黄曲霉产胞外β1,31,4葡聚糖酶的发酵条件优化
泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化
泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强【摘要】利用单因素实验法优化了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CAU33利用农业废弃物固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件.产酶的条件包括碳源种类、初始水分含量、氮源种类、初始pH、表面活性剂、培养温度和发酵时间.进一步运用响应面分析法优化了其中主要因素,得到最佳产酶条件为:啤酒糟为碳源、含水量为81.6%、吐温60添加量20g/L、大豆蛋白胨添加量25g/L、自然pH、35℃下培养6d.在优化后的发酵条件下,最大产酶水平达到40832.9U/g.泡盛曲霉固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力高,工业化生产和应用潜力大.%The fermentation conditions f or β-1,3-1,4-glucanase production from Aspergillus awamori CAU33 by solid state fermentation(SSF)with agricultural wastes as carbon source were optimized. Seven factors including carbon source, initial moisture content, nitrogen source, initial pH, surfactant source, temperature and fermentation time were optimized by single-factor experiment firstly, and the major factors amongst were then optimized by response surface method. The optimal fermentation conditions for β-1,3-1,4-glucanase production were as follows:beer sludge as carbon source, initial moisture content of 81.6%, Tween 60 of 20g/L, soya peptone content of 25g/L, natural pH, culture temperature of35℃and culture time of 6d. Under the optimized conditions, the highest β-1,3-1,4-glucanase production of 40832.9U/g was achieved. The high yield may give the enzyme great potential in industrial applications.【期刊名称】《生物产业技术》【年(卷),期】2018(000)003【总页数】7页(P80-86)【关键词】泡盛曲霉;啤酒槽;固体发酵;β-1,3-1,4-葡聚糖酶【作者】刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文β-1,3-1,4-葡聚糖是由多于1000个葡萄糖残基以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接而成的直链葡聚糖聚合物，主要存在于谷物的胚乳和细胞壁中。
β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究中期报告
β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究中期报告本次中期报告将介绍β-甘露聚糖酶的发酵条件优化、酶的纯化和性质研究进展。
一、β-甘露聚糖酶发酵条件优化β-甘露聚糖酶是一种重要的酶，广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。
为了提高酶的产量，本研究对β-甘露聚糖酶的发酵条件进行了优化。
优化过程中，首先通过单因素实验确定了发酵时间、发酵pH、发酵温度和发酵基质浓度等因素对β-甘露聚糖酶的影响。
然后采用响应面法对这些因素进行优化，最终确定了β-甘露聚糖酶的最佳发酵条件为：发酵时间为48小时、发酵pH为6.5、发酵温度为50℃、发酵基质浓度为2%。
通过以上优化，β-甘露聚糖酶的产量大大提高，为后期的酶的纯化和性质研究提供了充足的原料。
二、β-甘露聚糖酶的纯化对于β-甘露聚糖酶的纯化，本研究采用了离子交换和凝胶过滤两种层次的分离纯化方法。
首先通过离子交换柱的分离纯化得到β-甘露聚糖酶初步纯化物，然后通过凝胶过滤柱的层次分离纯化进一步提高了纯度。
经过纯化，β-甘露聚糖酶的比活力得到了显著提高，而且纯度也达到了95%以上。
这为酶的性质研究提供了可靠的实验条件。
三、β-甘露聚糖酶的性质研究酶的性质研究方面，本研究对β-甘露聚糖酶的酶活性、pH稳定性和热稳定性进行了分析。
结果表明，β-甘露聚糖酶的最适工作pH为6.5，最适工作温度为50℃。
同时，β-甘露聚糖酶的pH稳定性和热稳定性也比较好，可以在pH6.0-8.0和50℃条件下保持较高的活性。
综合以上结果，本研究对β-甘露聚糖酶的生产、纯化和性质进行了全面的研究，为该酶的应用开发提供了可靠的实验基础。
葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化_王强
葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化王强1，2，李旭3，张旭姣1，2，张庆芳1，2，窦少华1，2，金连豆1，2，迟乃玉1，2*（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；3.大连市生产力促进中心，辽宁大连116025）摘要：该研究以海洋来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )Q1为出发菌株，通过单因素实验对葡甘聚糖酶产生菌Q1发酵条件进行优化，并将菌株Q1发酵所得上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心和Sephadex G-100凝胶过滤层析，得到电泳纯的葡甘聚糖酶，并研究其部分酶学性质。
结果表明，最佳发酵条件为魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏添加量为0.2%，蛋白胨添加量为0.4%、氯化钠添加量0.4%、培养温度26℃、转速160r/min 、接种量5%、初始pH 7.0、装液量100mL/250mL 。
在此条件下，葡甘聚糖酶酶活为241.61U/mL 。
葡甘聚糖酶相对分子质量为41.3ku ；酶最适作用底物为葡甘聚糖。
关键词：葡甘聚糖酶；发酵条件；优化；分离纯化中图分类号：TQ925文章编号：0254-5071（2016）05-0086-06doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.05.018Optimization of fermentation conditions of high glucomannanase-producing strain Q1and separation and purification of the enzymeWANG Qiang 1,2,LI Xu 3,ZHANG Xujiao 1,2,ZHANG Qingfang 1,2,DOU Shaohua 1,2,JIN Liandou 1,2,CHI Naiyu 1,2*(1.College of Life Science and Technology,Dalian University,Dalian 116622,China;2.Liaoning Technology of Marine MicrobiologicalEngineering Research Center,Dalian 116622,China;3.Dalian Productivity Promote Center,Dalian 116025,China)Abstract ：Using Bacillus subtilis Q1from marine as original strain,the fermentation conditions of the glucomannanase-producing strain Q1were op-timized by single factor experiments.The glucomannanase from the supernatant liquor was purified using ammonium sulfate precipitation,dialysis,ultrafiltration and gel filtration chromatogram of Sephadex G-100,and its enzymatic properties were researched.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:konjaku flour 0.75%,beef extract 0.2%,peptone 0.4%,sodium chloride 0.4%,culture temperature 26℃,rotate speed 160r/min,inoculum 5%,initial pH 7.0,liquid volume 100ml/250ml.Under the conditions,the enzyme activity was up to 241.61U/ml.The relative molecular mass of the glucomannanase was determined to be 41.3ku.The optimum substrate of the enzyme was glucomannan.Key words ：glucomannanase;fermentation conditions;optimization;separation and purification收稿日期：2016-02-23基金项目：国家高技术研究发展计划‘863计划’项目（2007AA021306）作者简介：王强（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物酶制剂研究。
黄曲霉产生菌活化方法
黄曲霉产生菌活化方法
黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种广泛存在于自然环境中的真菌，它可以产
生黄曲霉素（aflatoxin），这是一种强烈的致癌物和毒素。
黄曲霉素对人类和动物
的健康造成严重威胁，因此，找到黄曲霉产生菌的活化方法具有重要意义。
黄曲霉产生菌的活化方法可以通过以下步骤实现：
1. 选择合适的培养基：黄曲霉生长所需的培养基需提供适宜的营养成分，例如
碳源、氮源和微量元素。
一般来说，黄曲霉喜好碳水化合物丰富的培养基，如玉米粉或米粉等。
2. 维持适宜的环境条件：黄曲霉生长所需的环境条件包括适宜的温度和湿度。
