酶的固定化
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1）离子键结合法：
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法
所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法
载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：
（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；
（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等
（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：
Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：
（1）重氮化法
（2）叠氮法
（3）溴基化法
（4）烷基化法等。
4、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法
借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法
共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
5、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。
严格控制加热温度和时间。
细胞的固定化方法
利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。
用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。
(2) 包埋法
包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。
固定化酶的新方法
1、新型固定化材料的应用
2、（多酶系统）共固定化技术
3、基因工程重组菌的固定化技术
4、定向固定化新技术
新型固定化材料
随着材料科学迅速发展，固定化酶的新材料日益增多；如藻酸铬代替藻酸钙固定化米曲霉β-葡萄糖苷酶，稳定化大为提高；戊二醛硬化后的藻酸盐和明胶；丙烯酸大孔树脂，磁性载体等。
共固定化
共固定化技术已经广泛应用，有酶-酶、酶-辅酶、酶-细胞、细胞-细胞共固定化于同一载体上，例如共包埋于同一凝胶内，参与两步以上的酶催化反应。
基因工程重组菌的固定化技术
重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有很大提高。
在游离重组菌系统中常用抗生素、氨基酸等选择性压力稳定质粒，在大规模生产应用中因费用太高往往难以接受。
采用固定化方法后，这种选择压力可被省去。
定向固定化技术
固定化酶的存在问题：由于酶蛋白可以通过几种氨基酸残基附着在固定化载体上，酶和载体可以产生多点的结合，因固定化酶的位阻障碍而妨碍底物进入酶的活性中心，严重影响酶活力。
近来，已经寻求到几条不同途径，使酶蛋白能够以有序方式附着在载体的表面，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，这样就能有利于底物进入到酶的活性位点里去，而使酶活性的损失降到最小。
酶的定向固定化方法
定向固定化方法主要有：
（1）借助化学方法的位点专一性固定化；
（2）磷蛋白的位点专一性固定化；
（3）糖蛋白的位点专一性固定化；
（4）抗体（免疫球蛋白）的位点专一性固定化；
（5）利用基因工程的位点专一性固定化等等。
这种有序、定向的固定化技术已经应用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究。
第二节固定化酶的特性
一、固定化酶的特性
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
（一）酶的活性
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
固定化后，一般来说酶的热稳定性、贮藏稳定性和使用稳定性普遍增加。
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；
抑制酶的自身降解。
固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。
（三）酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
将酶固定于多聚阳离子性载体上时，最适pH向酸性一侧移动；将酶固定于多聚阴离子性载体上时，最适pH向碱性一侧移动；
酶催化的产物为酸性时，固定化酶的最适pH将升高；反之产物为碱性时，固定化酶的最适pH将降低。
（五）酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数K m随载体的带电性能变化。
固定化载体与底物电荷相反，促进底物扩散，固定化酶的表观K m值降低。
固定化载体与底物电荷相同，有扩散阻力，固定化酶的表观K m值显著增加。
（六）底物特异性
酶固定化后，由于形成立体障碍，当底物为高分子时，高分子底物难以接近酶分子。固定化酶对大分子底物作用速度降低。
小分子底物不受影响。
二、固定化酶的酶活力测定
1、常用的酶活测定方法：
振荡测定法
酶柱测定法
连续测定法
2、固定化酶的比活力单位定义
在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。即：为每克干重固定化酶每分钟转化底物(或生成产物)的μmol量，表示为μmol/(min·mg)。
若是固定化酶膜、酶管、酶板，则可用单位面积的酶活力单位表示，即酶活力单位/cm2。需注明测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、用于固定化的游离酶含量或蛋白质含量、及用于固定化的游离酶的比活力。
3、固定化酶的评价指标及其测定
主要指标：固定化酶的活力，结合效率或相对活力，半衰期等。
另外，载体活化程度和固定化配基密度等也是固定化常用的考察指标。
酶结合效率、相对活力和活力回收
酶结合效率或相对活力用以表示固定化过程中引起的酶失活，以及影响固定化酶性质诸因素
的综合效应。
酶结合效率= (加入的总酶活力-未结合的酶活力）
÷加入的总酶活力× l00%
相对活力= 固定化酶总活力÷(加入的总酶活力-未
结合的酶活力) ×100%
酶活力回收率= 固定化酶总活力÷用于固定化的总
酶活力× l00%
固定化酶的半衰期t1/2
半衰期是衡量固定化酶稳定性的重要指标，即固定化酶活力下降为初始活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2 表示。
直接测定
通过较短操作时间后酶活力变化，由下式推算：
在没有扩散限制时，固定化酶活力与时间成指数关系：
t1/2=0.693/K d
K d=2.303/t ×Log(Eo/E)
K d：衰减常数；E o：初始酶活；E：t时间后酶活力
t1/2=0.693/2.303×t/log(Eo/E)=0.3009×t/log(Eo/E)
第三节固定化技术的应用
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。自学
第九章酶的非水相催化
第一节酶非水相催化的研究概况
酶只有在水溶液中才具有催化活性吗?
