IFN-γ、IL-32、IL-1β在原因不明习惯性流产中的临床意义
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转 染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹 【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染 ［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.
医疗技术临床应用管理办法版
医疗技术临床应用管理办法 （2018版） 第一章总则 第一条为加强医疗技术临床应用管理，促进医学科学发展和医疗技术进步，保障医疗质量和患者安全，维护人民群众健康权益，根据有关法律法规，制定本办法。 第二条本办法所称医疗技术，是指医疗机构及其医务人员以诊断和治疗疾病为目的，对疾病作出判断和消除疾病、缓解病情、减轻痛苦、改善功能、延长生命、帮助患者恢复健康而采取的医学专业手段和措施。本办法所称医疗技术临床应用，是指将经过临床研究论证且安全性、有效性确切的医疗技术应用于临床，用以诊断或者治疗疾病的过程。 第三条医疗机构和医务人员开展医疗技术临床应用应当遵守本办法。 第四条医疗技术临床应用应当遵循科学、安全、规范、有效、经济、符合伦理的原则。安全性、有效性不确切的医疗技术，医疗机构不得开展临床应用。 第五条国家建立医疗技术临床应用负面清单管理制度，对禁止临床应用的医疗技术实施负面清单管理，对部分需要严格监管的医疗技术进行重点管理。其他临床应用的医疗技术由决定使用该类技术的医疗机构自我管理。 第六条医疗机构对本机构医疗技术临床应用和管理承担主体责任。医疗机构开展医疗技术服务应当与其技术能力相适应。医疗机构主要负责人是本机构医疗技术临床应用管理的第一责任人。 第七条国家卫生健康委负责全国医疗技术临床应用管理工作。县级以上地方卫生行政部门负责本行政区域内医疗技术临床应用监督管理工作。 第八条鼓励卫生行业组织参与医疗技术临床应用质量控制、规范化培训和
技术评估工作，各级卫生行政部门应当为卫生行业组织参与医疗技术临床应用管理创造条件。 第二章医疗技术负面清单管理 第九条医疗技术具有下列情形之一的，禁止应用于临床（以下简称禁止类技术）： （一）临床应用安全性、有效性不确切； （二）存在重大伦理问题； （三）该技术已经被临床淘汰； （四）未经临床研究论证的医疗新技术。禁止类技术目录由国家卫生健康委制定发布或者委托专业组织制定发布，并根据情况适时予以调整。 第十条禁止类技术目录以外并具有下列情形之一的，作为需要重点加强管理的医疗技术（以下简称限制类技术），由省级以上卫生行政部门严格管理：（一）技术难度大、风险高，对医疗机构的服务能力、人员水平有较高专业要求，需要设置限定条件的； （二）需要消耗稀缺资源的； （三）涉及重大伦理风险的； （四）存在不合理临床应用，需要重点管理的。国家限制类技术目录及其临床应用管理规范由国家卫生健康委制定发布或者委托专业组织制定发布，并根据临床应用实际情况予以调整。省级卫生行政部门可以结合本行政区域实际情况，在国家限制类技术目录基础上增补省级限制类技术相关项目，制定发布相关技术临床应用管理规范，并报国家卫生健康委备案。 第十一条对限制类技术实施备案管理。医疗机构拟开展限制类技术临床应用的，应当按照相关医疗技术临床应用管理规范进行自我评估，符合条件的可
小鼠γ干扰素IFN-γ试剂盒使用方法
小鼠γ干扰素(IFN-γ)试剂盒使用方法 检测范围：96T 30ng/L -800 ng/L 使用目的： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中γ干扰素(IFN-γ)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠γ干扰素(IFN-γ)水平。用纯化的小鼠γ干扰素(IFN-γ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入γ干扰素(IFN-γ)，再与HRP标记的γ干扰素(IFN-γ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠γ干扰素(IFN-γ)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶 2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（1600ng/L）0.5ml×1瓶 3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份 5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张 6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 800 ng/L 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 400 ng/L 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 200 ng/L 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 100 ng/L 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 50 ng/L 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
配制溶液的一般实验步骤
