环氧化物水解酶
微生物环氧化物水解酶
引言
环氧化物水解酶广泛分布于动物界（包括人类），在肝脏中，环氧化物水解酶主要分布在内质网网上，最近的研究表明，它也分布于肝细胞的核膜、胞浆中，而在环氧化物酶体、溶酶体和线粒体中缺失。
环氧化物水解酶以多种同工酶形式存在，酶的单体相对分子量为
48k-54k之间，没有血红蛋白和黄素做辅基。
环氧化物水解酶也可催化内源性和外源性的环氧化物，其中对内源性环氧化物的速率远大于外源性的环氧化物。因为环氧化物水解酶在致癌物的形成中扮演一定角色，所以被作为肝癌的早期标志二受到广泛关注！
环氧化物(epoxide)在多种生物体的代谢过程中广泛存在，又在多种生物活性物质的合成中被广泛应用，它们是一类很有价值的手性有机合成砌块和中间体。环氧化物具有环氧乙烷三元环，该环中各原子的轨道由于不能在正面充分重叠，而是以弯曲键连接，因而具有较强的张力，其碳氧键具有很强的亲电性，故其能与各种亲核试剂反应，通过选择性开环及官能团转换，就可以很方便地合成很多种光学活性物质，而且它们的反应活性高，其开环反应中通常具有极好的位置选择性和立体选择性。
环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)又称环氧化物水合酶(epoxide hydratase)或环氧化物水化酶(epoxide hydrolase)，能立体选择性地将水分子加到环氧底物上生成相应的手性1,2-二醇。应用此酶，能够得到具有光学活性的剩余环氧化物和相应的二醇化合物。该酶在生物体内的外源性化合物代谢中起着重要的作用。因此，环氧化物水解酶在生物体内，尤其是微生物体内，是普遍存在的。
一、选育
对细菌EH的研究最早是在1967年，Schroepfer等人在Pseudomonad(NRRL.2994)中发现了EH，并利用该酶成功催化水解了环氧油酸。此后奥地利的K.Faber研究小组开辟了对微生物环氧化物的研究。
细菌环氧化物水解酶在自然界中普遍存在，分组成型和诱导型两大类。前者的底物适用性较广，可以很高的对映体选择性水解各种2取代的环氧化物，例如：1,1-二取代，2,2-二取代和2,3-二取代，但其比活力都不高，但是对于无分支的末端l,2-环氧化物的选择性较低，且对于内消旋环氧化物的活性较低。后者的底物域相对较窄，是和诱导物结构相似的环氧化物，比活力较高。
对用真菌环氧化物水解酶进行环氧化物的不对称水解反应的研究开始得更早。始于1972年日本Suzuki等人用Helminthospsrum sativwn对一种萜类环氧化物10,11-环氧法呢醇进行对映体
选择性开环。但是对其真正的研究是在1993年由法国的Furstoss等展开的。真菌环氧化物水解酶一般是组成型酶，一般可以用廉价的普通碳源进行大规模培养生产。其底物范围相对较广，对取代脂环族、芳香族和无分支的脂肪族末端l,2-环氧化物具有特别高的立体选择性。其中真菌中的酵母细胞由于培养简便且易于从发酵液中分离，适合大规模的工业化生产，具有良好的应用潜力。研究发现，许多丝状真菌的环氧化物水解酶是组成型酶，其底物范围广，对映体选择性高，尤其是对含有芳香基团、取代脂环基的环氧化物的选择性很高，是一种非常具有潜力的工业用生物催化剂。
二、酶学特性
1 理化特性
(1)温度目前的环氧水解酶基本都是常温酶。通常情况下酶在室温下是比较稳定的，反应温度较低时，适当提高温度，会加速反应的进行，但继续提高反应温度，会导致酶的失活加剧，并极大地降低酶的对映选择性。但也有某些酶，对温度比较敏感，在这种情况下，可选择较低的温度，如在4℃进行酶催化水解反应。
(2)pH 环氧化物比较活泼，在酸性条件下容易自发水解，这种化学水解是非选择性的，它将极大地降低酶催化水解产物的对映选择性(ee值)，这极大地限制了环氧水解酶催化反应的pH范围。此外，过酸性或过碱性的环境也容易引起酶的失活，故环氧水解酶催化的反应，通常都是在中性或偏碱性条件下进行。
(3)助溶剂大部分环氧化物的水溶性很差，添加水互溶性的有机助溶剂可部分地解决这个问题，增强底物的水溶性，消除传质的限制，加速反应的进行。但助溶剂的添加也会造成酶的失活，且随着助溶剂浓度的提高，其失活效应加强。助溶剂对反应的影响是上述两个效应共同作用、平衡的结果。
(4)表面活性剂表面活性剂同样可以提高水不溶性物质在水中的分散度。阴离子表面活性剂会降低酶的活性，同时降低其选择性;两性离子表面活性剂对酶活和选择性有轻微的促进效应;而部分非离子型表面活性剂对酶活和对映选择性有显著的提升作用，尤其是当表面活性剂的浓度远高于临界胶束浓度时，在一定浓度范围内，其对酶活和对映选择性的提升效果随表面活性剂浓度的升高而提高。此外阳离子表面活性剂对酶有较强的负面影响。
(5)底物浓度当酶催化剂/底物一定时，通常随着底物浓度的升高，酶的对映选择性提高，可用界面激活效应进行解释。当底物浓度相同时，通常随着催化剂浓度的提高，反应选择性上升。
2催化特性
(1)对映体选择性(Enantioselectivity)
对映体选择性指环氧水解酶可以选择性地水解底物的某种构型，所筛选的各种酶中，微生物来源的酶普遍优先水解R-构型的环氧化合物，留下S-构型底物，而来源于人体以及几种植物的环氧水解酶则优先水解S-构型环氧化物。
(2)区域选择性(Regioselectivity)
对于大多数酷的动力学拆分来说，在反应过程中对映体中心的绝对构型总是保持不变。但环氧水解酶催化的反应与此不同，环氧化物的酶水解可能通过对环氧乙烷的任一个碳进行攻击而发生，当亲核攻击发生在非取代的碳原子上，产物的绝对构型保持不变;与次相反，当亲核攻击发生在取代的碳原子上，产物的绝对构型发生反转，这种现象也称之为构型逆转。
(3)对映会聚(Enantio convergent)和选择性互补(Selectivity complementary)
