枯草杆菌弹性蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定
收稿日期：2001-03-12作者简介：王金英（1964-），女，实验师，大专，从事食品酿造、保健食品研发工作，获省级奖1项，发表论文10篇。中图分类号：Q93-331文献标识码：A 文章编号：1004-311X （2001）02-0030-03
枯草杆菌弹性蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定
王金英，刘宇峰，孙岸弢
（黑龙江省科学院应用微生物研究所
黑龙江哈尔滨150010）
摘
要：从稻草中初筛出14株具有溶解弹性蛋白作用
的G +产芽孢杆菌，经分离纯化筛选诱变，并进行生理生化鉴定后，得到2株产酶活较高的枯草芽孢杆菌B.
subtilis HW236-5和HW245-1，作为制备抗动脉粥样
硬化枯草杆菌弹性酶的产酶菌株。关键词：枯草杆菌；弹性蛋白酶
弹性蛋白酶（Elastase ）是一种以分解不溶性弹性蛋白酶为特征的广谱蛋白水解酶，是治疗高血脂症，防治动脉粥样硬化症的生化药物。它既可由动物胰脏提取，也可由微
生物发酵制得［1］
。来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物———弹性硬蛋白，作为同功不同源的蛋白酶，其特点、性质、分子量、电点等有所差异，但都是一种广谱的肽
链内切酶，具有较广的水解特性［2］
，不仅能降解弹性蛋白，而且对酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都能分解，作用效果与胰弹性酶相同相似，本研究筛选出弹性蛋白酶的枯草杆菌产生菌株，以探讨工业化生产的可能性。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.2试剂：弹性蛋白（elastin ），Sigma 公司
产品（E -1625）；刚果红———弹性蛋白（E-lastin -Congo Red ），中国药品生物制品检定所产品。1.2培养基
1.2.1菌种分离平板与斜面培养基
（%）：牛肉膏1.0；蛋白胨1.0；蔗糖1.0；NaCl 0.5；琼脂2.0；pH6.8。
1.2.2初筛弹性蛋白培养基
（%）：弹性蛋白0.5；酵母膏0.1；葡萄糖0.1；MgSO 4?7H 2O 0.
01；K 2HPO 40.1；KH 2PO 40.05；琼脂2.0；pH7.
0。
1.2.3发酵培养基
（%）：干酪素3.0；葡萄糖4.0；玉米提取液0.2；K 2HPO 40.2；MgSO 4?
7H 2O 0.01；pH6.0。1.3方法
1.3.1枯草杆菌的筛选：
取稻草数根剪碎，放入三角瓶中，加水没过干草，装量不超过瓶容量的1/2，加石灰少许，塞好棉塞，煮沸
5min ，
杀死无芽孢的细菌，置30℃～37℃培养48h ，
液面出现白色菌膜后，用压滴法观察杆菌的运动，再通过染色法观察菌体及芽孢。取该培养液在平板培养基上涂布和划线，进行菌种分离后，将单菌落划线到斜面培养基上保存备用。
1.3.2菌种的产弹性蛋白酶性初筛检验：
取斜面保存的菌种稀释涂布于平板培养基上，形成单菌落后，点种于弹性蛋白初筛平板进行初筛。选择水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落划线到斜面培养基上，进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液弹性蛋白酶的活力。
1.3.3弹性蛋白酶活性测定方法：
参照《中华人民共和国卫生部药品标准》二部六册P122～P124。
1.3.4菌种的诱变
1.3.4.1硫酸二乙酯诱变法：见文献［3］。1.3.4.2Co 60
诱变法：
见文献［3］。2结果与讨论
2.1从稻草中筛出17株可使弹性蛋白溶解
的杆菌，经液体培养复筛出4株产酶较高菌株236、245、Na -7、N -12，再对这4株菌进行诱变又得到14株236菌、6株245菌、17株
Na -7菌、8株N -12菌，
经比较弹性蛋白的溶解透明圈与菌径之比，选取较大的4株菌株进行液体发酵试验，最后选定236-5和
245-1作为产弹性蛋白酶菌株，
结果见表1。表1产弹性蛋白酶菌株的筛选菌株号透明圈直径与菌径之比蛋白酶活力（u /ml ）弹性酶活力（u /ml ）236-1
20/5.5=3.6458.21269236-516/5.5=2.989.1075245-115/8=1.88118.175Na -15