通常，黄曲霉适宜的生长温度范围为25-30摄氏度，相对湿度则应保持在70-80%
之间。
3. 防止竞争性微生物的污染：在黄曲霉产生菌的培养过程中，我们应该注意防
止其他微生物的污染。
可以通过灭菌培养器具和消毒液来减少污染的风险。
4. 促进黄曲霉孢子的萌发：黄曲霉的孢子是菌丝体生长的起始点。
为了促进孢
子的萌发，可在培养基上加入适量的水分，使其吸收到足够的水分并刺激孢子发芽。
5. 优化培养条件：随着培养的进行，通过不断调整培养条件来优化黄曲霉的生长，例如控制温度和湿度、提供适宜的氧气通气等。
通过以上方法，可以有效地活化黄曲霉产生菌。
然而，应该注意的是，黄曲霉
产生的菌丝体和黄曲霉素仍然存在一定的风险，因此在研究或工业生产过程中，我们必须严格遵守相应的安全操作规程，以保障人类和动物的健康安全。
降解黄曲霉毒素B_1菌株的发酵条件优化及降解机制_邵帅
接种量梯度分别为1%、3%、6%、9%、12%、 15%，发酵温度28 ℃，转速180 r/min，装液量 75 mL/250 mL，培养时间48 h。研究接种量对AFB1降解 率的影响。 1.3.6 发酵时间对AFB1降解率的影响
Abstract: In this study, a mould isolated for degrading aflatoxin B1 was reported. Morphological studies coupled with internal transcribed spacer (ITS), 18S ribosomal RNA gene sequence, 26S ribosomal RNA gene sequence analyses
138 2016, Vol.37, No.05
食品科学
※生物工程
降解黄曲霉毒素B1菌株的发酵条件优化及 降解机制
邵 发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）
摘 要：目的：鉴定一株降解黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的霉菌HSK8，通过优化其发酵条件提高AFB1 降解率，并初步探索其降解机制。方法：通过形态学和内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、 18S rRNA和26S rRNA序列分析对该菌株进行鉴定，并通过单因素试验对发酵条件进行优化，采用薄层层析对AFB1 降解产物进行研究。结果：经鉴定该株霉菌为夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola）。其发酵条件经优化确定 为：发酵温度28 ℃、装液量75 mL/250 mL、接种量15%、发酵时间36 h、初始pH 8.0。薄层层析观察到一个不同于 AFB1的荧光斑点。结论：发酵条件优化后，AFB1降解率从40.68%提升到68.96%，提高了69.52%；AFB1降解产物能 在365 nm波长处发出蓝色荧光。 关键词：黄曲霉毒素B1；鉴定；发酵条件；降解产物
枯草芽孢杆菌产 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化
Ventilation (vvm)
X2Biblioteka 0.51.01.5
pH
X3
4
5
6
2 结果与讨论
2.1 摇瓶发酵产 β-1,3-1,4-葡聚糖酶 通过对碳源、氮源、初始 pH 值等优化, 在最
佳发酵培养条件下培养 72 h, 枯草芽孢杆菌 D-6 发酵产 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最高酶活力可达 2 800 U/mL。产酶历程如图 1 所示。与大多数芽
表 1 试验因素水平及编码
Table 1 Process variables and their
levels for BBD experiments
自变量 Independent
varuables
因子 Symbol
水平 Coded levels
−1
0
1
Speed (r/min)
X1
300 400 500
(2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)
Abstract: [Objective] [Methods] The fermentation parameters on the β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 in a batch fermentor (5 L) were optimized by statistical
2013, Vol.40, No.4
analysis using response surface methodology (RSM) based on Box-Behnken design (BBD) analysis of variance (ANOVA). [Results] The results showed that under the optimized conditions, with agitation, aeration, and pH at 500 r/min, 1.05 vvm and 5.08, respectively, the highest β-1,3-1,4-glucanase activity of 2 294.4 U/mL was obtained after 22 h of cultivation. [Conclusion] This study proved that RSM could efficiently be applied for modeling of β-1,3-1,4-glucanase production in submerged fermentation.