对映会聚现象是指使消旋的混合物变成单一的对映体的现象。选择性互补是指两种酶催化同种环氧化物时，一种优先选择R-构型，而另一种优先选择S-构型，则这两种酶是选择性互补酶用两种选择性互补的环氧化合物水解酶共同催化环氧化合物的水解，可以实现对映会聚。
三、催化机制
要研究EH催化环氧化物开环反应的作用机制，就应先对EH的结构进行研究。现在已经有90多种环氧化物水解酶被分离纯化和测序，其中一半以上被确定是蛋白质。从前面的研究结果分析判断，EH结构中的核心部分．亲核基团和组氨酸残基的位置是基本一致的，
不同之处在于羧酸残基的位置。大多数EH属于a/β折叠型水解酶。随着实验设备及技术的不断提高改进，根据序列分析、定点突变和X．射线衍射等实验，研究者们发现了EH的微观结构，如图所示。EH由两个功能域组成：帽子结构和核心结构。帽子结构由五个螺旋组成，其大小在5.59个残基之间，核心结构从N末端到C末端，是由8个D折叠片组成的区域，其长度在16.57个残基之间，具有一个催化性的三元组合，即：一个亲核性的天冬氨酸残基，一个组氨酸残基和一个传递电荷的天冬氨酸残基。
到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应二
醇的反应122刃1。其催化过程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如黑曲
霉EH，如图1．3所示。催化反应从共价结合的乙二醇．单酯．酶中间体开始。首先
位于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶的一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯．酶中间体，酪
氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。通过180标记实验，证实环氧化物水解产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。
已报道的一种黑曲霉环氧化物水解酶的催化中心
到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应二
醇的反应。其催化过程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如黑曲霉EH，如图所示。催化反应从共价结合的乙二醇．单酯．酶中间体开始。首先位于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶的一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯．酶中间体，
酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。通过标记实验，证实环氧化物
水解产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。
前面叙述了EH拆分外消旋环氧化物的两种机制，而并没有涉及EH在拆分
环氧化物时的位置和立体选择性问题。EH拆分环氧化物的实质是一个动力学拆16
分问题。可以理解为EH对外消旋体R和S之一的选择性更高，其被水解为二醇的速度就快，二者水解速度的不同而达到分离尺和S的目的。之间涉及到一个速度差的问题，即动力学拆分，如下所示：S—Lx R—L Y E：魄／昧
当昧大于砖时，说明外消旋体中R水解为二醇的速率大于S。E是对映体
比率，表示拆分的效率，其值越大，说明该酶的对映体选择性越强。
在EH动力学拆分外消旋环氧化物，还涉及到一个手性中心构型改变的问题。
根据上述EH的催化机制，环氧化物水解时有两条不同的途径，如下图1．4所示
Fig．1-4 The two different hydrolyze approaches of epoxide hydrolase
R
(A)被活化的水分子进攻取代较少的手性碳原子时，生成的二醇其手性中
心构型保持不变；
(B)羟基进攻取代较多的手性碳原子时，产物二醇的手性中心构型发生翻
转。
上述两种途径中，羟基都是以反式方式进攻的。只适用于环氧环中只有一个
手性碳原子的情况。若构成环氧环的两个碳原子都是手性分子，则无论羟基的进攻方式如何，产物二醇中的两个碳原子的构型都将发生翻转。
有报道，使用来自A．nige，．和Beauveria sulfurescens两种立体选择性互补的
环氧化物水解酶水解苯乙烯环氧化物，结果得到了ee值大于90％的R型对映体，且实现了得率大于50％[251。
四、应用
早期的研究工作主要集中在哺乳动物细胞中的EH,但是由于哺乳动物的酶量少,来源有限,制约了它的实际运用。随着微生物EH种类的增多,其应用方面的研究也逐渐增多。许多学者使用高的底物浓度和不同的反应体系来扩大拆分外消旋环氧化物的规模。Justine Deregnaucourt等使用A. nigerEH拆分三氟甲基取代苯基环氧化物,采用两相反应体系(有机相-水相体积比为1:5),底物-酶的质量比为58,底物浓度为360g/L (1.8mol/L), 4h后ee值可达到99%。
微生物EH催化生成的有光学活性的环氧化物和二醇是有机合成的重要中间体。常用的催化方式主要有三种:第一,采用单酶法。Daniel P. PienaarD等利用Yarrowia lipolyticaEH获得了许多手性的羟基化杂环类化合物,如S-3-羟基四氢呋喃、S-N-苯基-3-羟基吡咯烷、S-N-苯基-3-乙酰氧基吡咯烷等,它们是合成杂环类药物的重要前体物质。XinJia等使用Sphingomonassp. HXN-200 EH拆分3-氯乙烷、苯基环氧乙烷,生成的S-3-氯苯基环氧乙烷可以进一步合成IGF-1R激酶抑制剂BMS-536924。这种拆分方式的不足在于产率不能超过50%。第二,采用化学-酶法。Cleij等利用A.nigerEH拆分α-2-甲基-2-异丁基苯基环氧先得到S-环氧化物和R-二醇,R-二醇用化学方法可以重新环化为消旋的环氧化物,然后继续拆分,有效地提高了产率。S-环氧化合物开环后,可进一步合成抗炎药物S-2-异丁基苯丙酸(布洛芬),同时得到R-构型的二醇,还可以环化为消旋的环氧化物,然后继续拆分,这样产物的循环利用有效地提高了产率。第三,采用双酶法。Li Cao等利用两种选择性互补的酶(Solanum tuberosum EH和Agrobacterium ra-diobacter AD1 EH)水解苯基环氧乙烷,得到了R-1-苯基-1,2-乙二醇,外消旋的苯基环氧乙烷可达到完全转化。
