食品化学

纤维素酶降解纤维素是发生在固、液相界面非常复杂的一个过程, 影响这个动态过程的因素

有很多, 如纤维素结晶区的类型、聚合度、分子质量及供酶作用的表面结构等等[10]。另外, 在降解过程中纤维素的降解速率呈先快后慢的变化规律,因为在开始降解的时候, 纤维素表面有充足的酶作用位点, 降解效率很高, 但随着反应的进行, 可利用作用位点的数量逐渐减少, 酶的降解效率也随之降低。研究表明, 纤维素表面的结构特征是影响纤维素酶作用的重要因素[11]。 3 纤维素酶的来源初期的研究主要集中在微生物纤维素酶方面, 但随着对纤维素酶研究的不断深入, 动物纤维素酶也成为纤维素酶研究的热点。纤维素酶来源非常广泛, 植物、微生物( 细菌、粘细菌、放线菌、真菌等) 、原生动物、昆虫等都能产生纤维素酶。

3.1 产纤维素酶微生物细菌的纤维素酶产量不高, 主要是葡聚糖内切酶, 且大多数对结晶纤维素没有活性, 所产的纤维素酶很少能分泌到细胞外, 增加了提取纯化难度, 在工业上很少应用。闫章才在国内首次对溶纤维素粘细菌的纤维素酶的作用机制进行了研究,发现该菌所分泌的纤维素酶以复合体的形式附着在菌体细胞的表面, 发挥很强的纤维素降解功能,但是各组分在单独存在时活力却很低[12]。最近, 大连轻工业学院获得一株能够彻底降解纤维素的放线菌, 经系统分类学鉴定和分子生物学比较, 该菌被确定为新菌, 并定名为Streptomyces cellulolyticus,已被列入国际微生物协会新菌目录[13]。真菌分泌的纤维素酶主要可以分为2 类: 一类来自白腐真菌和软腐真菌, 包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β- 葡萄糖苷酶的完整纤维素酶系, 它们可以将纤维素完全分解为葡萄糖; 另一类是不含有葡聚糖外切酶, 通过氧化因子与葡聚糖内切酶协同作用来降解纤维素, 如褐腐菌Postiaplacenta 分泌的纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物主要为木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属。诱变育种( 采用紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器, 亚硝基胍等物理、化学的诱变方法) 是解决天然菌株纤维素酶产量低和组分不合理的一种有效方法, 随着现代生物技术的迅速发展, 原生质体融合和基因工程等方法也得到了越来越广泛的应用[14]~[16]。另外, 为了弥补单种微生物酶组分的不足,研究人员尝试将2 种微生物同时培养, 通过它们分泌酶的协同作用, 达到彻底降解纤维素的目的[17]~[21]。

3.2 动物内源性纤维素酶为了克服微生物纤维素酶的一些不足, 人们试图从其他生物中寻找更具有应用前景的纤维素酶, 因此动物纤维素酶逐渐成为研究的重点。最初, 人们普遍认为动物自身不含有纤维素酶,那些食木性的节肢动物以及草食性动物是通过体内共生生物来利用纤维素的。但是随着研究的深入, 人们逐渐发现动物体内的纤维素酶与其体内的生物并没有直接的关系。Scrivener 在研究食木蟑螂时发现, 纤维素酶活性只在其前肠和中肠中存在, 而在有大量原生生物存在的后肠中却未检测到纤维素酶的活力, 首次证明了动物体内确实存在内源性的纤维素酶。随后, 对线虫、贻贝、鲍鱼、甲虫、福寿螺等体内纤维素酶基因进行克隆, 进一步证实了内源性动物纤维素酶的存在[22]~[25]。

4 纤维素酶的制取工艺及应用 4.1 纤维素酶的制取工艺纤维素酶的制取方法有2 种: 即固体发酵和液体发酵。生产原料有麸皮、秸秆粉、废纸、玉米粉和无机盐等。固体发酵生产工艺是以玉米、稻草等植物秸秆为主要原料, 通过接种微生物进行发酵, 具有投资少、工艺简单、产品价格低廉等优点。但固体发酵法存在着根本缺陷, 即生产的纤维素酶很难进行提取、精制。液体发酵生产工艺是将秸秆粉碎至20 目以下的颗粒并进行灭菌处理, 然后在发酵罐内发酵,物料在发酵结束后经压滤机压滤、超滤浓缩和喷雾干燥后得到纤维素酶产品。液体发酵虽有发酵动力消耗大、设备要求高等缺点, 但液体发酵原料利用率高、生产条件易控制、产量高、工人劳动强度小、产品质量稳定、可大规模生产等优点, 因此该方法成为发酵生产纤维素酶的主要方法。

