一些抗氧化酶活性的测定
一、SOD 、POD 、MDA 和蛋白质测定
（1）酶液的提取（可用于测定SOD 、POD 、MDA 和蛋白质）
取0.5g 样品加5ml 0.05M （pH7.8）的磷酸缓冲液冰浴研磨（2ml 磨样，3ml 冲洗）后转入10ml 离心管中，4℃，10000rpm 离心20min ，上清液即为酶液
（2）SOD 、POD 、MDA 和蛋白质的测定
1 SOD 活性测定（NBT 法）
试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH7.8）；130mM 甲硫氨酸（Met ）；750μM 氮蓝四唑（NBT ）；100μM EDTA-2Na ；20μM 核黄素
② 将1支暗对照管置暗处，其余样品日光下（4000lx ）反应20min （时间可自行调节，反应体系颜色变化即可）。以暗对昭作空白调零，测定光对照及样品560nm 处吸光值。 ③ 计算SOD 活性（U/g ）=（（Ack-A E ）·V T ·D ）/（0.5·Ack ·W ·V R ）
（SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位）
Ack ：光对照管吸光度 A E ：样品管吸光度
V T ：酶提取液总体积（ml ） V R ：测定时酶液用量（ml ）
W ：样品鲜重（g ） D ：稀释倍数
2 POD 活性测定（愈创木酚法）
试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH5.5）；0.2%愈创木酚溶液；0.3% H 2O 2
① 3ml 反应体系 1.5ml 0.05M （pH7.8）PBS 0.3ml 130mM Met 0.3ml 750μM NBT 0.3ml 100μM EDTA-2Na 50μL 酶液（光对照和暗对照以磷酸缓冲液代替酶液，酶液用量可自行调节，以吸光值在0.1-0.9间即可）
0.25ml 蒸馏水 0.3ml 20μM 核黄素
① 3ml 反应体系 1.0ml 0.3% H 2O 2 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 1.0ml PBS （pH5.5）
50μL 酶液（酶液用量可自行调节， 以吸光值在0.1-0.9间即可）
最后加入H2O2或愈创木酚启动反应，可使反应体系混合更均匀
②以PBS pH5.5为对照调零，记录470nm处吸光值（以每1min增加0.01定义为1个酶活性单位）
③POD活性（U/（g·min））=（ΔA470·V T·D）/（0.01·W·V R·t）
ΔA470：反应时间内吸光度的变化V T：总的酶液提取液体积（ml）D：稀释倍数V R：测定时的酶液体积（ml）W：样品鲜重（g）t：反应时间（min）3MDA含量测定（TBA法）
试剂药品：0.6% TBA
①反应体系：1ml提取液+2ml 0.6% TBA，沸水浴15min，冷却离心，取上清在600,532,450nm 下测定吸光值
②MDA含量计算：
反应混合液中MDA浓度C（μmol/L）=（6.45·（A532-A600））-（0.56·A450）
提取液中MDA浓度（μmol/ml）=（C MDA·反应液体积ml）/（测定时提取液用量ml·1000）样品中MDA含量（μmol·g-1·Fw）=（提取液中MDA浓度·提取液总量ml）/植物组织鲜重g
4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
试剂药品：考马斯亮蓝
①标准曲线制作：参照《植物生理生化试验原理和技术》（王学奎版）191页
②提取液在室温下放置0.5-1h以充分提取，5ml考马斯亮蓝+100μL提取液（用量可调节），混匀，反应2-5min后，在595nm下比色
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡，其颜色可在1h内保持稳定，且在5-20min内颜色的稳定性最好
③样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=（X·V T·N）/（W·V S·1000）
X：根据样品的吸光度所查得的标准曲线值（蛋白质质量μg）
V T：提取液总体积ml W：样品鲜质量g
V S：测定时加样量ml N：稀释倍数
二、叶绿素含量的测定
试剂药品：95% 乙醇
①取叶片0.1-0.2g，剪成小块放入刻度试管，加95% 乙醇，于暗处放置12h，待叶片绿色褪尽，即可在665、649nm波长下测定吸光值
②叶绿素含量计算：
Ca=13.95·A665-6.88·A649
Cb=24.96·A649-7.32·A665
叶绿素含量（mg/g）=（C·V·N）/（W·1000）
C：叶绿素a+b含量（mg/L）V：提取液体积ml
N：稀释倍数W：样品鲜质量或干质量g
三、GSH、AsA含量测定
（1）测定液的提取
取一定部位的植物叶片(视需要而定，去叶脉)0.5g剪碎加入5mL 5% 三氯乙酸(TCA)溶液，研磨，15000r/min离心10min，上清液定容至5mL。
（2）GSH含量的测定
试剂药品：5%三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.7）溶液；100mM 磷酸缓冲液（pH6.8）；DTNB试剂（75.3mg DNTB溶于30ml 100mM pH6.8 PBS中）
①GSH标准曲线的制作：配置浓度分别为0mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、
0.10mM、0.12 mM的标准GSH溶液，吸取上述标准液各0.25ml，分别加入150mM 的NaH2PO4（pH7.7）2.60ml，混合均匀后，往各管中加入DNTB试剂0.18ml，摇匀后，30℃保温反应5min，测A412（以PBS代替DNTB试剂作空白对照）。将测定结果以GSH浓度为横坐标，光密度值为纵坐标制作标准曲线。
②GSH含量的测定：分别取上述样品提取液0.25ml，各加入150mM NaH2PO4（pH7.7）2.6ml、DNTB试剂0.18ml，以加磷酸缓冲液代替DNTB试剂作空白。摇匀后，于30℃保温反应5min，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量（GSH含量用μg/gFW 表示）。
（3）AsA含量的测定
试剂药品：5% 三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.4）溶液；10% 三氯乙酸（TCA）溶液；44% H3PO4；4% 2,2-二联吡啶；3% FeCl3
①标准曲线的制作：称取17.613mg的AsA，溶解并定容至100ml，得到1mM的标准母液，利用该标准母液分别配置浓度分别为0mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM的AsA溶液。吸取上述各标准液200μL于编好号的对应的不同试管中，分别往各管中加入150mM NaH2PO4 200μL，H2O 200μL，混合均匀，超过30s后再分别往各试管中加入10% TCA溶液400μL、44% H3PO4 400μL，4% 2,2-二联吡啶400μL，3% FeCl3 200μL，混匀后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的OD值，将测定结果以AsA浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。