配制溶液的一般实验步骤 配制溶液步骤因配置的溶液不同而有所不同，现举两个例 子： 举例 1：配置 0.05mol/L ，400mL NaOH 溶液的步骤：要准确配置氢氧化钠的浓度，则要用容量瓶定容，实验室没有 400 毫升的容量瓶，则选用 500 毫升的容量瓶。 1.计算需要氢氧化钠的质量：0.5L*0.05mol/L*40.01=1.000 克 2.称 1.000 克氢氧化钠于烧杯中，加少量水溶解，然后倒入 500 毫升容量瓶里，分 3 次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里，最后用水稀释至刻度线，摇匀，即，得到 0.05mol/L 的氢氧化钠溶液。 如果不需要很准确的话，可以直接用量筒量 400 毫升，称的时候只要称 0.8 克就可以了。举例 2：配置 1.5mol/L 的稀硫酸 200mL 步骤： 第 1 步：计算：根据 C1V1=C2V2 ，计算需要浓硫酸的体积；第 2 步：量取，利用刻度吸管吸取需要浓硫酸的体积；第 3 步：稀释，将浓硫酸转移到小烧杯中，加少量水稀释；第 4 步：转移 , 待溶液温度降低后，将烧杯中的硫酸转移到 200mL 容量瓶中； 第 5 步：洗涤，洗涤小烧杯，和转移的时候用到的玻璃棒， 至少三次，将洗涤的水一并转移到容量瓶中； 第 6 步：定容，加水定容到刻度线，在距离刻度线一厘米左右改
用胶头滴管定容； 第 7 步：摇匀 ,将溶液摇匀 ,如果液面下降也不可再加水定容；第 8 步：将配得的溶液转移至试剂瓶中，贴好标签；举例 3：配制 500mL ，0.1mol/L 碳酸钠溶液步骤及注意事项所需的仪器：烧杯、容量瓶、玻璃棒、胶头滴管、分析天平、药匙、量筒步骤：第一步：计算：所需碳酸钠的质量 =0.5*0.1*106=5.3 克；第二步：称量：在天平上称量 5.3 克碳酸钠固体，并将它倒入小烧杯中；第三步：溶解：在盛有碳酸钠固体的小烧杯中加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使其溶解；第四步：移液：将溶液沿玻璃棒注入 500mL 容量瓶中；第五步：洗涤：用蒸馏水洗烧杯2?3次，并倒入 容量瓶中；第六步：定容：倒水至刻度线 1?2cm处改用胶头滴管滴到与凹液面平直；第七步：摇匀：盖好瓶塞，上下颠倒、摇匀；第八步：装瓶、贴签；误差分析：固体药品的称量与液体药品的量取是否准确；把溶液向容量瓶中转移，溶液洒了；未洗涤烧杯和玻璃棒；用待配液润洗了容量瓶；定容时水加多了或加少了；定容时未平视刻度线。仰视、俯视对溶液浓度有何影响？★俯视刻度线，实际加水量未到刻度线，使溶液的物质的量浓度增大；★仰 视刻度线，实际加水量超过刻度线，使溶液的物质的量浓度 减小。市售盐酸密度1.19,质量分数36%?38%以37%计 算：步骤： 1.计算：假若需要 2mol/L 的硫酸 100mL ，则需 37%
构建目的基因的真核表达载体实战操作
构建目的基因的真核表达载体实战操作 最后更新：2010-5-16 阅读次数：451 【字体：小中大】 目的：构建目的基因的真核表达载体 一.PCR扩增得到目的片段 1.引物的设计与合成： 这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基），后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。 现在想想，有几点教训： (1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样 (2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾 （3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起 2.Pfu酶扩增： （1）扩增效率低的问题： 往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。 （2）pfu保真性的问题： 即使是pfu，也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。 3．cDNA模板的问题： 在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板，因此在开始要准备足够的cDNA。100ul，200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA 的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。 二．酶切的问题： 用于构建的酶切一定要非常充分！ 新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。 三．PCR产物直接酶切：
肠外营养药物临床使用规范
肠外营养药物临床使用规范 一、总则 1、肠外营养药物ICU临床应用较广。为规范其临床使用，保障患者用药安全，参考《临床诊疗指南：肠外肠内营养学分册（2008版，中华医学会编）》及相关规定，制定本规范。 2、临床营养支持（nutrition support， NS）是指经口、肠道或肠外途径为患者提供较全面的营养素。目前临床上包括肠内营养（enteral nutrition， EN）支持和肠外营养（parenteral nutrition，PN）支持。肠内营养是指经消化道给以较全面的营养素；肠外营养是经静脉为无法经胃肠道摄取或摄取营养物不能满足自身代谢需要的患者提供包括氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素及矿物质在内的营养素，以抑制分解代谢，促进合成代谢并维持结构蛋自的功能。所有营养素完全经肠外获得的营养支持方式称为全肠外营养（total parenteral nutrition，TPN）。 3、按照循证医学原则，以当前最佳证据为依据，按照系统和规范方法，对临床营养支持按A、B、C、D四级进行推荐使用。最高等级（A）的推荐至少有一项随机对照研究；最低等级（D）的推荐以专家观点为基础，包括无研究证据的共识意见（附表一）。 