13/4=3.25102.16872
2.2菌株236-5与245-1的菌落形态及生长特征：236-5和245-1均与B.subtilis 标准菌的特征相同，菌落表面褶皱，圆形，不规则，无光泽，不透明，白色菌落直径2mm -3mm ，
粗糙。在1%葡萄糖营养琼脂试管的穿刺表面生长物变厚。
2.3菌株236-5与245-1菌体及生理生化特征：试验观察，236-5与245-1的特征均与枯草杆菌的典型特征相同，根据伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）P732～P735，对于典型枯草杆菌的描述，可鉴定为枯草杆菌，遂命名为HW236-5和HW245-1。2.4讨论
通过对HW236-5与HW245-1两株菌的产弹性蛋白酶活性和生理生化及菌体菌落特性的大量试验研究，该两株菌与B.subtilis 标准株的菌学特性基本相同，因此可以确定HW236-5与HW245-1两株菌系为枯草芽孢杆菌，并且具有产生弹性蛋白酶的能力，其
产酶能力基本与国外［5-7］
报道的其它微生物产弹性菌种相似。同时因为这两株菌营养要求简单，产酶迅速，故极有可能作为微生物弹性蛋白酶的菌株。
参考文献：
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北京：科技出版社，117.［2］唐宝英，朱晓慧.微生物弹性蛋白酶研究概况［J ］.工业
微生物，1998，28（1）：40-44.［3］章名春.工业微生物诱变育种［M ］.第1版.北京：
科学出版社，1984，111-127.
［4］中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般组药常用
鉴定方法［M ］.第1版.北京：科学出版社，1979，111-193.［5］北京师范大学生物系.怎样改变与培养微生物［M ］.第
1版.北京：北京师范大学出版社，1982，925.［6］Ying Chieh T sai ，Shuen Fuh Lin ，Ywan Feng Li.Characterization
of an alkaline elastase from alkalophilic Bacillus Ya -B ［J ］.
Biochem.Biophyl.Acta.1986，883：439.
1
32001年4月枯草杆菌弹性蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定
［7］Mohinder kaur，K K Tripathi，Meenakshi Gupta.Production and partial characterization of dastase of Bacillus subtilis isolated from the cervices of human females［J］.Can.J.Microbial，1988，34：855.
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
1---从杂交育种到基因工程历年高考题 2013年 1.（2013全国卷大纲版）下列实践活动包含基因工程技术的是 A.水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种 B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦 C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株 D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆 2.（2013上海卷）25．研究者从冰川土样中分离获得了具有较高脂肪酶活性的青霉菌菌株，为了在此基础上获得脂肪酶活性更高的菌株，最可行的做法是 A．用紫外线照射青霉菌菌株，再进行筛选B．将青霉菌菌株与能高效水解蛋白质的菌株混合培养，再进行筛选 C．将能高效水解蛋白质的菌株的基因导入青霉菌菌株，再进行筛选 D．设置培养基中各种营养成分的浓度梯度，对青霉菌菌株分别培养，再进行筛选 3.（2013浙江卷）32．（18分）在玉米中，控制某种除草剂抗性（简称抗性，T）与除草剂敏感（简称非抗，t），非糯性（G）与糯性（g）的基因分别位于两对同源染色体上。有人以纯合的非抗非糯性玉米（甲）为材料，经过EMS诱变处理获得抗性非糯性个体（乙）；甲的花粉经EMS诱变处理并培养等，获得可育的非抗糯性个体（丙）。 