②吸取上述制备好的样品上清液0.2ml，分别加入150mM的NaH2PO4（pH7.4）0.2ml、H2O 0.2ml，混合均匀，至少30s后，再依次分别往各管中加入10% TCA 0.4ml，44% H3PO4 0.4ml，4% 2,2-二联吡啶0.4ml和3% FeCl3 0.2ml，混合后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的吸光值。根据标准曲线计算样品中AsA的含量（AsA含量用μg/gFW表示）。
四、抗坏血酸过氧化物酶（APX ）活性的测定
试剂药品：0.05M PBS （pH7.8，7.0）；0.5mM AsA ；0.1mM EDTA ；0.1mM H 2O 2
① APX 酶液的制备：称取0.5g 材料剪碎，5ml 缓冲液冰浴研磨，4℃，10000×g 离心20min
② 活性测定：在3个比色皿中各加入20μL 提取液，再加入3ml 反应液，1号比色皿中不加AsA 和H2O2作为参照，2号比色皿中不加H2O2作为控制参照，3号比色皿中加入0.1mM H 2O 2启动反应，每10s 连续记录室温下290nm 吸光值的变化X 。以室温下每一分钟氧化1μmol AsA 的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
③ 计算活性U=（X ·V T ·1000·60·1000）/（W ·2.8·V R ·10）
X ：OD 值的变化 V T ：酶提取液总体积（ml ） 1000：将ml 转换成μL 60：将1min 转换成60s 1000：将mM 转换成μmol
W ：鲜叶质量g 2.8：吸光系数mM/L cm
V R ：测定时酶液用量（ml ） 10：每10s 记录吸光值的变化
部分常用试剂配制：
1 磷酸缓冲液（PBS ）：
母液：A 液 Na2HPO4·12H2O 71.64g+蒸馏水溶解，定容至1000ml
B 液 NaH2PO4·2H2O 31.2g+蒸馏水溶解，定容至1000ml
2 测SOD 用：
130mM Met （100ml ）：称1.9399g Met + pH 7.8 PBS 定容至100ml
避光→750μM NBT （100ml ）：称0.06133g NBT + pH 7.8 PBS 定容至100ml
100μM EDTA-2Na （100ml ）：称0。003721g EDTA-2Na + pH 7.8 PBS 定容至100ml 避光→20μM 核黄素（1000ml ）：称0.00753g 核黄素 + H 2O 定容至1000ml
3 测POD 用：
0.3% H 2O 2（250ml ）：吸2.5ml 30% H 2O 2 + pH 5.5 PBS 定容至250ml
0.2% 愈创木酚（250ml ）：吸0.5ml 愈创木酚 + pH 5.5 PBS 定容至250ml
4 测MDA 用：
5% TCA （100ml ）：称5g TCA + H 2O 定容至100ml
10% TCA （100ml ）：称10g TCA + H 2O 定容至100ml
0.05M （1000ml ） pH A 液ml B 液ml 5.5 10.75 239.25 7.0 152.5 97.5 7.8 228.75 21.25 加H 2O 定容至1000ml
10% NaOH（10ml）：称1g NaOH +10ml H2O溶解
避光→0.6% TBA（100ml）：0.6g TBA + 10ml 10% NaOH溶解+ 40-50ml 10% TCA将溶液调成弱酸性+ H2O定容至100ml （现配现用，棕色瓶保存）
5 测蛋白用：
考马斯亮蓝G-250：称100mg 考马斯亮蓝G-250 + 50ml 95% 乙醇溶解+ 85% 磷酸100ml + H2O定容至1000ml，棕色瓶中保存（常温下可放置一个月）
几种抗氧化酶的作用
一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。
这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两步：
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）
植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书 微量法
植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC3125 规格:100T/48S 产品内容： 试剂一：粉剂×2瓶。使用前加少量水溶解，定容至50mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体100mL×2瓶，4℃保存。 试剂三：乙酸乙酯，自备。 产品说明： 生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase,PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。 受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（TriphenylFormazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。 操作步骤： 一、样品处理： 称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。 二、测定步骤： 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。 2、操作表：取5mLEP管依次加入
对照管测定管 样品（g）0.10.1 试剂一（mL）1 试剂二（mL）21 充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样品，置于研钵/匀浆器中。 试剂三（mL）11 充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取200μL上清至微量 玻璃比色皿或96孔板中，测定485nm下的吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。 三、脱氢酶活力计算 A:用微量玻璃比色皿（光径，1cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.01为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.01÷T÷W=33×ΔA÷W。 B:用96孔板（光径，0.5cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.005为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.005÷T÷W=66.7×ΔA÷W。 T：反应时间，3h；W：样品鲜重，g。 注意事项： 1.配制好的试剂一避光保存于4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。 2.试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。 3.反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。 4.如果测定出来的吸光值较大，需把样品适当稀释再进行测定，注意计算公式乘以稀释倍数。 5.如果用96孔板进行检测，建议不要使用聚苯乙烯/聚丙烯材质的96孔板。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在
乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 货号：BC1080 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。临用前把试剂二转移到试剂一中，分装保存于-20℃。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。 ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm吸光度下降速率，来计算ADH活性。 自备仪器和用品： 研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提 取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。 2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞 加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。 3、血清等液体：直接测定。 二、ADH测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃水浴中保温30min以上。 3.空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。空白管只需做1~2个。 4.测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。 三、ADH活性计算： （1）按照蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mg prot)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷Cpr （2）按照样本质量计算 活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/g)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/104cell)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷细胞数量 （4）按液体体积计算 活性单位定义：25℃中每毫升样品每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mL)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管) ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测试剂盒说明书微量法
乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC0755 规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂40mg×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入3mL蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。 试剂三：液体0.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。 试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min。 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、操作表： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）40 蒸馏水（μL）10060 试剂一（μL）6060 试剂二（μL）2020 试剂三（μL）44 试剂四（μL）66 试剂五（μL）1010 在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱1min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定90s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、ALDH酶活计算 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。 ALDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Crp）÷T=804×△A÷Cpr （2）按样本质量计算
抗氧化酶的作用
重要的抗氧化酶和抗氧化剂的作用 超氧化物歧化酶（SOD）是美国的McCord和Fridovich在1969年发现的一种清除超氧阴离子自由基的酶。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，按金属辅基的成分不同主要分成三类,第一类含铜和锌，称为CuZn-SOD，是最常见的一种，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二类含锰，称为Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类含铁，称为Fe-SOD，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。另外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD[8]。 正常生理状态下，机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当机体内自由基产生增多，就会对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，导致机体疾病的发生。SOD是生物体内对抗氧自由基的一种最重要的抗氧化酶，是专门清除超氧阴离子自由基的。它的作用是将氧自由基歧化，发生2O2- +2H+ SOD H2O2 + O2的反应。由于H2O2 在SOD活性部位生成，会对SOD本身产生杀伤。催化产生的H2O2 如果不被及时清除，它会与O2-反应生成毒性更大的羟基自由基。衰老自由基学说认为，代谢产生的自由基对机体造成的损害可引起衰老，SOD可有效的清除自由基，在一定程度上延缓衰老。此外，SOD还具有增强机体免疫力，提高机体对自由基引发的疾病的抵抗力，消除运动性疲劳等生理功能[3]。 过氧化氢酶（CAT）是一种末端氧化酶，广泛存在于动植物和微生物体内，酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有四个铁原子[9]。CAT的生物学功能是催化过氧化氢分解为水和氧，2 H2O2 CAT 2H2O + O2 。过氧化氢酶（CAT），广泛存在于动植物和微生物体内的一种末端氧化酶。它的生物功能是催化细胞内的过氧化氢分解，起抗氧化作用，即2H2O2 2H2O+O2，它可防止过氧化氢含量过高对机体组织造成损伤，对细胞起到保护作用。 本研究结果显示，力竭运动后，大鼠的心组织、肝组织和肺组织中CAT活性均表现出升高，这可能是由于运动应激造成大鼠组织过氧化物质增多，使得组织CAT活性对应升高。同时，结果显示，联合补充谷氨酰胺和番茄红素对力竭运动大鼠肝组织和肺组织的抗氧化能力提高的效果最为明显，而单纯补充番茄红素对心脏