二、确定毎天的营养素需要量，是营养支持的基本要求。肠外营养因缺乏人体自身调节的过程，使用不当可造成营养素过量；但若补充过少，则又可能导致营养状况的进一步恶化。故应进行个体化营养评估。成人营养素需要量推荐意见如下： 1、确定营养素需要量应当根据疾病状况、体重与体成份组成、生理功能变化等方面进行个体化评估，制定合理化配方。（B） 2、大部分住院病人实际能量消耗通常低于经典的方程式或教科书上的公式推算出来的值。（D） 3、在败血症或创伤的急性代谢期，不主张采用高热卡营养支持获得正氮平衡或氮平衡。（C） 4、允许性低摄入有益于围手术期患者临床结局。（A） 5、水、电解质生理需要量是维持生命所必需。（A） 6、无论肠内或肠外营养支持患者，都需要监测出入液量、水肿或脱水症状体征、血电解质水平等，并及时调整补充剂量，根据病情，选择肠内或肠外途径补充。（A） 7、重症疾病状态下是否需要增加维生素与微量元素的供给量，目前无确定性结论。在合理用药的前提下，可参照美国FDA推荐剂量，根据医生的判断，结合患者需求，调整部分维生素的应用剂量。（D） 三、对于住院患者可行营养风险筛查（NRS 2002，2002年欧洲肠外肠内营养学会大会推出，营养风险筛查评分简表见附表二）。 对于总评分大于等于3分的住院患者结合临床要求制定营养支持计划；对评分暂时低于3分者，可以定时进行再次营养风险筛查。推荐意见如下：
人γ干扰素IFN-γ试剂盒使用方法
人γ干扰素(IFN-γ)试剂盒使用方法 检测范围：96T 10 ng/L -400 ng/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中γ干扰素(IFN-γ)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人γ干扰素(IFN-γ)水平。用纯化的人γ干扰素(IFN-γ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入γ干扰素(IFN-γ)，再与HRP标记的γ干扰素(IFN-γ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人γ干扰素(IFN-γ)浓度。 试剂盒组成 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。
液体配制及实验方法
（一）液体配制 1.完全培养基 DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液） 若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺 2.PBS 1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4 3.胰酶 用之前调节PH值至7.6 4.CaCl2 将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液 每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性 5.双抗 终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml 青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位 称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml 6.两性霉素B 100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液 每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml 7.细胞冻存液 20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS) 8STZ溶液 STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中 称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕. 9油红O 原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。 稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。 10茜素红 称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.
(2008)pcDNA3_hNGFb真核表达载体的构建及其表达
?学术交流?pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达 邓兴力 杨智勇 董坚 王廷华 徐丹 冯忠堂 【摘要】 目的 构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表 达。方法 以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2 NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和 western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。结果 R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒 pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人 N GF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其 前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb, 为后续的研究奠定基础。 