五、总结
近年来对微生物来源的环氧水解酶的研究引起人们的广泛重视。这不仅是因为它能够高选择性地对一系列环氧化物进行不对称催化水解。而且它无酵大量获得，这使得酶的成本大大降低，且它们具有广泛的自然来源，对环境友好等特点。这一切。都使得微生物来源的环氧水解酶成为当前最有发展前途的不对称环氧开环的方法之一。
U200810275
应用化学0802
朱涛涛
不对称开环反应的研究进展
手性Br?nsted acids催化的环氧/环胺萘的不对称开环反应的研究一．选题的背景及意义 随着人们对手性识别过程和对映体在生物体内不同药理活性的深入研究，对参与生命活动过程的手性化合物，如医药、农药、香料等精细化学品的商品化提出了越来越严格的要求。世界上许多药物分子都是手性化合物。通常只有一个对映体是有效的，而另外的异构体是无效、甚至有毒的。因此，许多药物不允许再以消旋体形式上市，再加上手性药物显著的高附加值，手性药物己经成为制药工业关注的焦点。[1]因此，获得光学纯物质，已经成为当代化学研究人员所面临的最具有挑战性任务之一，并且开发出高效、简洁和绿色的方法制备光学活性化合物引起了很多化学家的兴趣。[2-8]在众多的不对称合成反应中，人们获取具有生物药理活性或其它光学纯化合物最有发展前途的是不对称催化法。不对称催化对映体选择性反应可以通过少量的手性催化剂获取大量光学纯产物。因此，高效不对称催化体系和新型不对称催化反应一直是催化和有机合成领域中最受人们关注的研究方向之一。 环氧化物被公认为有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一。此类化合物易于制备、反应活性高；并且在开环反应中有极好的位置选择性和立体选择性。其中立体选择性开环反应因产生两个邻近的手性中心，所以是不对称合成中极为重要的方法之一。由于环氧化物的不对称开环可以使用对称的内消旋环氧/氮化物和非手性亲核试剂在手性催化剂的存在下进行，因而具有很大的实用价值。此外，通过手性Br?nsted acids催化的环氧/环胺萘的不对称开环反应生成的产物核心结构为 和 在自然界中含这两种核心结构的天然产物有很多。比如：……。它们是许多天然药物的重要组成部分，也是合成手性药物的重要组成板块。总之，环氧化合物的开环反应在有机合成以及药物合成等方面表现出了很多的优越性。如:(l)利用其易于制备和开环的特点，用作保护基;(2)利用开环反应的立体、区域选择性高的特点，选择性地合成有机化合物；（3)利用开环反应将其直接转化为带有新官能团的链状化合物；(4)以小分子开环反应为基础，合成具有生物活性的天然物质。 过渡金属不对称催化已经在不对称合成领域取得了很大的成功，传统的不对称开环反应都是在手性过渡金属催化剂的作用下进行的，但是在产品中痕量重金属的存在制约了其在制药工业界的应用。[9]近年来，由于有机小分子催化剂具有普遍无毒或低毒、高效、高选择性、环境友好以及在空气和水相反应条件中的稳定性被广泛应用于不对称合成中，其中应用最广泛的是手性Br?nsted acids。[5, 10, 11]本课题选用手性Br?nsted acids作为催化剂，旨在高效高选择性的作用于内消旋环氧/环胺萘的不对称去对称化反应中，并且得到相应的产物，从而更好地进行下一步的开环产物的研究。 二、国内外不对称开环反应的发展现状与趋势 总结前人的研究，主要是两种不同类型的环氧化合物开环反应。1、手性过渡金属催化剂催化的不对称开环反应；2、手性有机小分子催化的不对称开环反应。 1、过渡金属催化的不对称开环反应
环氧化物水解酶固定化研究现状
环氧化物水解酶固定化研究现状 1.环氧化物水解酶/来源 环氧化物水解酶(epoxide hydrolase, EH, EC.3.3.2.3)是一种醚水解酶，属于α/β水解酶家族。该酶可用于催化外消旋环氧化物的对映选择性水解，获得高附加值的手性合成中间体—光学纯的环氧化物或者邻位二醇。 细菌:放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter,红球菌Rhodococcus sp.,棒状杆菌Corynebacteriuim sp.,分枝杆菌Mycobacterium paranicasm,卡诺氏菌Nocardia sp.，假单胞菌Pseudomonas NRRLB-2994；（Steinreiber, A. et al., 2001；De Vries et al., 2003；Archelas, A. et al., 2001；Orru, R. V. et al., 2001；Faber, K. et al., 1999） 真菌：黑曲霉Aspergillus niger, 小麦长蠕孢菌Helminthosporum sativum, 白僵菌Beauveria sulfurescens；（Weijers, C. A. et al., 1999；Kim, H. S. et al., 2006；Yeates, C. A. et al., 2006） 酵母菌：粘红酵母Rhodotorulla glutinis; （Kotik, M. et al., 2005）2.固定化EH（酶/细胞）现状 2.1吸附法 Kroutil等在研究来源于卡诺氏菌环氧化物水解酶固定化过程中，通过对比不同载体固定化酶活力回收发现，环氧化物水解酶吸附于DEAE-cellulose（二乙氨基乙基纤维素）上活力提高2倍以上。在固定化过程中混入非离子去垢剂（Triton X-100）可显著提高其热稳定性。(Kroutil et al., 1998)
