WB实验,一抗,该怎么孵育？

一抗，该怎么孵？

为什么实验室中最常用的WB（Western blot）实验看起来较难重复？为什么同样样品同样配方师兄师姐却技高一筹？如何才能确保我实验结果的可重复性？可能原因有很多，本文主要讲一抗该怎么孵？

一抗稀释缓冲液——取决于抗体特异性

一抗应在含5%BSA或5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中稀释。每种抗体都预先确定了最佳稀释缓冲液，并写入了各产品的说明书，请遵照产品说明书进行配制，从而得到最佳的信号。

例如(A)，免疫印迹分析胰岛素处理过的C2C12细胞提取物，采用Phospho-Akt (Ser473)Antibody #9271。遵照说明书，用基于BSA缓冲液稀释得到信号显著强于基于牛奶的缓冲液。

孵育——过夜孵育提高抗体结合

一抗孵育时间会有很大的差别，具体取决于研究人员采用的操作流程。我们建议转移之后封闭一小时，随后在4℃下进行过夜一抗孵育。此处(B,C)所示为抗体性能的两个实例，4℃过夜孵育，或室温条件下2小时孵育。

例如(B)，免疫印迹分析HeLa细胞提取物，未经处理或加入LY294002 #9901或Human Insulin-like Growth Factor I (hIGF-I) #8917处理，采用Phospho-Akt(Ser473)Antibody #9271 (上) 和PKCδAntibody #2058 (下) 。Phospho-Akt(Ser473) 和 PKCδ都在4℃过夜孵育中表现更佳。

简短孵育系统——孵育时间越短产生信号越弱

宣传简短抗体孵育时间的系统越来越流行，因为它们能减少免疫印迹结果所需时间。使用这些系统时，应遵循生产商推荐的操作流程并使其最佳化。这些操作流程通常要求较弱的封闭缓冲液和较高一抗和二抗浓度，以便在简短的时间周期内实现必要的抗体结合水平。CST科学家将Millipore的SNAPi.d..（一款真空运作孵育系统，可将抗体孵育时间降至30分钟以下）和CST

推荐的抗体孵育操作流程进行了比较。总的来说，加速抗体孵育系统使得蛋白靶标信号减弱(C)。

例如(C)，免疫印迹分析NIH/3T3和C6细胞提取物，分别未经处理、UV辐照或茴香霉素处理。

采用Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (3D7) Rabbit mAb #9215。CST推荐操作流程 (左) 得到

信号显著高于简短的 SNAPI.d?孵育系统 (右) 。