【关键词】 神经生长因子; 真核表达; 重组质粒; 转染 C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong, DO N G J ian,et al. De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming Medical College,Kunming650032,China 【Abstract】 Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3- hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods The cDNA of human nerve growth factor beta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombination technique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2 nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2 binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-β was analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults The R T-PCR product is 750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into 750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with human N GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressed successfully in L929cells.Conclusions The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructed successfully,which will provide the foundation for f urther research. 【K ey w ords】 Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection 中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022******* 神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。N GF在体内首先以其前体的形式合成,随后在各种蛋白酶的作用下裂解为成熟体[1]。最近研究表明,N GF前体(p roN GF)具有与成熟N GF相反的生物学活性,其通过作用于p75N TR受体及sortilin受体介导包括神经细胞内的多种细胞凋亡[2-5]。本研究将构建人N GF-β基因真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,并研究其在L929细胞中的表达情况,为进一步研究p roN GF的 作者单位:650032昆明医学院第一附属医院神经外科(邓兴力,杨志勇),生物治疗中心(董坚);昆明医学院神经科学研究所(王廷华、徐丹、冯忠堂) 作者简介:邓兴力(1979-),男,博士研究生。研究方向:细胞移植治疗帕金森病的研究。 通讯作者:冯忠堂 fzt@https://www.360docs.net/doc/fd12253333.html, 生物学功能奠定实验基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、细菌与脑组织 真核表达质粒载体pcDNA3由昆明医学院第一附属医院生物治疗研究中心保存;小鼠成纤维细胞系L929、E.coli D H5α由昆明医学院神经科学研究所保存;人脑肿瘤旁组织由昆明医学院第一附属医院神经外科提供。 1.1.2 主要试剂与工具酶 TRIzol,Lipofectamine 2000Reagent,G418,RPM I1640培养基,小牛血清(Invitrogen);Hind,xho,T4DNA Ligase,Calf In2 testine Alkaline Phosp hotase,First Strand cDNA Synt hesis K it,High Fidelity PCR Enzyme Mix(MB I Fermentas);凝胶回收试剂盒,DNA纯化试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(OM EGA);DNA MA KER DL2000,DNA MA KERλ-Eco T14(Takara);6×
常见疾病抗菌药物临床应用规范
常见疾病抗菌药物临床应用规范 一、急性细菌性上呼吸道感染（急性咽炎及扁桃体炎） 1、抗菌药物选择：青霉素类（青霉素、哌拉西林、阿莫西林） 头孢菌素类（头孢呋辛） 大环内酯类（红霉素、罗红霉素、阿奇霉素） 其他类（克林霉素） 2、选药依据：患者有病毒感染的同时有溶血性链球菌感染、流感嗜血杆菌等感染。 3、用药时机：体温超过38.3℃，血常规：白细胞总数>10×10/L，中性粒细胞百分数>70％。抗病毒对症治疗未见好转。 4、用药疗程： 青霉素400万-1200万单位或哌拉西林8克或阿莫西林2克，每日分2次静脉滴注，3至7天。 青霉素过敏者选用口服每日红霉素1-2克或罗红霉素150毫克或阿奇霉素（限制使用级）0.5克，用药3至7天。 克林霉素0.9克每日一次静脉滴注，用药3至7天，热退后口服3天。头孢呋辛0.5克，每日2次口服，用药3至7天。 二、急性气管-支气管炎 1、抗菌药物选择：青霉素类（青霉素、哌拉西林、阿莫西林）头孢菌素类（头孢呋辛）大环内酯类（红霉素、罗红霉素、阿奇霉素）其他类（克林霉素）氟喹诺酮类（左氧氟沙星） 2、选药依据：患者有病毒感染同时有流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、葡萄球菌感染。
