小鼠海马神经元的培养
小鼠海马神经元的培养
一、实验材料：
1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。
2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。
3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS）
HEPES 3.9g,
NaHCO30.84g，
青霉素104U,
链霉素100mg，
H2O800ml。
以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm 直径的滤菌器过滤，4℃保存。
4、DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM培
养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭活）1%的青/链霉素.
5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%
的b27+1%抗生素
6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。
7、台盼蓝(typan blue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。
8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。
9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。
二、实验步骤：
1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。
2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。
3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。
4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,在孵箱中消化5-7min。
5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。
最好用培养基洗2-3遍，以中止消化反应。
6、加少量培养基于试管中，以中空塑料管反复吹打10-15次，直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml，静置约10min。取1-2μl 细胞悬液于99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中，用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数，从而测定细胞密度(细胞计数：活体细胞具有排斥台盼蓝的能力，而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。
7、根据实验需要，以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度，接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为（2-2.5）x105细胞/cm2.
8、待6-8h细胞贴壁后，换培养基为含2%B27的Neurobasal，含有B27和0.5mM的谷氨酰胺。
9、培养2-3d培养基中加入8-10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神经细胞和原代胶质增殖。
10、每三天用Neuronbasal使用液半量换液
三、形态学观察
细胞接种6-12h，开始贴壁，细胞成圆形或椭圆形，两周后神经元最为丰满，胞体圆形或多角形，四周晕光明显，胞核及核仁清晰可见，位于细胞中央或一边，神经多而粗大，分支成网络。培养一月后，细胞开始退化。一般认为，培养2-4周开始实验比较适宜。
四、注意事项
1、L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被培养板后，要待其干后才能接种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。
2、取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。
3、分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤维细胞。
4、用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。
5、接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。
6、接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。
五、结果、
大多数神经元在接种1h内贴壁，3-5h开始变平，并长出1-2个突起。3天后，许多细胞从胞体长出数个突起。神经元在7-10天开始成熟，胞体逐渐长至30-40um,晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗，变长并且有分支，边缘清楚，发亮，形成明显的神经网络。神经元可存活1-2月。
附：
一、血细胞计数法及台盼蓝测细胞活度
（一）
实验材料和实验前准备
1、显微镜，血细胞计数器，盖玻片
2、毛细移液管，1ml血清移液管，5ml试管，擦镜纸或软布
3、0.4%的台盼蓝溶液，0.3%苯胺黑（nigrosin）溶液，95%，乙醇
4、用擦镜纸或者软布将血细胞计数板的计数池擦干净。再
用酒精95%血细胞技术板和盖玻片，晾干备用。
5、讲清洁干净的盖玻片覆盖于血细胞技术板的计数池上。
6、胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/m
（二）实验步骤
1、制备制备细胞悬液取一试管，分别加入0.4%台盼蓝溶液0.2ml (或0.3%苯胺黑溶液)及混合均匀的细胞悬液0.8ml，用手轻柔振荡试管，以混合悬液和染料。
2、以中空移液管轻柔混匀细胞悬液后，立即用毛细移液管吸取少量细胞悬液，置移液管尖头于细胞计数板计数池的边缘（小心不要移动盖玻片），缓缓释放细胞悬液。通常一侧计数池可以容纳20ul细胞悬液。
3、细胞计数每个正方形的边侧都有三根线，在左侧和上方，应将接触到三根线的中线的内侧线的细胞计算在内，技术两侧计数池，共八个正方形。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
胎鼠海马神经元培养及其鉴定
［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大
氟西汀对海马神经元生长的影响
氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，
D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染
神经元细胞培养
神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1
成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定
昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.