请回答：（1）获得丙的过程中，运用了诱变育种和________育种技术。 （2）若要培育抗性糯性的新品种，采用乙与丙杂交，F1只出现抗性非糯性和非抗非糯性的个体；从F1中选择表现为____的个体自交，F2中有抗性糯性个体，其比例是_____。 （3）采用自交法鉴定F2中抗性糯性个体是否为纯合子。若自交后代中没有表现型为 _______的个体，则被鉴定个体为纯合子；反之则为杂合子。请用遗传图解表示杂合子的鉴定过程。（4）拟采用转基因技术改良上述抗性糯性玉米的抗虫性。通常从其它物种获得________， 将其和农杆菌的________用合适的限制性核酸内切酶分别切割，然后借助_________连接，形成重组DNA 分子，再转移到该玉米的培养细胞中，经筛选和培养等获得转基因抗虫植株。 2014年 1.（江苏卷）13.下图是高产糖化酶菌株的育种过程，有关叙述错误 ．．的是 A.通过上图筛选过程获得的高产菌株未必能作为生产菌株 B.X射线处理既可以引起基因突变也可能导致染色体变异 C.上图筛选高产菌株的过程是定向选择过程 D.每轮诱变相关基因的突变率都会明显提高 2.（2014重庆卷.4.）题4图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是 A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 3.（2014天津卷. 4.）为达到相应目的，必须 ．．通过分子检测的是 A.携带链霉素抗性基因受体菌的筛选 B.产生抗人白细胞介素－8抗体的杂交瘤细胞的筛选 C.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定 D.21三体综合征的诊断 4.（课标Ⅰ卷）32.（9分）现有两个纯合的某作物品种：抗病高杆（易倒伏）和感病矮杆（抗倒伏）品种。已知抗病对感病为显性，高杆对矮杆为显性，但对于控制这两对相对性状的基因所知甚少。回答下列问题： （1）在育种实践中，若利用这两个品种进行杂交育种，一般来说，育种目的是获得具有优良性状的新品种。 （2）杂交育种前，为了确定F2代的种植规模，需要正确的预测杂交结果。若按照孟德尔遗传定律来预测杂交结果，需要满足3个条件：条件之一是抗病与感病这对相对性状受一对等位基因控制，且符合分离定律；其余两个条件是 。 （3）为了确定控制上述这两对性状的基因是否满足上述3个条件，可用测交实验来进行检验。请简要写出该测交实验的过程。 2015年 1.（2015年江苏卷.15．）经X射线照射的紫花香豌豆品种，其后代中出现了几株开白花植株，下列叙述 错误 ．．的是
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、 45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、 摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌 移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜 纸。
五、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细 菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养 24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透 明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否 为芽孢杆菌。 （三）筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作
专题二十一从杂交育种到基因工程 【高频考点解读】 1.生物变异在育种上的应用 2.转基因食品的安全 【热点题型】 题型一遗传育种的方法及原理 例1、如图表示某种农作物品种①和②培育出⑥的几种方法，有关说法错误的是( ) A．培育品种⑥的最简捷途径是Ⅰ→Ⅴ B．通过Ⅱ→Ⅳ过程最不容易达到目的 C．通过Ⅲ→Ⅵ过程的原理是染色体变异 D．过程Ⅵ常用一定浓度的秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 【提分秘籍】 1.诱变育种与杂交育种相比，前者能产生前所未有的新基因，创造变异新类型；后者不能产生新基因，只是实现原有基因的重新组合。 2．在所有育种方法中，最简捷、常规的育种方法——杂交育种。 3．杂交育种选育的时间是F2，原因是从F2开始发生性状分离；选育后是否连续自交取决于所选优良性状是显性还是隐性。
