酶工程实验(2010)

实验一植物体内过氧化物酶活性的测定

一、目的

过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。

二、原理

在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：植物叶片

2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。

3. 试剂及配制：

0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。

反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。

四、实验步骤

1. 酶液提取

称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。

2. 酶活性测定

吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。

五、酶活性计算

按下式计算酶的相对活性

△A470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————

样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）

实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)

原理】

临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对

淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉

溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活

力单位.

试剂和器材】

1,0.9%氯化钠

2,0.1%淀粉

3,碘化钾—碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使

用前稀释10倍)

4,移液管

5,试管

6,恒温水浴锅

操作】

1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升.

2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合

(若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,

然后任其流出.反复三次,使全管混匀.

从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管……依

次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,

1/4,1/8……1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作

为对照管.

3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%

淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37℃,并记录时

间.注意保持水浴的温度.

4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管

中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的

色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中

间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.

计算】

选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为

黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫

升.即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,

1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中

所含淀粉酶的活性为32个活力单位.

实验三超氧物歧化酶活性的测定

超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21]。

(一)原理

超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自

由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

(二)材料、仪器设备及试剂

1. 材料：新鲜苎麻叶片

2. 仪器设备：

(1) 研钵(预冷)；

(2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有

限公司)；

(3) PUS-2018型半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)；

(4) 移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml各数支）；

(5) 日光灯（反应试管处照度为4 000Lx）；

(6) 试管数支；

(7) 洗耳球。

3. 试剂：

(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）: A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移

到250ml容量瓶中，定容。B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml 容量瓶中，定容。C.将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中，用量筒量取23ml后加入同一烧杯中，用pH试纸调节其pH值至7.8；

(2) 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至

100ml；

(3) 750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定

容至100ml，避光保存；

(4) 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721g EDTA－Na2用磷酸缓冲液定

容至1 000ml；

(5) 20μmol/L核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1 000ml

避光保存。

(三)实验步骤

1. 酶液提取

取取被不同浓度NaCl溶液处理过的苎麻叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中。加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5ml于10 000r/min下离心12min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应

取试管（要求透明度好）4支，1支为对照管，另3支为测定管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met溶液0.3ml, 750μmol/L NBT溶液0.3ml,100μmol/L EDTA－Na2液0.3ml，20μmol/L 核黄素0.3ml,蒸馏水0.25ml和0.05ml酶提取液，对照管以缓冲液代替酶液;总体积为3.0ml。各管于4 000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。列表如表1:

表1.试剂用量表

试剂（酶）用量(ml) 终浓度（比色时）

0.2mol/L磷酸缓冲液 1.5

130mmol/L Met溶液0.3 13mmol

750μmol/L NBT溶液0.3 75μmol

100μmol/L EDTA-Na2液0.3 10μmol

20μmol/L核黄素0.3 2.0μmol

酶液0.05 空白加缓冲液代替酶液

蒸馏水0.25

总体积 3.0

3. SOD活性测定与计算

至反应结束后，以未加酶液处理的对照管做空白，分别在560nm测定其它各管的吸光度值。

(四)结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性＝(A CK－A E)×V/(A CK×0.5×W×V t) 公式(1)

式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；A CK照光对照管的吸光度,A E样品管的吸光度；V样品液总体积（ml）；V t测定时样品用量（ml）；W样鲜重（g）。

实验四过氧化氢酶活性的测定

过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法[21]。

(一)原理

过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。CA T酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示.在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量：

5H2O2 +2KMnO4+4H2SO4→5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

(二)材料、仪器设备及试剂

1. 材料：新鲜苎麻叶片

2. 仪器设备

(1) 研钵；

(2) 三角瓶；

(3) 酸式滴定管；

(4) HH-4数显恒温水浴(30℃)(国华电器有限公司)；

(5) 容量瓶(250ml)；

(6) 试管数支；

(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海)有限公司)。

2. 试剂

(1) 10%H2SO4（自配）；

(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配)；

(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4 3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水配

制成1 000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；

(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1 000ml，用标准0.1mol/L

KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；

(5) 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，

定容至1 000ml。

(三)实验步骤

1. 酶液提取

取叶片2.5g(去叶脉)加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，10 000r/min离心12min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2. 显色反应

取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计算时间，于30℃恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。然后用0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30秒内不消失）为终点。

(四)结果

酶活性用每g鲜重样品10min内分解H2O2的mg数表示：

过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×V T/(W×V S×1.7) 公式(2) 式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；V T提取酶液总量（ml）；V S反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）。