环氧化物水解酶PvEH3的表达及手性邻二醇的合成
2018年第37卷第5期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·1933· 化 工 进 展 环氧化物水解酶Pv EH3的表达及手性邻二醇的合成 王瑞1，许耀辉1，王克伟2，邬敏辰2 （1江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2 江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122） 摘要：基于环氧化物水解酶（EHs ）一级结构的计算机辅助分析，以菜豆（Phaseolus vulgaris ）总RNA 为模板，采用逆转录PCR 和巢式PCR 技术扩增了一种新型环氧化物水解酶（Pv EH3）的编码基因pveh3。借助表达载体pET-28a （+）将pveh3导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行了异源表达。一级和三级结构表明，Pv EH3属于α/β水解酶超家族，其催化三联体为Asp 101-His 297-Asp 262，两个保守质子供体为Tyr 150和Tyr 232。在20℃、pH7.0的反应条件下，Pv EH3能催化环氧苯乙烷及其4种衍生物的对映会聚水解。实验结果表明，Pv EH3对环氧苯乙烷及其对位取代环氧底物（93.2%、86.6%和85.1% ee p ）的对映会聚性优于其间位取代环氧底物（37.1%和53.3% ee p ）；Pv EH3针对5种环氧底物中的环氧苯乙烷具有最高的区域选择性，区域选择性系数αS 和βR 分别为93.9%和99.0%。Pv EH3的发现增加了区域选择性高且互补的EHs 数目，为单酶催化环氧化物的对映会聚水解提供了更多的选择余地。 关键词：环氧化物水解酶；生物催化；表达；区域选择性；对映会聚水解 中图分类号：Q556.9 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）05–1933–07 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-1287 Expression of Pv EH3，a Phaseolus vulgaris e poxide hydrolase ，and synthesis of chiral vicinal diols WANG Rui 1，XU Yaohui 1，WANG Kewei 2，WU Minchen 2 （1School of Biotechnology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，Jiangsu ，China ；2Wuxi Medical School ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，Jiangsu ，China ） Abstract ：Based on the computer-aided analysis of primary structures of epoxide hydrolases （EHs ），a Pv EH3-encoding gene ，pveh3，was amplified from Phaseolus vulgaris total RNA by RT-PCR and Nested PCR technique ．Mediated by expression vector pET-28a （+），pveh3 was heterologously expressed in E. coli BL21（DE3）．Primary and three-dimensional structures indicated that Pv EH3 belonged to the α/β-hydrolase superfamily. Its catalytic triad is Asp 101-His 297-Asp 262，and two conservative tyrosine residues served as proton donor are Tyr 150 and Tyr 232．The enantioconvergent hydrolysis of styrene oxide and its four derivatives were conducted by Pv EH3 at a gentle reaction condition ，20℃ and pH 7.0．The experimental results indicated that without substitution or at the para positions （93.2%，86.6% and 85.1% ee p ） of the aromatic ring had a better enantioconvergent than those at the meta position （37.1% and 53.3% ee p ） ．Pv EH3 possesses the best regioselectivity towards styrene oxide within five substrates and the regioselectivity coefficients ，αS and βR ，were 93.9% and 99.0%，respectively ．