4．杂交育种是通过杂交培育具有优良性状且能稳定遗传(纯合子)的新品种，而杂种优势则是通过杂交获得种子，一般不是纯合子，在杂种后代上表现出多个优良性状，但只能用杂种一代，因为后代会发生性状分离。 5．诱变育种尽管能提高突变率，但处理材料时仍然是未突变的远远多于突变的个体；突变的不定向性和一般有害的特性决定了在突变的个体中有害仍多于有利，只是与自然突变相比较，二者都增多。 6．杂交育种与杂种优势的区别 (1)杂交育种是通过有性生殖，使不同的优良性状组合到后代的一个个体中，从而选育出优良品种的方法。 (2)杂种优势是指基因型不同的个体杂交产生的杂交一代，在适应能力等方面优于两个亲本的现象。 7．不同育种目的的杂交育种的基本步骤及特点 (1)培育杂合子品种——杂种优势的利用 在农业生产上，可以将杂种一代作为种子直接利用，如水稻、玉米等。 ①基本步骤：选取双亲P(♀、♂)→杂交→F1。 ②特点：高产、优质、抗性强，但种子只能种一年。 (2)培育纯合子品种 ①培育隐性纯合子品种的基本步骤 选取双亲P(♀、♂)→杂交，F1→自交→F2→选出表现型符合要求的个体种植推广。 ②培育双显纯合子或隐—显纯合子品种的基本步骤 选取双亲P(♀、♂)→杂交→F1→自交→F2→选出表现型符合要求的个体自交→F3→……→选出稳定遗传的个体推广种植。 ③特点：操作简单，但需要的时间较长。 【举一反三】 在实验田中偶然出现了一株抗旱、抗盐的玉米，设想利用该植株培育能稳定遗传的抗旱、抗盐水稻品种，用到的育种方法和技术应有( ) ①诱变育种②单倍体育种 ③转基因技术④组织培养技术 A．①②③B．②③④ C．①③④D．①②④
毕业论文开题报告 食品科学与工程 产蛋白酶乳酸菌的筛选 一、选题的背景与意义 乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB)指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。相当多的乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，随着人们生活水平的不断提高，乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面发挥越来越重要的作用。 乳酸菌蛋白酶的主要作用：第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。但目前关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，尤其是关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及到所有乳酸菌，还具有很大的发展空间。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据；可以为蛋白酶的生产提供依据；可以为鲳鱼饲料的生产提供依据……总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 1、研究基本内容 ①从泡菜、酸奶、豆腐乳等实验材料中分离纯化乳酸菌； ②将分离出的乳酸菌进行增值培养； ③对增值培养的乳酸菌进行产蛋白能力测定，筛选出产蛋白能力最强的乳 酸菌菌种； ④菌种鉴定。 2、拟解决的主要问题 ①乳酸菌菌种的来源； ②菌种鉴定方法。 三、研究的方法与技术路线：
《生物的变异和进化》专题优化测评卷 一、选择题（每小题6分，共12小题，共72分。在每小题给出的四个选项中，只有一项符合 题目要求，请将正确答案的字母代号填入下表相应题号的空格内） 题号 1. 2. 3. 4. 5. 6.7.8.9.10.11.12. 选项 1.除草剂敏感型的大豆经辐射获得抗性突变体，且敏感基因与抗性基因是1对等位基因。下列叙 述正确的是（） A.突变体若为1条染色体的片段缺失所致，则该抗性基因一定为隐性基因 B.突变体若为1对同源染色体相同位置的片段缺失所致，则再经诱变可恢复为敏感型 C.突变体若为基因突变所致，则再经诱变不可能恢复为敏感型 D.抗性基因若为敏感基因中的单个碱基对替换所致，则该抗性基因一定不能编码肽链 2.下列关于染色体变异的叙述，正确的是（） A.