1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。
开辟了酶工程领域新的研究方向—非水酶学。
促进了生物催化反应的溶剂工程。
已发现有十多种水解酶和氧化还原酶在有机溶剂中具有催化活性。
非水介质：有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质、低共熔混合介质等。拓展了酶在工业生物转化中的应用，尤其是在不对称合成转化光化学纯度的医药、农药、精细化工、新材料、手性化合物或手性模块物质方面的应用。
1、有机介质中的酶催化
有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。
适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。
酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。
酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。
2、气相介质中的酶催化
气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。
适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。
由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。
干燥状态的脱硫弧菌氢化酶可以活化氢分子，进行反应，而水质子不参于反应。
3、超临界流体介质中的酶催化
用于酶催化反应的超临界流体应具有的特性：
对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；
良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；
超临界压力不能太高，节约压缩动力费用；
超临界流体要容易获得，价格要便宜等
4、离子液介质中的酶催化
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。
酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。
离子液介质种类：p219-220
5、低共熔混合介质
两种或两种以上物质混合后，形成熔点降低的混合物称之为低共熔混合物。
低共熔混合物并非化合物，原则上它可以被机械方法分离为两纯组分。
熔点为179℃的樟脑45g与熔点为42℃的水杨酸苯酯55g混合后，测其熔点仅为6℃。
非水相介质中酶催化的特点
1、可以将加水分解反应转为其逆反应
2、酶的热稳定性高
3、容易回收和反复利用
4、改变酶对底物的专一性
5、提高有机化合物（尤其是非极性底物）的溶解度
6、低沸点溶剂中可容易分离纯化产物
非水相介质中酶催化的特点
7、能抑制依赖于水的某些不利反应和副产物的产生
8、解除或减少某些产物对酶的抑制作用
9、没有微生物的污染
10、非水系统中酶不易脱离吸附表面，易于酶的固定化
有机相反应介质的种类
a.水与水混溶有机溶剂，均匀混合物，单相。
b.水与水不相混溶的有机溶剂，二相系统。
c.酶粉悬浮在有机溶剂
d.酶与载体结合后，悬浮在溶剂中
e.酶溶解在含水的有机溶剂、表面活性剂的微乳液中
f.共价修饰酶溶于有机溶剂。
(1)微水介质体系
是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。
微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。另外有一部分水分配在有机溶剂中。
酶以冻干粉或固定化酶形式悬浮于有机介质中，在悬浮状态下进行催化反应。
通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。
(2)与水溶性有机溶剂组成的均一体系
是由水和极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。
酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在该反应体系中进行催化反应的酶较少。
如：辣根过氧化物酶（HRP）
(3)与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系
是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。
如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。
催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。
(4)（正）胶束体系
是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。
表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。
反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。
反应在胶束的两相界面中进行。
(5)反胶束体系
在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。
表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。
反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部。
催化反应在两相的界面中进行。
第二节水对有机介质中酶催化反应的影响
一、水与酶的柔性
酶分子有相对刚性和柔性两个部分
根据酶与底物的诱导契合原理，酶活性部分保持一定的柔性是酶表现其催化活性所必需
实验研究表明：有机溶剂对酶的二级结构没有大的影响
酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。
必需水与酶分子的结构和性质有密切关系
溶菌酶分子的水合过程：
0~0.07g/g蛋白质，一个酶分子周围有0~60水分子，蛋白质自由度很小，没有表现出酶活性0.07~0.25g/g蛋白质，一个酶分子周围有60~220水分子，酶活性显现
0.25~0.38g/g蛋白质，一个酶分子周围有220~300水分子，酶活性逐步升高
＞0.25~0.38g/g蛋白质、＞300水分子，酶分子表面完全水合，酶活降低。
二、结合水
生物反应体系中的水分成溶剂水和结合水。
在酶的催化反应过程中，底物分析先从有机相进入酶表面的水相与酶形成底物-酶复合物后再发生反应。
在绝对无水条件下，酶分子表面含有大量带电基团，和极性基团相互作用而形成“锁定”的失活构象，加入适量水分子充当润滑剂会使酶的柔性增大，维持酶的活性构象。
如果有机溶剂取代了溶剂水，不取代结构水，将不会改变酶的活性构象，不会对活性产生很大的影响。
仿水溶剂：甲酰胺、乙二醇等。
三、水活度（Aw）
研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。
水活度用来描述有机溶剂中酶活性与水含量的关系。
水活度（Aw）：体系中水的逸度与纯水逸度之比。
可以用在一定温度和压力下反应体系中水的摩尔分数χw（凯）与水活度系数γw（伽玛）的乘积。
A w= χw ×γw
在低压条件下，水活度A w是气相中水的分压与同温度下纯水的蒸气压的比值
A w=(Y w ×P) / P0 = P w / P0
水活度
最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。
在给定的有机溶剂中，水活度随水含量的增加而增大；
对于给定的Aw，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂要少
四、水对酶活力选择性的调节
有机相酶促反应中每个酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下，与溶剂的极性无关，而最佳水活度Aw都在0.55左右。