海马神经元细胞免疫荧光检验
海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
大脑地解剖结构和功能——布鲁德曼分区
大脑的解剖结构和功能——布罗德曼分区系统 布罗德曼分区是一个根据细胞结构将大脑皮层划分为一系列解剖区域的系统。神经解剖学中所谓细胞结构（Cytoarchitecture），是指在染色的脑组织中观察到的神经元的组织方式。 布罗德曼分区1909年由德国神经科医生科比尼安·布洛德曼（Korbinian Brodmann）提出。根据皮质细胞的类型及纤维的疏密把大脑皮质分为52个区，并用数字给予表示。Brodmann Area 1, BA1 Brodmann Area 2, BA2 Brodmann Area 3, BA3 位置：位于中央后回 (postcentral gyrus) 和前顶叶区。 功能：分别为体感皮层内侧、末尾和前端区,BA1、BA2、BA3共同组成体感皮层； 具备基本体感功能（first somatic sensory area）接受对侧肢体的感觉传入。Brodmann Area 4, BA4 位置：位于中央前回(precentral gyrus)，中央沟(central sulcus)的内侧面 功能：初级运动皮层（first somatic motor area)，包含“运动小人”（motor homunculus ）。 控制行为运动，与BA6 （前）和BA3 、BA2 、BA1、（后）相连，同时与丘脑腹外侧核相连。 体感小人（Somatosensory Homunculus ） 传入体感信息较多的身体区域获得的皮层代表区域较大。比如手部在初级体感皮层中的代表区域比背部的大。体感皮质定位可用“体感小人”（Somatosensory homunculus）来表示。 Brodmann Area 5, BA5 位置：位于顶叶前梨状皮质区（梨状皮质piriform cortex为下边缘皮质的组成部分）。功能：与BA7形成体感联合皮层。 Brodmann Area 7, BA7 位置：位于顶叶皮质顶部，体感皮层后方，视觉皮层（visual area)上方。 功能：将视觉和运动信息联合起来；与BA5形成体感联合皮层；视觉-运动协调功能。 Sensory Areas---------Somatosensory Association Area 位置：位于初级躯体感觉皮层后方（BA5、BA7）
海马细胞培养与鉴定
3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打
↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。
海马结构及图
海马结构,希望有所帮助 海马结构(hippocampal formation，HF)属于脑的边缘系统(1imbic system)中的重要结构，与学习、记忆、认知功能有关，尤其是短期记忆与空间记忆。海马皮质从海马沟至侧脑室下角依次为分子层、锥体层和多形层。齿状回也分三层：分子层、颗粒细胞层和多形层。依据细胞形态、不同皮质区的发育差异以及纤维排列的不同，将海马分为4个区，即CAl、CA2、CA3、CA4区。海马结构是大脑边缘系统的重要组成部分．在进化上是大脑的古皮质，位于大脑内侧面颞叶的内侧深部，左右对称。一般认为海马结构由海马或称Ammon角、齿状回、下托及海马伞组成，结构比较复杂。在功能和纤维联系上，不仅与嗅觉有关，更与内脏活动．情绪反应和性活动有密切关系。细胞学研究表明，海马头部主要是由CAI区折叠而成，而CAI区对缺氧等损伤最为敏感，也被称为易损区，因此海马头部也是最易发生病变的部位。 海马结构由海马(hippoeampus)、齿状回(dentate gyrls)、下托(subiculum)和围绕胼胝体的海马残体(hippoeampal rudimerit)组成，其中海马为体积最大最主要的部分。 大脑海马（hippocampus）是位于脑颞叶内的一个部位的名称，人有两个海马，分别位于左右脑半球. 它是组成大脑边缘系统的一部分，担当着关于记忆以及空间定位的作用. 名字来源于这个部位的弯曲形状貌似海马(希腊语hippocampus). 在阿兹海默病中,海马是首先受到损伤的区域; 表现症状为记忆力衰退以及方向知觉的丧失。大脑缺氧(缺氧症)以及脑炎等也可导致海马损伤 . 在动物解剖中, 海马属于脑的演化过程中最古老的一部分。来源于旧皮质的海马在灵长类以及海洋生物中的鲸类中尤为明显。虽然如此, 与进化树上相对年轻的大脑皮层相比灵长类动物尤其是
原代神经细胞培养方法重点讲义资料
神经细胞培养 体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1．材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2．结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF 存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。 1．材料和方法 取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
原代神经元培养
原代神经元培养 Document number：BGCG-0857-BTDO-0089-2022
神经细胞原代培养 从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。 一、培养前准备 1. 器械和器皿 器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等 各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。 器皿： 1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖， 2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。 3)培养瓶、盖玻片 4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用盐酸浸泡10分钟，用蒸馏 水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。 5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。 6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。 辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。 2. 培养基和培养用液的配制