5 研究展望在自然界中分离得到的各种菌株, 都不同程度地存在酶产量低或者组分不合

理的问题, 这直接影响到纤维素的降解程度。笔者认为今后纤维素酶的研究重点主要集中在以下3 个方面。①深入研究纤维素酶的作用机制, 充分发挥各组分的作用, 并通过彼此间的协同作用使纤维素得以充分水解。②进一步从自然界中选育更好的纤维素酶高效菌株, 为产

纤维素菌株的进一步改造打下良好的基础。③深入研究不同来源纤维素酶及不同菌株间的协同作用, 达到高效降解纤维素的目的。参考文献:[1] 宋波,邓晓皋.纤维素酶的研究进展[J].上

海环境科学,2003,22( 7) : 491- 494.丁少军, 美静, 杨红军.中性内切型纤维素酶在毕赤酵母

中高水平表达的研究[J].生物工程学报, 2006, 22( 1) : 71- 76.[16] 丁新丽,汪天虹,张光涛,等.

瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究[J]. 酿酒科技, 2004, 30( 7) :18- 22.[17]

沈雪亮, 夏黎明.固定化纤维二糖酶在纤维原料水解中的应用[J]. 浙江大学学报( 工学版) , 2005, 39( 2) :287- 305.[18] 曹健, 郭德宪.一株里氏木霉产纤维素酶的条件及酶系的优化[J].郑州工程学院学报, 2003, 24( 1) : 10- 14.

[26] 陈益人,张一鸣.纤维素酶对纤维素纤维织物的后整理[J].印染助剂, 1999, 16( 3) : 24- 26.

[27] 刘翔,何国庆.纤维素酶及相关酶在食品生物技术中的应用[J].粮油加工与机械, 2003( 6) : 61- 63.[28] 邱雁临.纤维素酶的研究和应用前景[J].粮食与饲料工业, 2001( 8) : 30- 31.

纤维素酶的应用前景随着工业化的快速发展，化石燃料的消耗使能源面临枯竭，同时化石燃料燃烧产生的温室气体。有毒气体使环境污染日益严重，生态平衡遭到破坏，因此，迫切地需要一种环境能够承受的，可再生的能源来代替化石燃料。从20 世纪80 年代开始，人们就开始以谷物为原料来生产乙醇用作供氧燃料，在一些西方国家，如美国、加拿大等，乙醇已经被广泛地掺入到汽油中来代替纯汽油使用，其中乙醇的体积含量可达10%。美国每年要消耗45.4亿升乙醇，占全国汽油总消耗量的1%。最近美国汽车制造商宣布计划生产一种可

使用乙醇混合物E85即85% 的乙醇和15% 的汽油（体积比）的汽车[23]。混合燃料的使用不

仅可以减少汽油的使用量，还可以降低温室效应气体以及有毒气体的释放。但是随着世界人口的不断增长，以谷物为原料生产乙醇就与食品的供应之间存在竞争。另外，除每年光合作用产生大量的纤维素物质外，人类活动产生的废弃纤维素以及城市废物（含有大量的纤维素物质）给环境卫生造成了很大的破坏。因此，利用纤维素酶有效地将这些纤维素物质转化成葡萄糖等简单糖，然后通过微生物发酵的方法将葡萄糖转变成乙醇，将具有重大意义。如何才能实现这一可再生资源的最合理最有效的利用呢？纤维素物质的预处理以及纤维素酶在

水解过程中酶活性的最大发挥是很重要的。预处理可以去除木质素和半纤维素，降低纤维素的结晶度并且增加纤维素物质的可接触面积；表面活性剂，如Tween 80 的加入可以使纤维素酶水解报纸的速度提高33%，另外，β- 葡萄糖苷酶的加入可以解除纤维二糖的抑制作用，增加水解效率。但是问题的关键在于纤维素酶。为了满足竞争的需要，生产每加仑乙醇的纤维素酶的成本应该不超过7 美分。美国国家再生能源办公室也提出这样一项策略：要尽量将纤维素酶系统的复杂度降低到少量几种必须组份，更重要的是利用基因工程的方法生产出能够更有效的水解预处理过的纤维素物质的重组型纤维素酶[ 2 4 ]。因此，要实现纤维素物

质到再生能源的转化，主要有两点：一是要找到适合于工业生产的高比活力的纤维素酶。细菌和真菌产生的纤维素酶均可以水解木质纤维素物质。这些微生物有好氧的，有厌氧的；有嗜温的，有嗜热的。产生纤维素酶的细菌有梭菌属(Clostridium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、杆菌属(Bacillus)、高温单胞菌属(Thermomonospora)、瘤胃球菌属( R u m i n o c o c c u s ) 、拟杆菌属(Bacteriodes)、欧文氏菌属(Erwinia)、醋弧菌属(Acetovibrio)、小双孢菌属(Microbispora)和链霉菌属(Streptomyces)等。纤维单胞菌(C. fimi )和高温单胞菌(T. fusca)是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。虽然许多纤维素酶产生菌，尤其是一些厌氧菌，如梭状芽孢杆菌(C. thermocellum)和拟杆菌(B.cellulosolvens)，分泌的纤维素酶具有很高的比活力，但是它们不能产生高酶效价。这是因为厌氧菌的生长速度很慢并且需要特殊的厌氧的生长环境，因此，就应用而言，纤维素酶的许多研究就集中在真菌上。产生纤维素酶的真菌有白绢菌(Sclerotiumrolfsii)，白腐真菌(P.chrysosporium)以及木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖菌属(Schizophyllum)和青霉属(Penicillium)等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌[23]。世界纤维素酶市场中的纤维素酶20%是来自木霉属和