水活度对酶活力的影响程度随着溶剂的不同而不同。
水对酶的立体选择性也有一定的调节作用。
水活度的概念同样适用于固定化酶。
第三节有机溶剂对有机介质中酶催化
的影响
常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。
(1)有机溶剂对酶结构与功能的影响
有些酶在有机溶剂中，其空间结构会受到某些破坏，使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。
当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。
有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力。
(2)有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。
有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。
P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。
研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。极性系数lg P< 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。
(3)有机溶剂对底物和产物分配的影响
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。
有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。
一般选用2≤lg P≤5的有机溶剂作为有机介质为宜
(4)有机溶剂对酶选择性的影响
有机溶剂中酶的刚性增强，活性中心结构改变，与底物结合的选择性改变；
以此调节酶对底物的选择性，尤其是针对异构体化合物的催化合成。
第四节非水相中酶催化的特性
一、热力学稳定性
二、酶的特异性
1、底物选择性
在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。
不同的有机溶剂具有不同的极性，底物在水和有机溶剂两相中的分配系数不同，导致酶的底物专一性也不一样。
在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应
2、立体选择性
又称为对映体选择性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。
3、位置选择性
酶在有机介质中进行催化时，酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。
4、化学选择性
酶选择性地催化底物分子中不同功能基团中某个基团的反应特性。
另外，具有化学键选择性
5、其他特性
分子记忆：根据分子识别理论，酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象，从而获得与配体类似物结合的能力，这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆。
pH记忆：在有机介质反应中，酶所处的pH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH 值相同。这种现象称之为pH记忆
酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同第五节有机介质中酶催化反应
的条件及其控制
有机介质中酶可以催化多种反应，主要包括：
合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。
有机介质中酶催化反应的条件和控制
酶的选择
底物的选择和浓度控制
有机溶剂的选择
水含量的控制
温度的控制
pH的控制
用微生物或酶拆分手性化合物
β-阻断剂普萘洛尔的酶法拆分
β-阻断剂是用于治疗高血压和心肌梗死类疾病的一种药物，其典型的结构式为含有仲醇类外消旋体药物，如:普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗心安等。
普萘洛尔(Propranolol，心得安)，是常用的非特异性β-阻滞药，能拮抗肾上腺的作用，预防心律失常或心肌梗塞，作为高血压治疗用药。国内销售为外消旋混合物，其左旋体的β-受体阻滞作用很强，右旋体则很弱，还有奎尼丁样作用或局麻作用。
S(-)-异构体的活性是R(+）-异构体的100倍以上。
脂肪酶水解
用脂肪酶对外消旋普萘洛尔合成生产的中间体1-氯-3-(1-萘氧)-2-丙醇(简称萘氧氯丙醇)的酯进行水解；
或利用微生物酶对外消旋的萘氧氯丙醇进行立体选择性酯化、酯基转移；
拆分后得到的手性中间体R(-)-氯醇酯或R(-)-氯醇，e.e.值（对映体过量值）可大于95%。在碱溶液中再与异丙胺反应即能合成S(-)-普萘洛尔。
各种酶固定方法
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶 1、固定化载体的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。 2、载体选择 取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。 ３、固定化条件的优化 取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。 4、蛋白质含量测定 采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。 5、酶活收率 指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。 6、酶活测定 以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在
60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。 二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶 1、固定化载体及其预处理 选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290 和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。 2、脂肪酶的固定化 采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
2017高考生物一轮复习教案：专题27考点二 固定化酶和固定化细胞 含解析 精品
考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
酶的固定化
酶的固定化 固定化酶是酶工程的核心，利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。下面以酶的固定化方法为核心，介绍一些有关固定化技术的研究新进展。 1 吸附法 利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定方法。该方法最显著的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶的变异失活，且载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。 通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。纵伟、刘艳芳等(2008)以磁性壳聚糖微球作为新型载体，并采用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，同时比较了游离酶和固定化酶的pH值和热稳定性。结果表明，固定化的适宜条件为：加酶量600 U／g，温度5℃，pH 7．0，固定化时问2 h。固定化酶的pH值和热稳定性都优于游离酶，