The discovery of Pv EH3 increased the number of EHs possessing high and complementary regioselectivity ，which offered more options for the enantioconvergent hydrolysisof racemic epoxides by single EHs ． Key words: epoxide hydrolase ；biocatalysis ；expression ；regioselectivity ；enantioconvergent hydrolysis @https://www.360docs.net/doc/f213020038.html, 。通讯作者：邬敏辰，教授，博士生导师，主要从事酶工程与基因工程研究。E-mail ：biowmc@https://www.360docs.net/doc/f213020038.html, 。 收稿日期：2017-06-02；修改稿日期：2017-07-27。 基金项目：国家自然科学基金项目（21676117）。 第一作者：王瑞（1989—），女，硕士研究生。E-mail ：Wangshen204823 万方数据
第七章-开环聚合
第七章开环聚合 一、课程主要内容 开环聚合概述；开环聚合的特征；环状单体的种类及其聚合能力；环醚的开环聚合。 对第七章内容作一般了解。 二、习题与答案 本章试题有基本概念题、填空题和简答题。 ㈠基本概念题 ⒈开环聚合：开环聚合是指具有环状结构的单体经引发聚合后将环打开形成高分子化合物的一类聚合反应。 ⒉环醚：环中含有醚键-O-的环状化合物称为环醚。 ⒊环氧化合物：三节环醚又称为环氧化合物或氧化烯，如环氧乙烷又称为氧化乙烯，环氧丙烷又称为氧化丙烯。 ⒋环缩醛：在环中含有-CH2O-基团的环状化合物。 ⒌内酯：环中含有酯基-COO-的环状化合物，称为内酯或环酯。 ⒍内酰胺：环中含有酰胺基-CONH-的环状化合物，称为内酰胺或环酰胺。 ㈡填空题 ⒈环状类单体主要有环醚类、环酰胺类、环酯类和环烯烃等几类。 ⒉环醚单体主要有环氧乙烷、环氧丙烷、氧杂环丁烷、3,3’-二氯甲基氧杂环丁烷、和四氢呋喃等。 ⒊环氧化合物有环氧乙烷、环氧丙烷和环氧氯丙烷等。 ⒋环缩醛有三聚甲醛和四聚甲醛。 ⒌含硅的环状化合物有1,1’,3,3’,-四甲基-1.3-二硅环丁烷和2,2’,4,4’,6,6’,8,8’-八甲基 -2,4,6,8-四硅氧杂环辛烷(D4) 。 ㈢简答题 ⒈写出开环聚合反应简式、聚合机理，并写出环氧丙烷开环聚合的聚合反应简式？ 答案： 开环聚合反应简式可表示如下 n R [ R Z ]n Z 在环状单体中，R为烷基，Z为杂原子：O,S,N,P,Si或-CONH-，-COO-，-CH=CH-基团等。 绝大多数环状单体的开环聚合是按离子型聚合机理进行的，有少数环状单体的开环聚合是按水解聚合机理进行的。 环氧丙烷进行开环聚合的聚合反应简式为
环氧化物水解酶介导的对映会聚水解及其应用
环氧化物水解酶介导的对映会聚水解及其应用 陈林，申红蕾，朱勍 （浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014） 摘 要：环氧化物水解酶是一种能水解环氧化合物的酶，它能够立体选择性水解外消旋的环氧化物产生手性环氧化物 和手性二醇。它普遍存在于动植物、昆虫及微生物体内，应用其合成手性的环氧化合物及其产物手性醇，受到了科学工作者们的广泛关注。本文综述了环氧化物水解酶的对映会聚水解及其在制备手性环氧化物和手性邻二醇中的应用。关键词：环氧化物水解酶；生物催化；对映会聚水解；立体选择性中图分类号：TQ926.2 文献标识码：A 文章编号：1674-506X （2012）04-0067-0004 Application of Bioconvergence Hydrolysis of Epoxide Hydrolase CHEN Lin ，SHEN Hong-lei ，ZHU Qing （Institute of Biological and Environmental Engineering ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310014，China ） Abstract ：The epoxide hydrolase is an enzyme in the hydrolysis of epoxides ，and it can stereoselective hydrolysis the racemic epoxide to chiral epoxides and chiral diol.It is commonly found in plants ，animals ，insects and mi 鄄croorganisms.It was applicated to synthesis the chiral epoxides and their products of chiral alcohols ，which had been widespread concern of scientists.In this paper ，the bioconvergence hydrolysis of epoxide hydrolase applied to prepare chiral epoxides and chiral idols had been reviewed. Key words ：epoxide hydrolase ；biocatalysis ；bioconvergence hydrolysis ；stereoselective doi ：10.3969/j.issn.1674-506X.2012.04-018 手性环氧化物和手性醇是十分重要的医药中间体，在制备手性药物及手性有机合成中用途广泛。