染色体增加某一片段可提高基因表达水平，是有利变异 B.染色体缺失有利于隐性基因表达，可提高个体的生存能力 C.染色体易位不改变基因数量，对个体性状不会产生影响 D.通过诱导多倍体的方法可克服远缘杂交不育，培育出作物新类型 3.图甲表示雄家兔细胞内的一对同源染色体。一个精原细胞进行细胞分裂时得到了图乙所示的情 况，另一个精原细胞进行细胞分裂时得到图丙所示的情况。下列相关说法中不正确的是（） A.图乙所示情况发生在精原细胞进行减数分裂的过程中 B.图丙所示情况发生在精原细胞进行有丝分裂或减数分裂的过程中 C.乙、丙两图所示的变异一定能遗传给子代 D.乙、丙两图所示的变异类型分别属于基因重组和染色体结构变异 4.大豆植株的体细胞含40条染色体。用放射性60C O 处理大豆种子后，筛选出一株抗花叶病的植株X，取其花粉经离体培养得到若干单倍体植株，其中抗病植株占50％。下列叙述正确的是（） 题号一 二 总分 13 14 得分 （时间45分钟满分100分）
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
考点17 理解变异原理，掌握育种流程 1．育种方式及原理辨析 (1)诱变育种原理 原基因A(a)――――→诱变产生基因突变新基因a(A) ↓ ↓ 原性状 目标性状 (2)单倍体育种与杂交育种的关系
(3)多倍体育种的原理分析 注意多倍体育种中秋水仙素可处理“萌发的种子或幼苗”，单倍体育种中秋水仙素只能处理“单倍体幼苗”，切不可写成处理“种子”。 2．不同需求的育种方法的选择与分析 (1)若要求培育隐性性状的个体，可用自交或杂交，只要出现该性状即可。 (2)若要求快速育种，则应用单倍体育种。 (3)若要求大幅度改良某一品种，使之出现前所未有的性状，则可利用诱变育种的方法。 (4)若要求提高品种产量，提高营养物质含量，可运用多倍体育种。 (5)若要求将两亲本的两个不同优良性状集中于同一生物体上，可用杂交育种，亦可利用单倍体育种。 (6)若实验植物为营养繁殖，则只要出现所需性状即可，不需要培育出纯种。 (7)若要求克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改变现有性状，则可以选择基因工程育种。 (8)若要培育原核生物，因其不能进行减数分裂，则一般采用诱变育种。 3．花药离体培养≠单倍体育种 (1)花药离体培养仅获得单倍体幼苗。 (2)单倍体育种包括花药离体培养和诱导单倍体染色体加倍。 题组一辨析育种相关的原理 1．(2015·天津，9)白粉菌和条锈菌能分别导致小麦感染白粉病和条锈病，引起减产。采用适宜播种方式可控制感病程度。下表是株高和株型相近的小麦A、B两品种在不同播种方式下的试验结果。
注：“＋”的数目表示感染程度或产量高低；“－”表示未感染。 据表回答： (1)抗白粉病的小麦品种是________，判断依据是____________________________。 (2)设计Ⅳ、Ⅴ两组试验，可探究_____________________________________________。 (3)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ三组相比，第Ⅲ组产量最高，原因是______________________________。 (4)小麦抗条锈病性状由基因T/t控制，抗白粉病性状由基因R/r控制，两对等位基因位于非同源染色体上。以A、B品种的植株为亲本，取其F2中的甲、乙、丙单株自交，收获子粒并分别播种于不同处理的试验小区中，统计各区F3中的无病植株比例。结果如下表： 据表推测，甲的基因型是________，乙的基因型是________，双菌感染后丙的子代中无病植株的比例为________。 答案(1)A Ⅰ、Ⅱ组小麦未感染白粉病 (2)植株密度对B品种小麦感病程度及产量的影响 (3)混播后小麦感病程度下降 (4)Ttrr ttRr 18.75%(或3/16) 解析(1)从Ⅰ和Ⅱ组的试验结果可知抗白粉病的小麦品种是A。(2)分析Ⅲ、Ⅳ两组试验，
微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍
(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