固定化酶连续使用5次后，其相对酶活仍为使用前的57.8％，具有较好的操作稳定性。近年来，随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟，人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。与其他材料相比，介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。 王炎等(2008)以介孔分子筛MCM一41作为载体，采用物理吸附法对漆酶进行了固定化，考察了时间、pH和给酶量对固定化效果的影响，并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究，讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。结果显示，在pH为3.0时，酶和载体比例为62.5 mg／g时吸附12 h固定化效果最好，固定化酶活性回收率为50％。与游离漆酶相比，MCM一41固定化漆酶的最适反应pH略有升高，最适温度没有变化，其pH稳定性和热稳定性都显著优于游离漆酶。固定化漆酶具有可重复操作的性质，与底物反应反复操作1O批次后剩余活性为4O％。 将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合 的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等。陈姗姗等(2008)以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂，对果胶酶进行固定化分析，探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时问对果胶酶固定化效果的影响，同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究。研究结果表明，果胶酶的最佳固定化条件为：温
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化 试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威 资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。 选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。也就 是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学 会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。 问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固 定化细胞？ 01 1.固定化酶技术 固定化酶技术是用物理或化学手段。将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。 酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。 2.固定化酶技术的发展 以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。 1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。 我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。 当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。 邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。 Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。 3.现阶段固定化酶技术存在的缺点 （1）一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。 （2）固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。 （3）首次使用时投入成本较高。
第三章 固定化酶与固定化细胞
?第三章固定化酶与固定化细胞 ?第一节概述 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?第三节固定化酶的制备 ?第四节固定化细胞 ?第五节固定化辅酶和原生质体 ?第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 ?第一节概述 ?什么是固定化酶？ ?第一节概述 二．固定化酶的优缺点 ?多次使用 ?可以装塔连续反应 ?优点：纯化简单 ?提高产物质量 ?应用范围广 ?缺点：首次投入成本高 ?大分子底物较困难 ?第一节结束 ?点击返回 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?一．影响固定化酶性质的因素 ?二．固定化后酶性质的变化 ?三．评价固定化酶的指标 ?一．影响固定化酶性质的因素 1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 ?二．固定化后酶性质的变化 ?1．固定化对酶活性的影响： ?酶活性下降，反应速度下降 2．固定化对酶稳定性的影响 ?稳定性提高（原因） ?3．pH的变化（原因） ?载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 ?载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 ?催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 ?酶的pH值高；反之则低 ?固定化后酶稳定性提高的原因： ? a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 ? b. 酶活力的释放是缓慢的。 ? c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。 ?PH 对酶活性的影响： ?（1）改变酶的空间构象 ?（2）影响酶的催化基团的解离
?（3）影响酶的结合基团的解离 ?（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 ?4．最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5．底物特异性变化 ?作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化 ?既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 ?特异性往往会变化。 6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） ?米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km'=Km/ρ(表观米氏常数) ?（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。 ?（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km' 固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有： 张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章 第九章 固 固定化酶与固定化细胞技术 第一节固定化酶 ?