目前制备手性环氧化物的生物法有两种，分别为前手性烯烃的不对称环氧化及外消旋环氧化物的动力学拆分。前手性烯烃的不对称环氧化主要应用的是氧化还原酶，它需要辅因子或辅酶。后一种外消旋环氧化物的动力学拆分主要应用的是环氧化物水解酶（Epoxide Hydrolases ），它不需要辅因子或辅酶，操作起来更加简单。生物法制备手性环氧化合物以微生物整细胞或纯酶来进行生物转化得到具有高度立体及区域的选择性的单一光学构型的环氧化物以及光学纯的二醇产物，与化学法相比，生物法具有众多的优点：高对映选择性、高区域选择性、适用范围广 及环境友好等。因此，生物法制备手性环氧化物及其二醇产物成为近年来研究的热点［1-5］。 1环氧化物水解酶介导的对映会聚水解的机理环氧化物水解酶的属于α/β折叠型水解酶，环 氧化物水解酶催化环氧化物水解不需要任何辅基，也不需要金属离子。目前，从PDB 酶库中报导的环氧化物水解酶来看，酶活性中心的氨基酸残基基本上是一致的，区别主要在周边疏水氨基酸残基的不同。 1.1环氧化物水解酶的结构特点 环氧化物水解酶的属于α/β折叠型水解酶，它 的三维结构图已经得到了充分的描述。如图1所示，人体环氧化物水解酶与黑曲霉环氧化物水解酶的空间结构比较相似。它们都是由两个功能性结构组成： 收稿日期：2012-05-15 基金项目：浙江省自然科学基金项目（No.Y2080303，Z4080032）作者简介：陈林（1986-），男，硕士研究生，研究方向为生物催化 。 第48卷（第4期）Vol.48，No.4
环硅氧烷开环聚合反应的机理及动力学研究
基金项目:浙江省科技支撑计划(2007C21G 2150010)和浙江省高等学校特聘教授基金(2005Z J008); 作者简介:邱化玉(1963-),理学博士,钱江学者特聘教授,博士研究生导师,研究方向为有机硅化学; 3通讯联系人,E 2mail :hyqiu @https://www.360docs.net/doc/f213020038.html,. 环硅氧烷开环聚合反应的机理及动力学研究 吕素芳,李美江,邬继荣,蒋剑雄,来国桥,邱化玉 3(杭州师范大学有机硅化学及材料技术教育部重点实验室和浙江省有机硅 材料技术重点实验室,杭州 310012) 摘要:环硅氧烷在亲核或亲电催化剂、温度或辐射作用下,可开环聚合生成线型聚硅氧烷,聚合方法主要有 本体聚合和乳液聚合。本体聚合可分为阴离子聚合和阳离子聚合,阴离子聚合就是在碱性催化剂(亲核试剂) 作用下,使环硅氧烷开环聚合成线型聚硅氧烷的过程;阳离子聚合就是环硅氧烷在酸性催化剂(亲电试剂)作用下的开环聚合反应。乳液聚合则是单体和水(或其它分散介质)并用乳化剂配成乳液状态进行聚合,按所采用的乳化剂种类不同,主要有阴离子型和阳离子型两种类型。本文总结了近几年国内外环硅氧烷本体聚合和乳液聚合的开环聚合机理及动力学研究情况,并对今后此方面的研究进行了展望。 关键词:环硅氧烷;阴离子聚合;阳离子聚合;反应机理;动力学引言 环硅氧烷是有机硅工业中最主要的原料,大多数有机硅高分子都是由环硅氧烷开环聚合得到的,强酸或强碱引发环硅氧烷开环聚合是合成线型聚硅氧烷常用的方法。常用的环硅氧烷为六甲基环三硅氧烷(D 3)和八甲基环四硅氧烷(D 4)。环硅氧烷开环聚合的方法主要有本体聚合和乳液聚合,二者均可分为阴离子聚合和阳离子聚合两种。本体聚合是单体本身加入少量其它介质聚合;乳液聚合则是单体和水(或其它分散介质)并用乳化剂配成乳液状态进行聚合。 环硅氧烷在亲核或亲电催化剂、温度或辐射作用下,可开环聚合生成线型聚硅氧烷。聚合过程由4 个阶段组成[1]:(1)聚合引发阶段,形成反应中心;(2)链增长阶段;(3)链终止阶段(活性中心消失);(4)链 转移形成新的活性点。 线形聚硅氧烷是有机硅聚合物最基本的形式,研究最多,应用也最广。聚硅氧烷的聚合方法从反应类型上来区分,可分为以两端有活性官能团封端的线形聚硅氧烷为基本原料的缩合聚合和以环硅氧烷为单体的开环聚合两大类。由于开环聚合所用的单体价廉易得、聚合过程简易可行,因此对开环聚合的研究、应用最多,而对环硅氧烷开环聚合的机理及动力学进行深入的研究,可为聚硅氧烷的工程设计及生产控制提供理论依据。本文旨在近年来国内外对环硅氧烷的本体聚合和乳液聚合的开环聚合机理及动力学研究进行综述,分别对本体聚合的阴离子聚合和阳离子聚合的机理及动力学进行综述,对环硅氧烷的乳液聚合的开环聚合机理及动力学研究进行综述。 1 本体聚合 111 阴离子催化开环聚合反应 11111 机理研究 阴离子催化开环聚合反应,就是在碱性催化剂(亲核试剂)作用下,使环硅氧烷开环聚合成线型聚硅氧烷的过程。以K OH 催化D 4开环聚合为例,反应开始时,K OH 中OH - 阴离子与D 4硅原子上的3d 轨道配位,导致D 4内电子云密度重新分布,在加热下引起Si —O —Si 键断裂(开环),生成链端含
环氧化物水解酶
微生物环氧化物水解酶 引言 环氧化物水解酶广泛分布于动物界（包括人类），在肝脏中，环氧化物水解酶主要分布在内质网网上，最近的研究表明，它也分布于肝细胞的核膜、胞浆中，而在环氧化物酶体、溶酶体和线粒体中缺失。 环氧化物水解酶以多种同工酶形式存在，酶的单体相对分子量为 48k-54k之间，没有血红蛋白和黄素做辅基。 环氧化物水解酶也可催化内源性和外源性的环氧化物，其中对内源性环氧化物的速率远大于外源性的环氧化物。因为环氧化物水解酶在致癌物的形成中扮演一定角色，所以被作为肝癌的早期标志二受到广泛关注！ 环氧化物(epoxide)在多种生物体的代谢过程中广泛存在，又在多种生物活性物质的合成中被广泛应用，它们是一类很有价值的手性有机合成砌块和中间体。环氧化物具有环氧乙烷三元环，该环中各原子的轨道由于不能在正面充分重叠，而是以弯曲键连接，因而具有较强的张力，其碳氧键具有很强的亲电性，故其能与各种亲核试剂反应，通过选择性开环及官能团转换，就可以很方便地合成很多种光学活性物质，而且它们的反应活性高，其开环反应中通常具有极好的位置选择性和立体选择性。 