NOX在糖尿病肾病氧化应激损伤过程中的作用

朱斌1,2，李平1，张浩军1，赵婷婷1（1．中日友好医院　临床医学研究所药物药理室，北京　100029；2．中国医学科学院北京协和医学院　药理系，北京　100021）

基金项目：国家自然科学基金项目（No.81173422），国家国际科技合作专项（No.2011DFA31860）通讯作者：李平　Email：lp8675@https://www.360docs.net/doc/f14591893.html,

氧化应激是指机体活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）产生过多或机体抗氧化能力降低，从而导致潜在病理损伤的过程，早在1956年人们已经认识到ROS 可以对老化细胞产生毒性作用[1]。ROS 主要包括氧自由基和非自由基的含氧产物，如超氧阴离子（O 2-）、羟自由基（?OH ）和过氧化氢（H 2O 2）等。生理状态下机体ROS 的产生与抗氧化系统保持动态的平衡，适量的ROS 可以杀灭细菌及清除白细胞，在宿主的主动防御中起到了积极的作用。当高血糖、缺血再灌注，炎症等情况下，ROS 的产生增多，或当机体的抗氧化系统受损，ROS 的产生和机体的抗氧化能力之间的平衡被打破时，产生氧化应激，造成组织与多器官的损伤。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase ，NADPH oxidase ，NOX ）是人类发现的第一个主要产生ROS 的酶，也被称为ROS 产生的“心脏”[2]。体内多种因素如糖代谢紊乱、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide s y n t h a s e ，e N O S ）解偶联，糖基化终末产物（advancedglycation end products ，AGEs ）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）等均可以引起NOX 的表达升高，从而造成细胞和组织的氧化

应激损伤。肾脏是对氧化损伤敏感的器官之一，ROS 在糖尿病肾病的发展过程中起到重要的作用。研究发现过量的ROS 可以造成肾小球足细胞的永久性损伤，引起蛋白尿的产生；还会影响到肾脏的血流动力学改变，引起肾小球毛细血管通透性的改变；同时还会刺激细胞外基质的过度增殖，造成肾小球肥大[3]。因此本文拟对NOX 在糖尿病肾病发病过程中的作用进行探讨。1　NOX过表达引起体内O 2-水平升高

NOX 是细胞内一组具有氧化活性的蛋白，其主要生物学功能是产生ROS ，它参与信号转导、天然免疫和激素合成等许多生物学功能[4,5]。研究发现NOX 是由多种亚单位组成的具有6个α螺旋跨膜结构域的酶复合体，在其第3和第5次跨膜结构域分别存在两个可以与亚铁血红素紧密结合的保守组氨酸，同时该部位也是氧原子的结合位点；而在细胞基质中存在黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide ，FAD ）和还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ，NADPH ）的结合位点[6]。研究发现NOX 主要由存在于细胞膜的p22phox ，gp91phox 以及存在于胞浆中的4个亚基p47phox 、p67phox 、p40phox 和小GTPase （Rac1、Rac2）所构成。当细胞受到外来刺激时，细胞中的p47phox 、p67phox 、p40phox

和Rac1亚基就会向细胞膜转位，与p22phox和gp91phox结合从而导致了ROS的产生[7]。目前发现动物体内主要存在着两类结构相似但功能不同的NOX，其一存在于中性粒细胞中，与宿主非特异性防御关系密切。生理状态下，该酶存在于静息状态的细胞中，一旦受到外界刺激，可以迅速激活，并导致肉芽肿的形成；另一类即是存在于非吞噬细胞中的NOX（non-phagocytic NADPH oxidases），并且近年来随着研究的深入，非吞噬细胞中的NOX越来越引起人们的重视[8]。在生理状态下，非吞噬细胞中的NOX可以在细胞内持续不断地产生少量的O2-，可以作为体内氧化还原反应的第二信使，与细胞增殖、凋亡、迁移等关系密切。一旦刺激超过细胞阈值，NOX就会催化O2生成O2-，在经过多种途径衍生成H2O2、OH-及其他超氧分子，造成组织的过氧化损伤。