育种例题 1．作物育种技术是遗传学研究的重要内容之一，关于作物育种的叙述正确的是( ) A ．培育高产、抗逆性强的杂交水稻属于诱变育种 B ．改良缺乏某种抗病性的水稻品种常采用单倍体育种 C ．培育无子西瓜过程中可用一定浓度的秋水仙素处理二倍体幼苗 D ．把两个小麦品种的优良性状结合在一起，常采用植物体细胞杂交技术 2．如图甲、乙表示水稻两个品种(两对相对性状独立遗传)，①～⑧表示培育水稻新品种的过程。下列说法正确的是( ) A ．如果过程②中逐代自交，那么自交代数越多纯合植株的比例越高 B ．⑤与⑧过程的育种原理相同，③过程表示单倍体育种 C ．育种过程②⑤⑥中需要进行筛选，筛选不会改变任何一个基因的频率 D ．经过①和⑦过程培育的品种和甲、乙品种基因型不同，但是仍然属于同一个物种 3．下列关于生物学中常见育种方法的叙述错误的是( ) A ．在杂交育种中，一般从F 2开始选种，因为从F 2开始发生性状分离 B ．在单倍体育种中，常先筛选F 1的花粉再进行花药离体培养 C ．在多倍体育种中，秋水仙素处理的目的是使染色体加倍 D ．在诱变育种中，常选用萌发的种子或幼苗作为处理材料 4．如图表示培育新品种(或新物种)的不同育种方法，下列分析错误的是( ) A ．①②③过程的育种方法能产生新的基因型，⑥过程的育种 方法能产生新的基因 B ．④⑤过程的育种和⑦过程的育种原理相同，均利用了染色 体变异的原理 C ．②③过程自交的目的不同，后者是筛选符合生产要求的纯 合子 D ．图中A 、B 、C 、D 、 E 、 F 中的染色体数相等，通过⑦过程产生的新物种的染色体数是B 的两倍 5．下列有关育种的叙述中，错误的是 ( ) A ．用于大田生产的优良品种不一定是纯合子 B ．通过植物组织培养技术培育脱毒苗，筛选培育抗病毒新品种 C ．诱变育种可提高突变频率，加速新基因的产生，从而加速育种进程 D ．为了避免对三倍体无子西瓜年年制种，可利用植物组织培养快速繁殖 6．普通小麦中有高秆抗病(TTRR)和矮秆易感病(ttrr)两个品种，控制 两对性状的基因分别位于两对同源染色体上。实验小组利用不同的 方法进行了如下三组实验：下列关于该实验的说法，不正确的是 ( ) A ．A 组和 B 组都利用杂交的方法，目的是一致的 B ．A 组F 2中的矮秆抗病植株Ⅰ可以直接用于生产 C ．B 组育种过程中，必须用到生长素、细胞分裂素、秋水仙素等物 质 D ．C 组育种过程中，必须用γ射线处理大量的高秆抗病植株，才有可能获得矮秆抗病植株 7．如图为普通小麦的培育过程。据图判断下列说法正确的是( ) A ．普通小麦的单倍体中含有一个染色体组，共7条染色体 B ．将配子直接培养成单倍体的过程称为单倍体育种 C ．二粒小麦和普通小麦均能通过自交产生可育种子 D ．染色体加倍只能通过秋水仙素处理萌发的种子实现 8．染色体部分缺失在育种方面也有重要作用。下图所示为育种专家对棉花 品种的培育过程，相关叙述错误的是(多选)( ) A ．太空育种依据的原理主要是基因突变 B ．粉红棉M 的出现是染色体缺失的结果 C ．深红棉S 与白色棉N 杂交产生深红棉的概率为14 D ．粉红棉M 自交产生白色棉N 的概率为12 9．牙鲆生长快、个体大，且肉嫩、味美、营养价值高，已成为海水养殖中有重要经济价值的大型鱼类，而且雌性个体的生长速度比雄性明显快，下面是利用卵细胞培育二倍体牙鲆示意图。其原理是经紫外线辐射处理过的精子入卵后不能与卵细胞核融合，只激活卵母细胞完成减数分裂，后代的遗传物质全部来自卵细胞。关键步骤包括：①精子染色体的失活处理；
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸
实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白 水解圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化 合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 ?学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 ?学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 ?掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。 2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。 3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株