1)??培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为ml。 2)??平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。 3)??培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。 4)??血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。 5)??胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至%或%。实际使用温度一般为37℃ 20-30分钟。 6)??解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。 D1平衡盐水：NaCl 、KCl 、、KH2PO4 、酚红、三蒸水50ml。 蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖、葡萄糖3g、三蒸水50ml。 HEPES（H，）：用25ml左右的三蒸水溶解的HEPES后，用NaOH或HCl 调pH至，加三蒸水至28ml。
海 马 神 经 元 培 养
海马神经元培养 （1）材料 ①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d ②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103) L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺 Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸 B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504) ③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸 ④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025) ⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175) ⑥trypsin 胰酶 ⑦NaHCO 3 ⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠 ⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝 ⑩巴氏吸管，前端用火抛光 刻度吸管 离心管 闪烁瓶 玻璃培养皿：小：3套 大：2套 冰袋、纱布 手术器械、筛网 培养瓶或培养板
（2）步骤 ①准备 a．配制试剂 i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中） 配制硼酸缓冲液（pH8.4） A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 4.5mlA液+ 5.5mlB液 5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。 ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制 不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水 NaHCO3：0.175g加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.2-7.4 纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 iii）1M NaOH溶液配制 NAOH：4g 溶于100ml纯水 iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA D-Hank’s溶液10ml EDTA 20mg 溶解后 D-Hank’s溶液80ml 胰酶125mg 溶解后 1M NaOH溶液调节pH至7.2 D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.4 纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液
基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制
基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制 发表时间：2019-03-07T16:26:29.280Z 来源：《心理医生》2019年第4期作者：王赫霆 [导读] 研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响 （哈尔滨市第十一中学黑龙江哈尔滨 150000） 【摘要】目的：研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响。方法：正常大鼠随机分为空白组、模型组。采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，分中药治疗组（高、中、低剂量），对照组，各组15只，于第0、7、14、21、28天观察行为学指标（体重、糖水消耗实验、敞箱得分、大鼠活动延迟时间）。28天取大鼠海马组织，观察CA1、CA2、CA3、CA4区形态学变化及HE染色后脑组织的病理改变(Figure)。结果：相同时间点组间比较第7、14、21、28天行为学指标空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。抑郁大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩,深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩,深染。治疗组大鼠 海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。结论：宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。 【关键词】宁神灵；抑郁症；慢性不可预知刺激；行为学；海马神经元 【中图分类号】R749.05 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2019）04-0045-02 抑郁症是一种以显著而持久的情绪失常为特征的综合征，该病具有高患病率、高致残率、高自杀率的特点。