3、用药时机：白细胞明显增高、胸部X线改变明显，患者有原发病不能承受轻微感染者， 4、用药疗程： 青霉素400万-1200万单位或哌拉西林8克或阿莫西林2克，每日分2次静脉滴注，3至7天。 青霉素过敏者选用口服每日红霉素1-2克或罗红霉素150毫克或阿奇霉素（限制使用级）0.5克，用药3至7天。 克林霉素0.9克每日一次静脉滴注，用药3至7天，热退后口服3天。头孢呋辛0.5克，每日2次口服，用药3至7天。 左氧氟沙星0.3，每日一次静脉滴注，用药3至7天。 三、慢性阻塞性肺病 1、抗菌药物选择：青霉素类（青霉素、哌拉西林、阿莫西林）头孢菌素类（头孢哌酮／舒巴坦钠）大环内酯类（阿奇霉素）氟喹诺酮类（左氧氟沙星） 2、选药依据：痰、血病原菌培养和药敏试验。 3、用药时机：患者有气急加重、痰量增加、脓性痰。 4、用药疗程： 青霉素400万-1200万单位或哌拉西林8克或阿莫西林2克，每日分2次静脉滴注，7至14天。 头孢哌酮／舒巴坦钠（限制使用级）1.5克，每日2次静脉滴注，7至14天。 阿奇霉素（限制使用级）0.5克，每日1次静脉滴注，7至14天。左氧氟沙星0.3，每日2次静脉滴注，用药7至14天。 四、肺炎
小鼠γ干扰素(IFN-γ)说明书
小鼠γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清,血浆及相关液体样本中γ干扰素(IFN-γ)含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠γ干扰素(IFN-γ)水平。用纯化的小鼠γ干扰素(IFN-γ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入γ干扰素(IFN-γ)，再与HRP标记的γ干扰素(IFN-γ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠γ干扰素(IFN-γ)含量。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后， 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞
计算机网络实验《交换机基本配置》
实验一交换机基本配置 一、实验目的 1.掌握桌面网络组建方法 2.掌握Quidway S 系列中低端交换机几种常见配置方法 二、实验内容 1.通过Console 口搭建配置环境 2.通过Telnet 搭建配置环境 3.熟悉VRP 的各种视图及各视图下的常用命令 三、实验原理、方法和手段 1. 交换机配置方式 交换机通常的配置方式有：Console 方式,telnet 方式,web 方式和modem 拨号方式 2. 命令行接口Command-line Interface 华为网络设备中运行的操作VRP向用户提供一系列配置命令以及命令行接口，方便用户配置和管理网络设备，包括以太网交换机。命令行有如下特性： 1)通过Console 口进行本地配置 2)通过telnet 进行本地或远程配置 3)通过modem 拨号登录到网络设备进行远程配置 4)配置命令分级保护，确保未授权用户无法侵入到网络设备 5)用户可以随时键入以获得在线帮助 6)提供网络测试命令，如tracert、ping 等，迅速诊断网络是否正常 7)提供种类丰富、内容详尽的调试信息，帮助诊断网络故障 8)用telnet 命令直接登录并管理其它网络设备 9)提供ftp 服务，方便用户上载、下载文件 10)提供类似Doskey 的功能，可以执行某条历史命令 11)命令行解释器对关键字采取不完全匹配的搜索方法，用户只需键入无冲突关键 字即可解释 四、实验组织运行要求 1.熟悉实验内容； 2.要求独立完成实验，教师可以给予一定的辅导； 五、实验条件 1.华为Quidway S/思科Catalyst 2960/中兴ZXR10 交换机 2.计算机一台即可 六、实验步骤 1.通过Console 口搭建配置环境 1)如图1-2，建立本地配置环境，只需将微机（或终端）的串口通过配置电缆与 以太网交换机的Console 口连接。
医疗技术临床应用管理办法(2018.09.14)
医疗技术临床应用管理办法 发布时间：2018-09-14 中华人民共和国国家卫生健康委员会令第1 号 《医疗技术临床应用管理办法》已经原国家卫生计生委委主任会议讨论通过，并经国家卫生健康委审核通过，现予公布，自2018年11月1日起施行。 主任马晓伟 2018年8月13日医疗技术临床应用管理办法 第一章总则 第一条为加强医疗技术临床应用管理，促进医学科学发展和医疗技术进步，保障医疗质量和患者安全，维护人民群众健康权益，根据有关法律法规，制定本办法。 第二条本办法所称医疗技术，是指医疗机构及其医务人员以诊断和治疗疾病为目的，对疾病作出判断和消除疾病、缓解病情、减轻痛苦、改善功能、延长生命、帮助患者恢复健康而采取的医学专业手段和措施。 本办法所称医疗技术临床应用，是指将经过临床研究论