固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 ?酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。 固定化酶的特点（与游离酶相比） ?（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化； ?（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化； ?（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ?（4）酶的反应过程能够严格控制； ?（5）酶的利用率提高，生产成本降低； ?（6）能够进行多酶反应； ?（7）可以增加产物收率，提高产物的质量； ?（8）增加了生产的成本； ?（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。 一、固定化酶的制备方法 ?根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则： –（1）必须维持酶的催化活性以及专一性； –（2）有利于实现连续化和自动化； –（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量； –（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用； –（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应； –（6）成本要低，以便于工业使用； 实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。?（一）包埋法： –1、网格型 –2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法?（二）吸附法： –1、物理吸附法 –2、离子吸附法 ?（三）、共价偶联法 ?（四）、交联法 ?（五）、共价结合法 –1、结晶法 –2、分散法 第五章酶与细胞固定化技术 教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。 教学办法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺陷办法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。 四、固定化酶长处 增长了酶稳定性 能减少酶总体费用 酶分离和回收变得容易，并可重复使用 使反映过程持续操作成为也许 反映产物也易于提取纯化 有助于过程设计和优化 拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法 一、酶固定化办法 1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化办法 2、选取办法根据： ⑴酶性质 ⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 ⑶制备办法简便易行 ⒊衡量根据： ⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率； 第五章酶与细胞的固定化技术 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。 （二）包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒 固定化酶 水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。 酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。 物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。 化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过 酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。 具体方法 吸附法 利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。 1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可 以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。 2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 3载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。共价键结合法:共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。此法研究较为成熟，其优点是酶与载体问连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。 4包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？ 本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？答：固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。吸附法有物理交换法和离子交换法两种。其中本实验采用的又是物理交换法。该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。 第四节 酶的固定化 【课标要求】 1．掌握固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2．尝试制备固定化酶，并检验酶的活性 【知识梳理】 （向下移动位置） 实践案例：木瓜蛋白酶的固定化 1．木瓜蛋白酶的作用：可以使蛋白质水解成 ，供酵母菌 所需，从而 发酵时间，提高啤酒 ，使酒质 醇和。 2．材料器具：见课本49页 3．活动程序： （1）酶的固定化 方法： ↓ 载体： 经一系列操作后，即可得到 。 （2）检验酶的活性 最适宜温度 ↓ 双缩脲试剂A 液和B 液 1号烧杯颜色： 2号烧杯颜色： 原因 （3）酶的再利用 3号烧杯颜色 ↓ 说明了 。 （向下移动） （4）结果记录 小结： 和 技术的应用，大大提高了酶在生产上的利用率。 定义：通过 或 的方法，将水溶性的 与不溶性的 结合，使酶固定在 上，并在一定的空间范围内进行 ， 这样制成的酶称为 。 ① ：将酶通过 以 结合到 等 上。 方法 ② :将酶均匀 在 等多孔性的 中的固定化方法。 ③ ：将酶吸附在载体表面上而被固定。 优点：固定化酶活性 ，可以 使用 次。 工业生产可以实现 、 、 极大降低生产成本。 1．固定化酶 2．固定化细胞 定义：利用适当的 将合成酶的 固定起来。 方法：多采用包埋固定法。（原因：细胞个大，而酶分子较小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。 优点：操作更容易更 ，使用 更长。 固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作。 探究活动：大肠杆菌细胞的固定化 1．用培养基培养大肠杆菌，取1ml 加入烧杯中，再加入8ml 和体积分数为9%的1．6ml，搅拌均匀，待凝固后，切成小块，用和洗涤，即得到固定化大肠杆菌细胞。 2．胰凝乳蛋白酶的固定化 从提取，并以为载体，将胰凝乳蛋白酶固定化。 【复习指要】 1．学法指导：本节课应初步学会固定化酶的方法，引导学生理解固定化细胞和固定化酶这两种技术的区别与联系，辩证地认识这两种技术的优势与不足。本节课的固定化酶的方法和制备固定木瓜蛋白酶的操作过程应引起重视，在高考选择题和实验题中都有可能体现。 