据世界卫生组织进行的全球疾病负担调查估计，到2020年由抑郁症造成功能残疾的人数将仅次于心血管疾病，上升至所有病种的第2位，并将占到全球因精神因素致残患者的1/3，因此，抑郁症已成为亟待解决的最重要的精神障碍[1]。近年来，关于抑郁症发病机制的研究很多，大多集中在神经递质、基因和社会因素等方面，但对于抑郁症发生和发展的分子生物学机制仍尚不明确[2]。 1.材料与方法 1.1 实验材料 健康雄性大鼠75只，正常大鼠随机分为空白组、模型组，采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，模型组分中药高（宁神灵5.04g/kg）、中（宁神灵2.52g/kg）、低剂量组（宁神灵1.26g/kg）、对照组。 1.2 研究方法 1.2.1行为学指标观察 （1）体重测定 实验过程中每周称量一次体重观察各组大鼠体重变化及增长情况以判断抑郁状态与体重变化的关系。 （2）糖水消耗实验 根据文献所有大鼠首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48小时内将蔗糖水放入笼中以代替自来水接着禁食禁水24小时通过称饮水瓶重量测量大鼠在1小时内蔗糖水的饮用量此后每间隔一周均进行禁水禁食及1小时蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验。 （3）敞箱得分实验 将大鼠置于高40cm，直径80cm周壁为黑色底面被分成面积相等的25块方格组成的旷场里，60W灯泡照明观测每只大鼠3min内水平活动和垂直活动得分。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项试验观察将大鼠置于敞箱中间观察大鼠穿越方格数（四爪均进入的方格可记数，为水平活动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动次数（理毛次数）、粪便次数。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。每只大鼠测试3分钟。分别在造模前、给药前及给药后进行敞箱实验。 1.2.2标本采集 （1）HE染色 取大鼠脑组织，在4%甲醛溶液中固定24-48小时，用模具测量并用刀片切取海马区，石蜡包埋，进行切片和HE染色。使用光学显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 （2）电镜显微结构观察 解剖获取大鼠脑组织，将脑组织迅速放入3%戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。用模具测量并用刀片切取海马区作为标本进行俄酸包埋，使用电子显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 2.结果 本实验表明相同时间点组间比较第7、14、21、28天大鼠体重指数：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；糖水消耗实验：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；敞箱得分：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；大鼠活动延长时间：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标、高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。脑组织HE染色后，显微镜拍照观察脑组织的病理改变（Figure）。结果显示，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩，深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩，深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。 3.讨论 抑郁症患者常伴有一些生物性节律改变，如睡眠障碍、食欲不振、便秘、身体乏力、精力减退、性功能障碍等，这些生理症状应用西药抗抑郁药很难解决，甚至一些西药还会加重上述障碍，在上市销售明确用于抑郁症治疗的天然药物及中药复方制剂中，不是治疗单一，就是疗效不显著，而且用药一段时间极易出现病情反复的现象，同时症状更加严重。传统中药在复杂的抗抑郁治疗方面具有明显的优势，很多研究都表明祖国传统的经方名方对于抑郁症的治疗能够达到很好的疗效[3]。研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤复方具有较强的抗焦虑、抗抑郁作用，其作用机制可能与增加了脑内单胺类神经递质的含量密切相关[4]。宁神灵冲剂由二组药组成，一组舒肝郁、平肝火、清痰热，另一组扶心阳固心气。收敛神气之浮越，合之调节心、肝二脏之功能，使之趋于平衡，神志之病，脏腑辨证在于此二脏，二脏平和，消除各种精神神经症状。与西药作用迥然不同，它针对神经抑制和兴奋过程失调而组方，通过双向调节大脑皮层兴奋和抑制神经的过程，消除
小鼠海马区神经元的培养
小鼠海马区神经元的培养: 实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO3 0.84g， 青霉素104 U, 链霉素100mg， H2O 800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖），在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。最好用培养基洗2-3遍，以中止消化反应。 6、加少量培养基于试管中，以中空塑料管反复吹打10-15次，直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml，静置约10min。取1-2μl细胞悬液于99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中，用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数，从而测定细胞密度(细胞计数：活体细胞具有排斥台盼蓝的能力，而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。 7、根据实验需要，以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度，接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为（2-2.5）x105细胞/cm2. 8、待6-8h细胞贴壁后，换培养基为含2%B27的Neurobasal，含有B27 和0.5mM的谷氨酰胺。