证且安全性、有效性确切的医疗技术应用于临床，用以诊断或者治疗疾病的过程。 第三条医疗机构和医务人员开展医疗技术临床应用应当遵守本办法。 第四条医疗技术临床应用应当遵循科学、安全、规范、有效、经济、符合伦理的原则。 安全性、有效性不确切的医疗技术，医疗机构不得开展临床应用。 第五条国家建立医疗技术临床应用负面清单管理制度，对禁止临床应用的医疗技术实施负面清单管理，对部分需要严格监管的医疗技术进行重点管理。其他临床应用的医疗技术由决定使用该类技术的医疗机构自我管理。 第六条医疗机构对本机构医疗技术临床应用和管理承担主体责任。医疗机构开展医疗技术服务应当与其技术能力相适应。 医疗机构主要负责人是本机构医疗技术临床应用管理的第一责任人。 第七条国家卫生健康委负责全国医疗技术临床应用管理工作。 县级以上地方卫生行政部门负责本行政区域内医疗技术临床应用监督管理工作。 第八条鼓励卫生行业组织参与医疗技术临床应用质量
实验1-UTM-web基本配置实验
实验1-UTM-web基本配置实验
步骤一. 接口加入安全区域 首先通过IE浏览器登陆UTM web界面：http://192.168.0.1 输入默认用户名/密码：admin/admin和验证码（不区分大小写）进入： 在左侧导航栏中点击“设备管理 > 接口管理”。
点击GE0/1栏中的按钮，进入“接口编辑” 界面。按照下图设置接口GE0/1，点击< 确 定 >返回“接口管理”界面。 GE0/1加入trust域 点击左侧导航栏“设备管理 > 安全域”。
点击Trust栏中的按钮，进入“修改安全域” 界面。按照下图将接口GE0/1加入Trust域， 点击< 确定 >返回“安全域”界面。 步骤二. 配置管理 2.1配置保存 在“设备管理 > 配置管理> 配置保存”页面， 点击< 确定 >按钮，即可将当前的配置信息保 存，页面提示设备正在保存当前配置。
如果想将配置文件加密，可以选中“加密配置文件”前面的复选框。 2.2配置备份 在“设备管理 > 配置管理> 配置备份”页面，点击< 备份 >按钮。 在弹出对话框中选择保存的路径，输入文件名保存即可。 2.3配置恢复 在“设备管理 > 配置管理> 配置备份”页面，点击< 浏览 >按钮，选择备份文件。
点击< 确定 >按钮，配置文件导入成功后，页 面会显示下面的提示信息，恢复的配置文件在 设备会下次启动后生效。 2.4恢复出厂配置 在“设备管理 > 配置管理> 恢复出厂配置”页面，点击< 恢复出厂配置 >按钮，选择备份文件。 步骤三. 软件升级 在“设备管理 > 软件升级”页面，点击< 浏览 >按钮，选择升级版本的路径，点击< 确定 >按钮。
干扰素(IFN)
干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 目录 1干扰素 2干扰素简介 3治疗有效率 4干扰素多少钱 5发现 6什么叫干扰素（IFN） 7品种及价位 8作用机制 1.8.1 ①间接性 2.8.2 ②广谱性 3.8.3 ③种属特异性 4.8.4 ④发挥作用迅速 1干扰素 药物类别：抗肿瘤药，抗病毒药；所属类别：生物反应调节剂 药物名称：干扰素英文名称：Interferon 药物别名：序号中文别名英文别名 一．α干扰素 制剂/规格：序号制剂规格 1．注射剂5×10。单位（1 ml）；1×106。单位（1 ml）； 2．冻干剂l×10。单位 成份/化学结构：序号成份化学结构 药理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。当病毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰素亦可缓解感染。
2．抑制细胞增殖干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。 3．诱导细胞凋亡：干扰素可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。 4.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。 药动学：干扰素在肌内注射或皮下注射后入血的速度较慢，需较长时间才能在血中测到。肌内注射后Tmax为5～8小时。一次肌注：106单位，血清浓度为100单位/ml，这比在病毒感染时自然产生的干扰素量为高。循环中的干扰素半衰期为2～4小时。只有少量干扰素能进入血脑屏障，脑脊液内的浓度约为血内浓度的l/30，只有在兔身上研究过排泄，排出量只有0.2%～2.0%。 适应症：1.用于多种恶性肿瘤，包括毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。 2．与其他抗肿瘤药物并用。 3．作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。 4．病毒性疾病的防治。 用法用量： 多采用皮下注射、肌注、脑脊髓腔内或腹腔内、局部灌注给药。一般剂量多用一次1×106～3×106单位，皮下注射或肌注，每周3次，可连用数月或更长。可根据病情逐渐增减剂量。该药有时间依赖性，长时间保持有效浓度，抗癌效果较好（即连续治疗为佳）。 不良反应： 1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发热和不适。剂量超过44×104单位/m2时，注射2～6小时后即可出现发热。随着疗程延长，发热可逐渐减轻，一般7天后可停止发热。为避免发热，事先可使用醋氨酚。若仍发热，与IF-α含杂质有关，不宜再用。 2．骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞减少。减少剂量在8.5×104单位/m2以下，可减轻骨髓抑制发生。 3．局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，24小时后即可消退。 4．其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。 相互作用：泼尼松或其他皮质激素有降低干扰素生物活性的作用，应予注意。 注意事项：1.心肌梗死、重症高血压、脑血管疾病慎用。 2．如发现冻干制剂萎缩、变色，液体制剂混浊、有异物或不溶性沉淀等均不宜使用。