环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)又称环氧化物水合酶(epoxide hydratase)或环氧化物水化酶(epoxide hydrolase)，能立体选择性地将水分子加到环氧底物上生成相应的手性1,2-二醇。应用此酶，能够得到具有光学活性的剩余环氧化物和相应的二醇化合物。该酶在生物体内的外源性化合物代谢中起着重要的作用。因此，环氧化物水解酶在生物体内，尤其是微生物体内，是普遍存在的。 一、选育 对细菌EH的研究最早是在1967年，Schroepfer等人在Pseudomonad(NRRL.2994)中发现了EH，并利用该酶成功催化水解了环氧油酸。此后奥地利的K.Faber研究小组开辟了对微生物环氧化物的研究。 细菌环氧化物水解酶在自然界中普遍存在，分组成型和诱导型两大类。前者的底物适用性较广，可以很高的对映体选择性水解各种2取代的环氧化物，例如：1,1-二取代，2,2-二取代和2,3-二取代，但其比活力都不高，但是对于无分支的末端l,2-环氧化物的选择性较低，且对于内消旋环氧化物的活性较低。后者的底物域相对较窄，是和诱导物结构相似的环氧化物，比活力较高。 对用真菌环氧化物水解酶进行环氧化物的不对称水解反应的研究开始得更早。始于1972年日本Suzuki等人用Helminthospsrum sativwn对一种萜类环氧化物10,11-环氧法呢醇进行对映体 选择性开环。但是对其真正的研究是在1993年由法国的Furstoss等展开的。真菌环氧化物水解酶一般是组成型酶，一般可以用廉价的普通碳源进行大规模培养生产。其底物范围相对较广，对取代脂环族、芳香族和无分支的脂肪族末端l,2-环氧化物具有特别高的立体选择性。其中真菌中的酵母细胞由于培养简便且易于从发酵液中分离，适合大规模的工业化生产，具有良好的应用潜力。研究发现，许多丝状真菌的环氧化物水解酶是组成型酶，其底物范围广，对映体选择性高，尤其是对含有芳香基团、取代脂环基的环氧化物的选择性很高，是一种非常具有潜力的工业用生物催化剂。
环氧化物聚合中的影响因数
环氧化物聚合中的影响因数 一、水 生产实践经验告诉我们，水在环氧化物的聚合中，是极其重要的机械杂质。极微量水，在聚合中，影响聚醚的分子量。 聚合过程中的来源，有两个方面，一是原料中的微量水，包括起始剂、催化剂、单体中的含水量。二是起始剂和催化剂反应过程所生成的水。前者只要严格控制原料规格、易于解决。后者视起始剂的性质，分别对待。如合成三羟基系列聚醚时，常以甘油为起始剂，氢氧化钾为催化剂，反应方程式是： H2C—OH H2C—OK HC—OH + 3KOH HC—OK + 3 H2O H2C—OH H2C—OK 由于甘油和水之沸点相差较大，故使甘油和氢氧化钾先反应，生成醇钾，用减压脱水的方法，可以除去反应过程生成的水。 又如对合成单羟基系列聚醚时，常用正丁醇为起始剂，氢氧化钾为催化剂： C4H9OH + KOH C4H9OK + H2O 由于正丁醇和水之相图可知，正丁醇和水形成恒沸物混合物，且恒沸点较高，这种水分，就较难除去，对这种水分必须在专门脱水设备上进行，或者可以加入第三组分苯，苯和水形成共沸物，恒沸点又较低，易于蒸出，这样也可以把反应过程生成的水除净。因此，起始剂和催化剂反应生成水的除净，视起始剂性质而变。 在碱性催化剂聚合时，微量水和环氧化物反应，生成二元醇，反应方程式是： CH3CH3 CH —CH2+ H2O HOCHCH2OH O CH2—CH2+ H2O HOCH2CH2OH O 由上可知，在聚醚生产的固定配比中，起始剂醇类的用量是特定的，
微量水的增多，实质上就是增加醇的用量，从而使产物的聚合度下降，也就是说，降低聚醚的分子量。微量水对分子量之影响见图3-1。 尤其在多羟基聚醚的生产中，如三羟基（甘油为起始剂）或五羟基（木糖醇为起始剂）聚醚，当微量水增加时，微量水和环氧丙烷、环氧乙烷作用，生成丙二醇、乙二醇。因此，就等于加进了二醇类的起始剂，这样不但增加了起始剂的量，而且改变了起始剂的性质。也就是说，在多羟基聚醚中，二羟基聚醚含量就增多，多羟基聚醚在整个聚醚中的百分含量相对就降低，从而影响多羟基聚醚的质量。当这些聚醚，在制作泡沫塑料等应用时，它和异氰酸酯反应的交链密度显然降低，从而使产品质量指标下降。 聚醚粗制品，经后处理，得精制品聚醚。该聚醚中微量水，同样是重要指标之一。因为聚醚类产品，常常是聚氨酯的中间体，它必须和异氰酸酯起反应，才能制得各种各样的产品。水分增加不但使异氰酸酯用量增多，而且影响制品的强度和其他性能。 综上所述，微量水在聚醚生产中是一个关键，由于水的存在往往生产过程中出现不正常现象，因此必须予以足够的重视。 二、醛 聚合用的单体，要求纯度高，杂质必须控制在一定含量以下，才能保证一定的聚合速度和分子量。环氧化物中的醛是聚醚聚合的阻聚剂，醛含量增加，诱导期延长，聚合速度降低，因此聚醚生产周期就延长。当含醛量高至一定量时，严重影响开环聚合，有的甚至根本不聚合。因此，环氧化物中含醛量必须控制在一定数值之内。醛对环氧化合物开环的阻聚机理还不十分清楚。 在软质聚氨酯泡沫塑料的生产中，环氧丙烷的含醛量，对泡沫体强度之影响，见表3-3 抗拉强度，随着环氧丙烷中含醛量的减少有显著提高。 三、影响聚合速度的因素 进行任何反应，我们都希望在不影响转化率的前提下，加快反应速度，以达到符合多快好省的目的。在环氧乙烷，环氧丙烷的均聚和共聚过程中，影响反应速度的因素很多，主要的是温度、压力、起始剂、催化剂、原料
新颖的生物基环氧化合物