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
土壤脱氢酶活性的测定
土壤脱氢酶活性的测定 一、实验原理 脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。 已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。 二、实验材料、试剂和仪器 1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g 2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15ml Tris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml 0.4%TTC,7.6ml Na2S2O4，十几粒 甲醛，10ml 丙酮，20ml 3．仪器：50ml具塞比色管，6只 比色管架，1只 1~5ml移液枪，1只（枪头3个） 100~1000ul移液枪1只（枪头1个） 药匙1个 水浴锅1个 分光光度计1台 分析天平1台 离心管4只 培养箱1台
离心机1台 三、实验步骤 1．标准曲线的绘制 （1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。 （2）显色。 用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC 全部还原为红色的TF。用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min。 （3）测定吸光度，绘制标准曲线。 在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。 2．土壤脱氢酶活性的测定 （1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。 首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质 然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h。 （2）培养结束后，用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应，
酶活性测定方法
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介： APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。 二、测定操作表： 1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试
剂一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。
土壤脱氢酶(S-DHA)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
土壤脱氢酶（S-DHA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0390 规格：50T/24S 产品简介： 土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase,sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物的降解性能指标。 氢受体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride,TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，被还原为三苯基甲臜（Triphenyl Formazone,TF），TF呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得土壤脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计、玻璃比色皿，冰、蒸馏水、丙酮（不允许快递，请用户自备）。 产品内容： 试剂一：粉剂×1瓶，使用前加30ml水溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：丙酮，自备。 操作步骤： 一、样本前处理： 1.土壤样品：准确称取过40目筛的新鲜土壤样品约0.1g（以保证TTC与土壤颗粒充分接触）。 2.污泥样品：污泥用蒸馏水洗涤，12000rpm，25℃，离心10min，弃上清，反复3-4次。 二、测定操作： 对照管测定管 样品（g）0.10.1
试剂一（ml） 0.5试剂二（ml）10.5 充分混匀，37℃，暗培养6h，取出后立即冰浴5min 试剂三（ml）0.50.5 反复震荡数次，37℃保温10min，12000rpm，4℃，离心5min，取上清1ml 于1ml 玻璃比色皿， 分光光度计提前30分钟预热，蒸馏水调零，测定对照管和测定管，计算△A。 脱氢酶活力的计算： 酶活单位定义：在37℃时，每克样品每小时使每ml 反应体系OD 值每增加0.01为一个酶活单位。计算公式：sDHA 活性（U/g）=01.0△A ÷培养时间（6h）÷样品质量（0.1g）×V 反总（1.5ml） =250×A 485 注意事项： 1. 配制好的试剂一避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。3. 反应完成后立即冰浴以终止反应。4. 如果测定出来的吸光值较大，减少样品用量再进行测定，若吸光值过小则延长培养时间。5.试剂盒2-8℃保存。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
超氧化物歧化酶活性的测定
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法 【实验目的】 1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。 【实验原理】 超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。 超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ： 2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O 超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。 当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。 【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管 2. 实验试剂 50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液； CAT SOD