泡盛曲霉来源 β-1,3-1,4葡聚糖酶的纯化、性质及应用研究
Hale Waihona Puke 0.3854BC1
37128.125
37128.125
0.241277319
0.6339
A2
1
2840448.325 2840448.32 18.45866866
0.0016
B2
1
2396605.718 2396605.72
15.5743551
0.0027
C2
1
14795649.47 14795649.5 96.14960738
7951
7728.52
6173
5871.62
6950
7402.94
8194
7750.87
6449
6037.37
6484
6600.24
7300
7728.52
6984
7210.49
7268
6915.49
5633
5365.19
5439
5606.37
4282
4533.99
5737
5610.94
7864
7728.52
< 0.0001
剩余
10
1538815.381 153881.538
失拟
5
1277866.047 255573.209 4.896989124
0.0530
回归
5
260949.3333 52189.8667
总和
19
31662832.95
经回归拟合后，酶活的预测值Y可以用以下回三元二次归方程表示：
Y=7728.52+509.44*A+620.56*B+475.44*C-113.37*A*B125.87*A*C+68.13*B*C-336.11*A2-308.74*B2-767.11*C2
黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取
应用与环境生物学报 2010，16 ( 5 ): 724~729Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2010-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00724黄曲霉毒素（Aflatoxins ）为分子真菌毒素，是一种剧毒和强致癌物质，为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种. 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO ）的癌症研究机构划定为一类致癌物. 黄曲霉毒素最易污染玉米、花生、花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯. 现已经确定的黄曲霉毒素有20余种，但是污染粮食的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2和M 1等. 在天然污染的粮食中以黄曲霉毒素B 1（AFB 1） 毒性最大，量也最多[1]，致癌性也最强[2]，国际癌症研究机构已经将AFB 1列为人类致癌物[3]，AFB 1属于肝脏毒素，诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍[1]. AFB 1的危害作用表现在多方面，它不仅是一种肝毒素和致癌剂，而且影响血液循环、造血和消化机能等[4]. 人类健康受AFB 1的危害主要是由于食用被AFB 1污染的食物. 长时间食用含低浓度AFB 1的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因[5~6]. 以外，黄曲霉毒素与其它致病因素（如肝炎病毒）等对人类疾病的诱发具有叠加效应.为深入研究AFB 1的致病机理，就必须提取AFB 1，建立各种动物模型. 目前已有针对相对湿度和温度建立黄曲霉（Aspergillus flavus ）生长模型的相关报道，SamapundoL 等建立了黄曲霉生长的相对湿度、温度模型[7]，彭坚等以小麦为基质建立了黄曲霉的生长预测模型[8]，但研究结果发现，菌斑直径并未随着产毒培养时间的延长而递增. 为掌握黄曲霉的产毒规律，获得更高浓度的毒素，本实验以不同时间、温度和湿度为培养条件，用Logistic （一级）和Ratkowsky （二级）模型对黄曲霉产毒条件进行系统的优化.黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取*庄振宏 郑传琦 汪世华**（福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室/生命科学学院 福州 350002）Optimization of Aspergillus fl avus Culture Conditions and Extractionof A fl atoxin B1*ZHUANG Zhenhong, ZHENG Chuanqi & WANG Shihua **(Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, and College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002, China)Abstract Optimization of culture conditions for Aspergillus flavus was