新颖的生物基环氧化合物：使环氧化的脂肪酸蔗糖酯 摘要： 新颖的高功能性生物基环氧树脂由来自植物油脂肪酸的蔗糖酯环氧化反应(SEFA)合成。很多脂肪酸的蔗糖酯被过氧化氢和醋酸在离子交换树脂催化剂中提取的过乙酸环氧化制成的环氧化的脂肪酸的蔗糖酯。双键向环氧化合物的转化多于99%。产品特性已用基体协助激光解吸和电离分析时间，质谱分析法，霍氏转换红外光谱仪（FTIR）和核磁共振测定。物性用体积粘度，特性粘度和密度进行表征。热学性能有DSC和TDA表征。由于蔗糖酯包含蔗糖的核心完全由8个植物油脂肪酸替代，SEFAs和ESEFAs 都有定义明确的紧凑的大分子结构。作为新颖的生物基环氧树脂复合物，ESEFAs 有很高的环氧官能团（每个分子8-15个），高密度和紧凑的分子结构。而且，ESEFAs从通过交联环氧树脂官能团在生物基热固性材料的组成到环氧树脂官能团反应的衍生都很有前途。 1简介 可再利用的原材料的利用被看做是有利于可持续发展的绿色化学。植物油，是脂肪酸中自然产生的三酸甘油酯，占制备的生物基聚合物所需可再生原材料很大比例。碳水化合物是另一种典型的做绿色材料的原材料，将低分子量的碳水化合物做产品以取代石油基产品很有吸引力。
蔗糖是一个有8羟基官能团的二糖。将蔗糖与植物油脂肪酸结合以出产脂肪酸蔗糖酯以做涂层的车辆的第一次探索是在1960年。然而最近探索发现得到的8羟基官能团最大饱和度是7。当时的树脂无法商业化。在21世纪早期，Proctor& Gamble (P&G) Chemicals 发展了一种不同的将SEFA商业化的进程，饱和度至少7.7，并将其介绍到润滑油和油漆市场。SEFOSE （上述产品商标）蔗糖酯可用作粘合剂和活性填充剂。Fig. 1 有全取代的大分子结构。 环氧化合物是环醚类，也叫环氧乙烷，氧原子存在于三元环中。用脂肪化合物不饱和双键进行环氧化是最有用的修正方法之一，因为环氧化合物是稳定生成新官能团,通过加入亲核对环氧化合物开环可生成很多产品，如二醇，醚醇，酯醇，氨基醇。通过用醇对环氧化大豆油开环，用于聚氨酯的甘油三酸酯多元醇已被Petrovic成功制备。不饱和酸的环氧化反应被广泛用于通过丙烯酸和环氧化植物油(EVOs).反应合成油基自由基UV固化涂层树脂。 一般来说虽然有4种技术可用于通过烯分子生产环氧化合物，HCOOOH 或CH3COOOH是合成环氧化脂肪化合物最常用的。第一步是过氧酸的形成，第二步是双键环氧化。
第八章 醚和环氧化合物
C 2H 5OCH 2CH 2OCH 2CH 2OH HOCH 2CH 2OCH 2CH 2OH HOCH 2CH 2NHCH 2CH 2OH C 6H 5OCH 2CH 2OH 第八章 醚和环氧化合物 1．用控制量的无水HBr 断裂有旋光性的甲基仲丁基醚时，生成溴甲烷和仲丁醇；仲丁醇的构型与原料相同，为什么？ 2．写出2-乙基环氧乙烷与下列试剂反应的方程式： （1）甲醇和硫酸 （2）甲醇和甲醇钠 （3）苯胺 3．命名下列化合物 4．写出下列化合物的结构式 （1）苯甲醚（茴香醚） （2）1-氯-3-乙氧基-2-丁醇 （3）间-硝基苯异丙醚 （4）甲基叔丁基醚 （5）对-甲氧基苯酚 （6）2，3-二甲基环氧乙烷 5．完成下列反应 6．用化学方法鉴别下列各组化合物： （1）茴香醚和甲苯 （2）正丁醚和正丁醇 （3）乙烯基醚和乙醚 7．某化合物A 的分子式为C 7H 8O ，A 与金属钠不发生反应，与浓氢碘酸反应生成两个化合物B 和C ，B 能溶于NaOH ，并与FeCl 3作用呈紫色，C 与硝酸银溶液作用，生成黄色沉淀。试写出A 、B 、C 的结构及主要反应式。 8．以环氧乙烷为原料制备下列化合物 （1） （2） （3） （4） 9．分离下列各组化合物 （1）乙醚中混有少量乙醇 （2）苯甲醚中混有对-甲酚 11．为什么苯甲醚与热的氢碘酸反应，得到的是碘甲烷和苯酚，而不是得到甲醇和碘苯？ 12．(R)-2-辛醇及其乙基醚都是左旋的。试预测由此醇通过下列反应所制得的乙基醚的构型。 （1）与Na 作用，然后再与C 2H 5Br 作用。 （2）在一种低介电常数的溶剂中与浓HBr 作用，然后再与C 2H 5ONa 作用。
习题611试讨论环状单体环的大小与开环聚合反应倾向间的关系
习题 6 1、 1、 试讨论环状单体环的大小与开环聚合反应倾向间的关系。 2、 2、 氧化丙烯的负离子聚合通常仅能得到低相对分子质量的聚合物，试讨论原因。 3、 3、 用氢氧负离子或烷氧负离子引发环氧化物的聚合反应常在醇的存在下进行，为什么？ 醇是如何影响相对分子质量的？ 4、 4、 用方程式表示环醚、环缩醛在聚合反应中发生的尾咬、扩环反应。 5、 5、 考察下列单体和引发体系： 6、 6、 给出合成下列各种聚合物所需的环状单体、引发剂和反应条件： 7、在内酰胺的负离子开环聚合反应中，酰化剂和活化单体起什么作用？ 第 六 章 开环聚合习题答案 1. 1. 试讨论环状单体环的大小与开环聚合反应倾向的关系。 解：环状单体能否转变为聚合物，取决于聚合过程中自由能的变化情况，与环状单体和线形聚合物的相对稳定性有关。以环烷烃为例，由液态的环烷烃（l ）转变为无定型的聚合物（c ）： 聚合过程中的自由能变化： ΔG lc 0 =ΔH lc 0 — T ΔS lc 0≤ 0 由表6-1可以看出，除六元环外，其他环烷烃的ΔG lc 0均小于0，开环聚合在热力学上是有利的。除六元环烷烃外，其他环烷烃的聚合可行性为：三元环，四元环＞八元环＞五元环，七元环。对于三元环、四元环来讲，ΔH lc 0是决定ΔG lc 0的主要因素，是开环聚合的主要推动力；而对于五元环、六元环和七元环来说，ΔH lc 0和ΔS lc 0对ΔG lc 0的贡献都重要。随着环节数的增加，熵变对自由能变化的贡献增大，十二元环以上的环状单体，熵变是开环聚合的主要推动力。 以上仅是通过热力学分析的结果，事实上环烷烃的开环聚合通常难于进行，主要是因为 CO CH 24n (a)NH CH CH 2CH 3CO n (b)N CHO CH 2CH 2CH 2n (d)OCH 2CH 2OCH 2(c)(e)HC CH CH 2CH 2(f) Si CH 3 O 2 n n n (CH 2)n x x n (CH 2)[](l) (c)