码:A 文章编号:1671-2064(2017)09-0200-02 1 精氨酸简述 精氨酸是一种α氨基酸,具有调节血糖、保护肝脏、增强人体免疫力、延缓衰老、促进功能抗疲劳、促进伤口愈合的独特生理功能。精氨酸的制备方法有发酵法、化学合成法和蛋白质(如明胶)水解物经离子交换分离提取法,目前用发酵法较多,但不是高产酸率的品种。我国的发酵法生产水平更低,故当前国内精氨酸以动物蛋白为原料生产更有经济价值。国外如日本等发达国家基本都采用先进的发酵法,而国内的发酵方法尚处于研究阶段,故此,国内L-精 氨酸的生产主要是抽提法。但是抽提法收到原料、环保等限制,具有明显的生产局限性。 2 优化设计 2.1 优化思路 发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常有用的技术手段。发酵工艺优化各因素之间不是孤立的,而是相互联系的。为了提高发酵生产水平,人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上,发酵工艺的优化,包括生物反应器中的工程问题,也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求,也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制,依据不同的发酵而有所不同。同时,微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期,对环境条件可能会有不同的要求。因此,应该在生物反应器内,使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换,始终为其提供最佳的环境条件,本实验以溶氧和PH为主要内容进行验证。 2.2 检测方法

精氨酸市场调研分析 精氨酸的用途和生产情况 精氨酸是维持婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸。它是鸟氨酸循环的中间代谢物,能促使氨转变成为尿素,从而降低血氨含量。它也是精子蛋白的主要成分,有促进精子生成,提供精子运动能量的作用。此外,静注精氨酸,能刺激垂体释放生长激素,可用于垂体功能试验,被广泛应用于医药、保健、食品、美容等方面。 L-精氨酸工业化主要有两种生产工艺:即蛋白质水解提取工艺;生物发酵工艺。国际上著名的大公司如日本味之素、协和公司和韩国大象公司主要采用生物发酵技术进行大规模生产L-精氨酸产品。 蛋白质水解制备L-精氨酸一般采用毛发(包括猪血)盐酸水解法提取,每吨毛发只能提取10kgL-精氨酸,工艺繁杂,而且水解过程中要使用大量盐酸,成本高,环境污染重。 生物发酵制备工艺一般通过诱变、筛选得到积累精氨酸含量高的生产的菌种,然后进行液体深层培养,得到含精氨酸的发酵液,再通过提取精制技术得到成品L-精氨酸。 目前国内生产L-精氨酸一般采用蛋白质水解提取工艺,产能小、成本高,环境污染重,不符合国家的长远发展战略。而且国外,特别是欧盟国家十分强调非动物来源性(non-animal),使得毛发水解精氨酸产品不能得到广泛应用。因此建立我国发酵法生产L-精氨酸工业十分紧迫,也有良好发展前景。 国内生产L-精氨酸企业只有湖北新生源有限公司,主要采用毛发水解法生产,产能小,污染重,不是主流生产方法。欧洲国家有少量的毛发水解产品,国外的生产企业主要日本味之素和协和发酵、韩国大象等企业,均采用发酵法生产,全球产能不足10000吨,需求缺口很大。 产品的国内外市场应用现状 L-精氨酸是体内多种功能物质的合成前体,具有改善心肌功能、增强肝脏解毒能力、消除疲劳的生理作用,是氨基酸营养输液和多种营养添加剂的重要组成成分;近年来,L-精氨酸在食品、医药、保健等行业应用十分广阔。L-精氨酸是具有广泛用途的高附加值氨基酸品种,是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体,合成肌肉素的重要原素,被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。L-精氨酸是体内多种功能物质的合成前体,具有改善心肌功能、增强肝脏解毒能力、消除疲劳的生理作用,是氨基酸营养输液和多种

相关主题
相关文档
最新文档