carried out to extract high concentration of a fl atoxin B 1. A. fl avus was cultivated in the rice medium under different temperature gradients (15 ℃, 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, and 35 ℃) and different humidity gradients (0%, 80%, 85%, 90%, 95%, and 100%) respectively. The size of plaque was continuously measured every day for 18 times with Logistic Model and Ratkowsky Modeland. At last, the conditions of toxin production by A. fl avus were optimized by means of the Response Surface Model. The results showed that under the optimized culture conditions (35 ℃，100% humidity at a culture time of 16~17 days), the concentration of the extracted a fl atoxin B 1 was 3 312 ng/mL, and the aflatoxin B 1 yield of per unit area was much higher than that (1 101.471 ng/mL) extrated before optimization in our lab. Further study is needed for carcinogenic mechanism of a fl atoxin B 1. Fig 5, Tab 4, Ref 18Keywords Aspergillus fl avus ; a fl atoxin B 1; rice medium; temperature; humidity; optimization CLC Q949.327.106摘 要 为提取高浓度的黄曲霉毒素B 1，以大米为培养基培养黄曲霉，分别在不同温度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）和湿度梯度（0%、80%、85%、90%和95%和100%）下培养，每天测量一次菌斑直径的变化（共测18 次），然后采用Logistic （一级）和Ratkowsky （二级）模型对黄曲霉菌斑大小进行拟合和检验，最后借助响应面模型对黄曲霉产毒条件进行优化. 结果显示，在35 ℃和100%湿度的培养条件下，只需培养16~17 d 即可获得直径较大的黄曲霉菌斑，提取黄曲霉毒素B 1浓度为3 312 ng/mL ，单位面积黄曲霉毒素B 1产量是优化前（1 101.471 ng/mL ）的3倍. 图5 表4 参18关键词 黄曲霉；黄曲霉毒素B 1；大米培养基；温度；湿度；优化CLC Q949.327.106收稿日期：2009-11-09 接受日期：2009-11-17*国家“863”计划项目（No. 2007A A10Z430）、国家自然科学基金项目（Nos. 31000961，30771400）、福建省自然科学基金项目（Nos. 2010J01068，2009J06008）、教育部新世纪优秀人才支持计划（No. NCET-10-0010）、霍英东教育基金会第十一届高等院校青年教师基金项目（No. 111032）、福建省重点引智项目（No. SZ2008039）、福建省教育厅科技计划项目（No. JB08068）、福建省教育厅资助省属高校专项计划（No. JK2010022）和福建省高校新世纪优秀人才支持计划 Supported by the National “863” Program of China (No. 2007AA10Z430), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31000961, 30771400), the Natural Science Foundation of Fujian, China (Nos. 2010J01068, 2009J06008), the Program of Ministry of Education of China for New Century Excellent Talents in Universities (No. NCET-10-0010), the 11th Fok Ying Tung Education Foundation for Young Teachers in Universities (No. 111032), the Key Project of Fujian for Intellectual Introduction (No. SZ2008039), the Science and Technology Project of Department