研究发现gp91phox是NOX最主要的亚基之一，并且是NOX活性亚基。gp91phox氨基端的300个氨基酸残基可形成6个跨膜的α螺旋，而羧基端的胞浆部分则构成FAD和NADPH的结合位点[9]。动物体内gp91phox存在7种同源结构，根据这7种不同的结构可以将NOX分别命名为：NOX1（MOX1）、NOX2（gp9lphox）、NOX3、NOX4（Renox）、NOX5、Duox1和Duox2[10]。虽然都属于NOX家族，在ROS的产生过程中发挥了重要的作用，但这7个同源异构体也存在不同之处：NOX1～5是分子量为65 KD的核心蛋白，而Duox1，Duox2的分子量则为175～180 KD；同时NOX1～4缺乏细胞外功能区域，而NOX5则具有EF-hand和Ca离子结合位点。DUOX1，DUOX2具过氧化物酶的结合位点，其结构与gp91phox相似[11]。除此之外这7种同源结构在体内的分布也具有组织特异性。现已证实NOX1主要在平滑肌中高表达，NOX2则主要分布在内皮细胞和吞噬细胞中。NOX1/NOX2则主要调节血液、炎症和细胞生长；NOX3在胚胎肾和人耳中高表达，与人体的平衡觉和听觉关系密切；NOX4主要在人体肾皮质表达，与细胞的分化联系紧密。NOX5则主要分布在免疫淋巴组织与内皮细胞[12]。而Duox1和Duox2则主要与甲状腺的合成关系密切[13]。在这7种NOX中，NOX4由于广泛分布在肾脏血管、系膜细胞、肾小管、足细胞中，因此被认为与肾脏病的发展关系密切。在糖尿病肾病患者体内NOX4被持续激活，产生大量H2O2[14]。

在糖尿病肾病的发病过程中，NOX的过度表达是造成肾脏系膜细胞基质聚集、肾脏纤维化、足细胞损伤的主要原因之一。Eid AA等[15]证实高糖促进NOX1和NOX4的表达升高，引起足细胞的氧化应激损伤，从而导致蛋白尿的产生。Liu GC等[16]发现敲除p47（phox-/-）后，小鼠糖耐量明显提高，并且肾脏氧化应激损伤，系膜细胞增生及肾小球肥大等病理改变明显减轻。Satoshi Kinugasa等[17]证明体内ROS过量表达可以导致肌动蛋白降解从而会引起足细胞的损伤，增大裂隙膜，导致蛋白的漏出，而通过抑制NADPH亚基p47phox和p67phox，则可以有效减少蛋白尿和延缓糖尿病肾病进展。Hwang I等[18]研究证实血浆游离脂肪酸可以促进体内ROS的表达，而过氧化氢酶和乙酰半胱氨酸则可以有效降低ROS的表达，并对肾脏起到一定的保护作用。Persson P等[19]证实，抑制肾脏NOX表达，可以有效提高肾小球滤过率，降低肾皮质和髓质的耗氧量，同时还可以促进肾小管对Na+的排出，有效保护肾功能。

2　eNOS解偶联促进肾脏病的发展

体内所有的一氧化氮合酶（n i t r i c o x i d e synthases，NOS）具有相同的结构，均是由可以结合NADPH，黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）和FAD的C端还原酶结构域和作为加氧酶结构域的N端组成的。研究发现单体NOS不存在生物活性，只有当两个NOS单体形成二聚体时，NOS才会被活化[20]。作为体内NO合成过程中重要的催化物质，NOS广泛存在于各种类型的细胞中。目前已确定3种亚型，分别为神经元型NOS （neuronal nitric oxide synthase，nNOS），诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和内皮型NOS（eNOS），其编码基因分别定位于12、17和7号染色体上[21]。三种NOS亚型在人体的分布各不相同，eNOS主要分布在血管内皮细胞中，

nNOS则广泛分布在致密斑中，iNOS只少量分布在肾脏远曲小管中[22]。在生理状况下，nNOS和eNOS产生少量的NO，分别起神经递质和扩张血管的作用。病理状态下，如高血糖与炎性因子的刺激下，可以导致eNOS的解偶联与iNOS的大量产生，从而产生过量的NO?，通过和由NOX所产生的O2-结合，从而形成具有高度活性和毒性的过氧亚硝酸盐和氧亚硝酸，这些过氧化物可以和蛋白结合形成硝基酪氨酸，从而对组织和细胞造成损害[23]。

糖尿病肾病的发病过程中，eNOS的解偶联与糖尿病肾病的氧化应激损伤关系密切[24]。Huifang Cheng等[25]通过体内和体外研究发现糖尿病肾病发病过程中，eNOS表达量减少会直接导致系膜细胞增生与基底膜增厚，而通过外源性给入eNOS的前体物质，可以有效缓解ROS所致的肾损害。四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）对于eNOS 生物功能的发挥起着至关重要的作用。BH4可以提供电子给加氧酶的铁氧复合物从而使eNOS保持稳定，在这一反应中转变为质子化的BH4可以迅速被从黄素类一氧化氮合酶转移来的电子还原，当BH4生成不足时，黄素类一氧化氮合酶电子传递链与L-精氨酸氧化脱偶联，从而导致了NOS生成O2-，而不是生理状态下的NO，同时BH4也被氧化成BH2。近年来的研究发现BH2与BH4对eNOS 具有相同的亲和性，糖尿病肾病患者BH2表达升高，这也是导致BH4与eNOS解偶联的原因之一[26]。Minoru Satohd等[27]发现BH4含量减少，可以引起肾小球内eNOS解偶联与NOX表达升高，从而造成肾小球的氧化应激损伤。