曲霉属[21]。细菌和真菌中都存在有复杂的纤维素酶水解系统，虽然其水解微晶纤维素的能力非常强，但是由于其复合物的分子量十分巨大（可从2~16×106 D 到100×106D），并且单个

组份又不具有水解微晶纤维素的能力。所以人们一直试图从其他物种中寻找更符合工业应用以及更具有应用前景的纤维素酶。日本一家实验室从甲虫中得到一种葡聚糖内切酶水解羧甲基纤维素(CMC-Na)的比活力可高达150IU/mg[15]; 我们从福寿螺中发现了一种纤维

素酶EGX，它不仅具有很高的比活力，而且具有多种酶的活性，这些结果可能提示动物纤

维素酶不但具有应用前景，还具有理论研究意义。二是要通过定向进化和分子改造的方法筛选到重组型高比活力的纤维素酶。人们已经利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到新的高比活力的重组型纤维素酶。Wood 等[25]在大肠杆菌E.coli Ko11 中表达了欧氏菌(Erwinia Chrysanthemi P86021)的葡聚糖内切酶基因，最终得到的重组纤维素酶在每升培养基中可产生高达3200IU。从嗜酸耐热菌(Acidothermuscellulolyticus)中得到的一种热稳定性的葡聚糖内切酶E1 被表达在Arabidopis thaliana 的叶子中[26]，马铃薯[27

以及烟草中[28]。另外，将构建的编码木糖同化作用和戊糖磷酸化途径的操纵子转入细菌发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)中，可以有效地将木糖发酵转化成乙醇。除此之外，定点突变以及基因重排(gene shuffling)技术也被应用到高比活力纤维素酶的筛选当中。例如：在李氏木

霉(T.reesei) 中，需要产生至少14种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。为了降低纤维素酶的复杂性，将李氏木霉的CBH1、嗜酸耐热菌的葡聚糖内切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶

1(质量比)混合形成一个三元复合物，此三元复合物在120 小时内水解预处理过的纤维素的

能力与李氏木霉中纤维素酶体的水解能力相当。为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方法对葡聚糖内切酶EI的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相比，其水解纤维素的活性提高了12%[24]。

5小结把地球上最丰富的可再生资源——纤维素用生物转化技术变为新能源是人类由来已久的愿望，随着地球石化能源的短缺

和枯竭的日趋严峻，人们必须把这种愿望变为现实。由于目前纤维素酶的研究还不能适应这样的需求，所以寻找新的适于再生

能源需要的高催化活性，低成本的纤维素酶，必将成为这个领域的热点问题。动物纤维素酶的研究正是在这样的背景下产生的，

同时动物纤维素酶与微生物酶系有所不同，作为一个新的纤维素酶体系，它的研究也具有重大的理论价值，因此，可能成为纤

维素酶研究的热点。虽然目前得到的纤维素酶，不管是来自细菌、真菌、植物还是动物的，还不能使乙醇代替汽油在经济上成

为现实，但是随着对纤维素酶研究的不断深入，以及生物化学、分子生物学、生物信息学、结构生物学以及基因工程等多种交

叉学科的快速发展，获得适合工业生产的高比活力的纤维素酶将不再是可望而不可及的了。

[参考文献][1] Campbell B A, Laherrere J H. The end of cheap oil. Sci Am,

1998, 3: 78~83 [2] Leschine S B. Cellulose degradation in anaerobic environments. Annu Rev Microbiol, 1995, 49: 399~426 [3] Watanabe H, Tokuda G. Animal cellulases. Cell Mol Life Sci,2001, 58(9): 1167~1178 [4] Smant G, Stokkemans J P, Yan Y T, et al. Endogenous cellulases in animals: isolation of beta-1, 4-endoglucanase genes from two species of plant-parasitic cyst nematodes. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(9): 4906~491 [5] Watanabe H, Noda H, Tokuda G, et al. A cellulase gene of t ermite origin. Nature, 1998, 394(6691): 330~331影响产酶量和活力的因素：影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等（1997）采用均匀设计Cl12(1210)，以绿色木（T.Vir iclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃

条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成华等（1997）也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产

酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为

适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。张苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925为出发菌，

经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉

碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。