of Education of Fujian (No. JB08068), the Subsidizing Program of Department of Education of Fujian for Provincial Universities (No. JK2010022), and the Program for New Century Excellent Talents in Universities of Fujian**通讯作者 Corresponding author (E-mail: wshyyl@)7255 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 菌 种 黄曲霉菌标准菌株3.4409，购自中国科学院菌种保藏中心. 点植接种于PDA 试管斜面培养基，28 ℃培养2~3 d供实验用.1.1.2 培养基 在大米培养基中添加不同量的甘油，分别制备相对湿度为0、80%、85%、90%和95%和100%的培养基[9]. 1.1.3 毒素检测试剂盒 ELISA 试剂盒购自北京营养源研究所. 组成：AFB 1抗原包被酶标板（96孔），抗体，酶标二抗，空白对照液，底物（1 mg×6），底物液A ，底物液B ，终止液，PBS-T 洗液.1.2 方 法1.2.1 黄曲霉菌的培养条件及优化 菌落生长实验[10]：用灭菌生理盐水清洗培养2~3 d 的黄曲霉菌落孢子，稀释. 吸取10 μL 孢子稀释液点在相应湿度的大米培养基正中央，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的培养箱中，每隔1 d 测量直径变化.拟合生长模型的建立：1）模型的假设：孢子接种时，不考虑其初始直径差异，统一假设初始直径为1 mm ；并假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值. 2）Logistic （一级）模型：采用Logistic （一级）模型[11]拟合实际测定的生长曲线：用线性最小二乘法估计这个模型的参数r ^和X m ：其中，X m 为最大生长值，X 0为初始值，r ^为比生长速率. 用Matlab 7.0软件拟合，得到预测生长曲线的参数最大生长值和比生长速率. 3）Ratkowsky （二级）模型检验：（二级）模型用经典的Ratkowsky 方程[12]拟合，即最大生长速率随温度变化的函数关系：式中，C 1、C 2、T min 和T max 分别是4个经验常数，T min 是微生物能生长的最低温度，T max 是微生物能生长的最高温度. 说明温度较低时，比生长速率的平方根与温度呈线性关系. 4）响应面法分析实验：用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析，比较各因素的t 值和可信度. 根据各显著影响因素效应的大小、正负确定效应值（正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值），用MATLAB 7.0软件设计响应面实验，并进行数据处理，以获得培养较大直径菌斑的优化方案. 1.2.2 AFB 1的提取 在通风橱中，往每个培养黄曲霉菌的锥形瓶中加入100 mL 甲醇水（体积比为1 : 1），用玻棒搅拌. 超声萃取10 min 后，快速抽滤，收集滤液，摇匀，然后将滤液倒入球形瓶中，在45 ℃下将滤液旋转蒸发至大约5 mL ，最后经10 000 r/min 、4 ℃离心15 min ，取上清，置于4 ℃冰箱中保存. 用甲醇水（体积比为1 : 1）稀释即可得到不同浓度的AFB 1. 1.2.3 ELISA 标准曲线法测定AFB 1浓度[13~15] AFB 1酶联免疫试剂盒平衡至室温，用1.5 mL 酶标稀释液稀释冻干酶标抗原[16]. 用洗涤液洗板2次并拍干. 按表1依次加入试剂.表1中，1号孔为阳性孔，2号孔为阴性孔，3号孔为限量孔，4~12号孔为试样孔. 4~9号孔中分别加入50 µL AFB 1系列标准溶液，浓度分别为0 ng/mL 、0.1 ng/mL 、0.25 ng/mL 、0.5 ng/mL 、1 ng/mL 和2 ng/mL ，10~12号孔中分别加入50 µL 不同浓度的AFB 1提取液，再把酶标抗原溶液加于各孔中，摇匀，37 ℃温育30 min. 甩干后用洗涤液洗板5次，拍干. 各孔分别加入50 µL 底液a （0.2 g/L 四甲基联苯胺）和50 µL 底液b （乙酸钠柠檬酸缓冲液），37 ℃显色15 min ，各孔分别加入50 µL 终止液，并于450 nm 波长处测定各孔吸光值A [12]. 以4号孔的吸光值A 0为分母，5~9号孔的吸光值A 5~A 9为分子，以吸光值的比值为纵坐标，以6个AFB 1标准溶液浓度的对数（lg C ）为横坐标，绘制AFB 1的标准曲线，再以此标准曲线求出待测AFB 1溶液的浓度.2 结果与分析2.1 黄曲霉菌培养条件的优化2.1.1 黄曲霉菌培养条件的Logistic （一级）模型拟合 采用Logistic （一级）预测模型拟合各环境条件下测得的实际生长数据，得出各条件下黄曲霉菌落的生长预测值，拟合曲线如图1. 由于湿度为0的阴性对照组中菌斑完全没有生长，所以不进行拟合.