3　AGEs刺激NOX的表达

晚期AGEs是非酶糖化反应的终末期产物，生理状态下人体内存在少量的AGEs，可以通过肾脏清除体外，高血糖则能明显加速体内AGEs的形成。肾脏的血管、肾小球基底膜、系膜等结构含有大量胶原蛋白，易形成AGEs，使得肾脏更易受到AGEs的损害[28]。体内AGE过量可以促进血管内O2-的表达，从而造成血管内皮细胞的氧化应激损伤。肾脏组织内的AGE及其受体RAGE过表达，可以激活PKCα，从而能导致P47phox的磷酸化，引起NOX表达上调，最终导致过量ROS的产生[29]。糖尿病患者，肾脏组织内过量葡萄糖可以自身氧化，在代谢应激和蛋白非酶促糖基化形成AGEs的过程中即可释放大量的ROS，而AGEs又可通过与细胞表面的特异性受体结合使细胞内产生大量的ROS，加重糖尿病肾病的进展[30]。Christos Tikellis 等[31]研究发现，AGE及其受体可以诱导体内NOX 的活化从而导致组织氧化应激损伤。Xue Gao等[32]研究发现AGE/RAGE可以提高NOX亚基NOX-2，p22phox和p40phox的表达，从而引起了血管内皮细胞的氧化应激损伤。

4　Ang Ⅱ促进NOX表达

肾素血管紧张素醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是由一系列多肽蛋白和酶组成，主要包括血管紧张素原、肾素、血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ及其受体等[33]。RAAS过度激活可以导致血管结构和功能损伤。其中由球旁器所分泌的肾素经过ACE剪切后形成的Ang Ⅱ在高血糖所导致的血管氧化应激损伤中发挥着重要的作用。Ang Ⅱ也可以直接刺激NOX多个亚基的激活，导致细胞内ROS和H2O2的产生，并引起线粒体内ROS的积聚[34]。而采用血管紧张素受体拮抗剂（ARB）或者血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类药物可以有效降低体内的氧化应激水平，并且抑制肾脏NOX的表达[35]。

早在1957年人们就提出抑制肾素的分泌可以缓解RAAS系统的过度激活对肾脏的损害[36]。研究发现Ang Ⅱ可以通过G蛋白偶联受体激活NOX1，从而引起内皮细胞功能紊乱[37]。Puvi N. Seshiah 等[38]发现Ang Ⅱ可以上调NOX的表达，从而造成血管内皮细胞O2-，H2O2含量增高，引起血管内皮细胞氧化应激损伤。肾脏足细胞是Ang Ⅱ的靶细胞，通过增加足细胞内Ca+含量与促进氧化应激可以导致足细胞的不可逆的损伤，从而造成了大量蛋白的漏出[39]。Kinoshita Y等[40]发现通过ARB阻断血管紧张素受体Ⅱ，可以减少肾小管NOX的表达，有效缓解肾小管的氧化损伤。Gandhi S等[36]

发现采用阿利克仑和奥美沙坦联合可以显著抑制大鼠RAAS的过度激活，降低大鼠NOX的过度表达，对肾脏具有明显的保护作用。近年来研究发现血管紧张素还可以下调内皮细胞二氢叶酸还原酶（DHFR）的表达，引起BH4生成减少，直接导致了eNOS的解偶联，加重肾脏损伤[41]。

5　结语

高血糖引起的氧化应激在糖尿病肾病的发生、发展过程中起到重要的作用。在高糖环境下，机体一方面清除氧自由基的酶活性降低，另一方面体内的氧化应激作用增强，造成了体内大量活性氧自由基的积聚，导致活性氧连锁反应，从而促进糖尿病肾病及其他并发症的发生和发展[42]。NOX作为体内产生O2-的主要来源，对于糖尿病肾病的干预治疗起到关键作用。目前对于糖尿病肾病氧化应激损伤尚无效果理想的干预措施，且由于线粒体蛋白糖基化，引起细胞对高血糖的记忆效应，因此在糖尿病肾病的治疗过程中，应该更加强调在糖尿病初期进行严格的血糖控制和有效的生活方式干预，抑制过氧化物的产生，减轻肾脏的氧化应激损伤。

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收稿日期：2012-08-09

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