2．疑难解析： 辩证地认识固定化细胞和固定化酶两种技术的优势与不足。如：固定化细胞操作容易，对酶活性的影响更小，可以催化一系列的反应，容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。 【典题解析】 1．关于固定化酶技术说法正确的是（） A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C．固定化酶中的酶无法重复利用 D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术 [解析]固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用，不足是无法同时解决一系列酶促反应。 [答案]D 2．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（） A．温度B．PH C．水分D．营养 [解析] 固定化酶技术是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术,利用了酶的高效性和专一性．酶与微生物比较来说,它的活性发挥不需要营养． [答案]D 【聚焦高考】 酶的固定化的方案 一、材料和方法 1.实验材料及试剂 酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。 2. 主要实验仪器 紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计 3.酶的固定化方法 1）载体的活化 a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。 b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。 举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。 2）固定化方法 a 共价结合法 准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。 b 酶聚集体包被法 准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。 酶固定化载体材料综述 ————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期: 酶的固定化载体材料综述 摘要：固定化酶是一种高效、高选择性和反应条件温和的生物催化剂。有关酶固定化的研究越来越受到人们的重视,相关的研究报道很多。酶固定化载体材料按组成可分为无机载体材料、高分子载体材料以及复合载体材料三大类。本文从这三个方面简单综述了一些相关研究实例。 关键词：酶固定化,载体材料，无机,高分子,复合材料 1.引言 酶(enｚyme）是天然的生物催化剂，可以在常温、常压下参与体内的各种代谢反应。相比于传统的催化剂,由于具有能量消耗低、催化效率高、立体选择性专一以及合成路线较短等特点,使用酶催化反应被认为是环境友好且经济的[1]。然而，酶也不可避免地存在一些缺点,比如反应操控性低,不能回收利用,难以商品化发展。为克服这些问题，固定化酶(immobilized eｎzyme)的概念被提了出来。早在19１0年,人们就已经开始了酶的固定化研究，然而直到上世纪60年代,酶固定化技术才得到快速发展。通俗来讲，酶固定化就是利用固体材料将游离态的酶在一定范围内束缚受限起来，赋予酶易分离、可回收利用等特点的同时保持其本身优异特性不变。 研究酶的固定化可从两个方向进行,一个是固定化方法与技术的改进,另一个方向是改进或开发新的用于固定化的载体材料。对于前者,我们知道,主要的方法包括吸附法(包含物理吸附与离子吸附),交联 法，共价键法以及包埋法,以及近年来研究得比较多的定向固定技术等[2]。对于后者的研究，我们也能发现，越来越多的新材料开始被开发应用于酶固定化。本文从载体材料方向出发，结合若干实例,来简单介绍下酶的固定化研究。 2.酶固定化载体材料 经过半个多世纪的发展，已经开发出来的用于固定化酶的载体种类繁多。按照载体材料的基本组成，可以分为无机载体材料、高分子载体材料、复合载体材料三大类。 2.1 无机载体材料 这一类研究得比较多的是介孔材料,如介孔硅粒子(meｓoporous siｌｉca particｌｅs）。根据国际纯粹与应用化学(ＩUＰAC)定义,孔径在2-5０nｍ的材料被称为介孔材料。一般选取孔径略大于酶分子直径的介孔材料作为载体,并且在酶被吸附到孔中后，利用硅烷化处理等技术将孔口直径大幅缩小以防止酶在反应中脱附流失。 我们知道，介孔硅粒子有很大的比表面积,而一般情况下,酶分子都是被吸附到孔的内表面。JungbaｅKim等[3]制备了一种“洋葱”状多层的介孔硅。如图１所示,显然,这种结构的载体材料可以实现更高的酶的负载率。除此之外，相比较传统介孔硅纳米粒子,该结构由于没有外层表面,它能够使负载的酶具有更好的热稳定性。作者提出所谓的纳米酶反应器（NEＲ），以脂肪酶为例，将每层中的酶分子交联起来,可以有效防止酶分子从载体中脱附下来。 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 1）离子键结合法： 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法 所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 2）共价键结合法 载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括： （1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等； （2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等 （3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。 用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有： Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。 在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。 载体活化方法： （1）重氮化法 （2）叠氮法 （3）溴基化法 （4）烷基化法等。 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。 常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。 其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。 交联酶法 借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。可视为一种无载体的固定化方法。 如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。 共交联法 共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。 通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。 如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。 5、热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。 严格控制加热温度和时间。 细胞的固定化方法固定化酶的研究进展
固定化酶和固定化细胞技术
酶与细胞固定化技术样本
第五章酶与细胞固定化技术
固定化酶与固定化细胞
固定化酶的四种方法
高二生物酶的固定化
酶的固定化方案
酶固定化载体材料综述
酶的固定化