由表2可知，Logistic 模型拟合生长值的拟合优度R 2都达到0.98以上，因此可以作为预测黄曲霉生长的模型，接着以Logistic （一级）模型拟合数据为基础，建立二级模型.2.1.2 黄曲霉菌培养条件的Ratkowsky （二级）模型检验 黄曲霉菌在不同相对湿度条件下的比生长速率μ对温度（二级）模型拟合曲线如图2所示. 由图2可知，在15~35 ℃范围内，培养的黄曲霉生长速率的平方根与温度呈线性关系，生长率随温度的升高而增加，各线性模型的相关系数均达0.95以上，模型拟合度较高.2.1.3 响应面法分析黄曲霉菌培养条件 用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析，比较各因素的t 值和可信度.由表3可看出，温度、时间表现为正效应，湿度表现为负效应. 可信度均大于95%，表现为极显著. 因此以下试验分别以确定的正最大温度（35 ℃）和负最大湿度（100%）为基础，进一步探讨时间因子的效应.由图3-A 可以发现，在100%湿度下，菌斑的直径随温度的升高而增加，当温度达到35 ℃时达到最大值，接近200 mm ，而温度低于15 ℃时没有明显变化. 在时间方面，发现100%湿度条件下培养16~17 d ，菌斑的直径即可达最大值，菌斑直径随温度和时间响应面的方差分析及其显著性分析的表1 AFB 1酶联免疫试剂盒试剂添加顺序表Table 1 The adding order of reagents for enzyme-linkedimmunoassay of AFB 1次序Order 加入量Dosage 孔号 Hole No.123456789101112150 μL A A B 待测试样稀释液 Diluted samples to be tested 2………………………摇匀 Shaking………………………350 μL D C C C C C C C C C C C 4………………………摇匀 Shaking………………………A ：7%甲醇溶液；B ：AFB 1标准物质；C ：酶标AFB 1抗原；D ：酶标AFB 1抗原稀释液A: 7% methanol solution; B: AFB 1 reference material; C: Enzyme-labelled AFB 1; D: Diluted enzyme-labelled AFB 172616 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol结果发现，该回归模型在α=0.01水平上显著（P≈0），相关系数R2为0.957 0，调整后的R2为0.927 0，即表明该模型可以解释92.7%的响应面黄曲霉菌斑的变化，说明该响应面模型的拟合程度较好.由图3-B可知，在35 ℃条件下，菌斑的直径随湿度的增大而增加，当培养基的湿度达到100%时达到最大值，也接近200 mm，而湿度低于90%时增长极为缓慢. 菌斑的直径随时间的变化趋势和100%湿度条件下的试验结果一致，即培养16~17 d后可达最大值. 菌斑直径随湿度、时间响应面的方差分析及其显著性分析结果显示，该回归模型在α=0.01水平上显著（P≈0），方程的相关系数R2为0.963 0，调整后的R2为0.960 0，即表明该模型可以解释96.0%的响应面黄曲霉菌斑图1 不同温度和湿度条件下黄曲霉菌落生长值的拟合曲线Fig. 1 Fit curves of A. fl avus under different temperatures and humidities by Logistic model表2Logistic（一级）模型拟合优度R2统计表Table 2 The goodness of fi t（R2）of each Logistic modelθ/℃RH100%95%90%85%80%150.99680.99000.99470.99140.9864 200.99620.99850.99730.99750.9952 250.98890.99260.99300.98760.9925 300.99830.99610.99450.98910.9956 350.99710.99140.99740.99220.98777275 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取的变化，说明该响应面模型的拟合程度较好.为进一步确定菌斑在最佳温度或湿度条件下的生长变化趋势，分别绘制了100%湿度条件下黄曲霉菌斑直径随温度和时间（Y =f (X 1,X 3)）变化的响应等高线图，以及35 ℃条件下黄曲霉菌斑直径随湿度和时间（Y =f (X 2,X 3)）的响应等高线图.从图4-A 发现，在100%湿度下，当温度达到35 ℃时菌斑的直径达到最大值. 当培养时间为16~17 d 时菌斑的直径可达最大值. 根据图4-B 可以发现，在35 ℃条件下，当培养基的湿度达到100%时菌斑的直径达到最大值. 在35 ℃条件下培养图2 各相对湿度黄曲霉菌斑比生长速率对温度的回归直线Fig. 2 Regression line of A. fl avus speci fi c growth rate at different humidity with temperature表3 各因素水平、效应值及显著性分析Table 3 The analysis for the level of various factors, effect size, and signi fi cation因素Factor效应值Effect size 效应水平Effect levelt P 温度 Temperature (X 1)0.629+20.0800.000湿度 Humidity (X 2)-0.483-15.4670.000时间 Time (X 3)0.528+17.0540.000图3 不同时间（(X 3）下黄曲霉菌斑直径 (Y )与温度或湿度的三维响应面图Fig. 3 3D response surface methodology for the diameter of A. fl avus plaque (Y ) in different time point (X 3) against temperature or humidityA: Under 100% humidity [Y =f (X 1,X 3); X 1, temperature]; B: Under 35 ℃ [Y =f (X 2,X 3); X 2, humidity]72816 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol16~17 d 后菌斑的直径可达最大值.表4显示两个不同响应面模型的结论基本一致，增强了模型的可信度. 本实验结果提示在35 ℃、100%湿度的培养条件下，培养16~17 d 可提取黄曲霉毒素. 因此，后继试验按照以上结果培养和提取黄曲霉毒素.2.2 AFB 1的浓度测定按照AFB 1标准曲线的绘制方法[17]（具体见1.2.3），绘制AFB 1的标准曲线（图5）. 由吸光值A 10~A 12与A 0的比值在标准曲线上求得对应的浓度对数值，求导数后得到待测溶液的浓度，最后得到待测溶液的平均浓度为3 312 ng/mL ，即按响应面分析设计的方法提取的AFB 1浓度为3 312 ng/mL.3 讨 论目前虽然已有针对相对湿度和温度建立的黄曲霉生长模型，SamapundoL 等以5个温度梯度（16 ℃、22 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃）和7个湿度梯度（0.801~0.982）为条件分别培养黄曲霉菌，运用二次方程函数分析发现30 ℃左右黄曲霉生长最迅速，并指出温度和湿度与黄曲霉菌的生长速度有很强的相关性[7]. 彭坚等发现黄曲霉生长的温度模型符合Rosso 模型，并通过该预测模型发现在60%的相对湿度条件下，黄曲霉的最适生长温度为31.4 ℃[8]. 但这些研究并未考虑各相关培养条件组合下时间因子对菌斑直径变化的影响. 本实验首次采用响应面模型研究方法系统研究了不同温度、湿度组合在不同时间点上对黄曲霉菌生长的影响. 首先对实验进行必要的假设：进行孢子接种培养时，不考虑移液枪每枪打在培养基正中央的初始直径的差异，统一假设初始直径为1 mm ；假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值. 然后采用统计学方法处理数据并进行显著性分析，最后采用响应面模型研究方法，系统体现了温度和湿度之间的相关性在不同时间点对黄曲霉菌生长的影响，获得了大米培养基条件下黄曲霉产毒的最优方案，即在35 ℃、100%湿度培养条件下，培养16~17 d ，黄曲霉菌产AFB 1的平均浓度为3 312 ng/mL ，而未经试验设计所提取出的AFB 1的浓度为1 101.471 ng/mL [18]. 运用本方案单位面积AFB 1产量是未经试验设计的3倍，本研究方法测得大米培养基中的AFB 1含量至少为165.6 ng/mL. 本实验为进一步探讨在AFB 1胁迫下，各种动物组织特别是肝脏组织中的蛋白质差异表达谱打下了基础，同时也发现了防止储藏大米受黄曲霉毒素污染的备选方案，即大米储藏条件应为：温度低于15 ℃，相对湿度低于90%.References1 Xiao CY (肖传英), Feng GP (冯广鹏), Wei JT (魏金涛), Zheng JY (郑金玉). A review: A fl atoxins in feeds. Livestock Poul Ind (畜禽业), 2007, 5: 4~72 Liu J (柳洁), He BY (何碧英), Sun JH (孙俊红). 粮油食品中黄曲霉毒素B1测定. Chin J Public Health (中国公共卫生), 2006, 22 (1): 122~1233 Gao X (高秀), Ji R (计融), Li YJ (李燕俊), Wang YP (王玉平). 北京市城区粮油食品黄曲霉毒素B1污染调查. J Hyg Res (卫生研究), 2007, 36 (2): 237~2374 Li MY (李梦云), Chen DW (陈代文). 饲料中黄曲霉毒素的危害及几种脱毒剂的作用机理. Feed Rev (饲料博览), 2005, 4: 10~13图4 在不同时间（X 3）下黄曲霉菌斑直径（Y ）与湿度或温度的响应等高线图Fig. 4 Contour plots of plaque diameter (Y ) against temperature or humidity in different time point (X 3)A: Under 100% humidity [Y =f (X 1,X 3); X 1, temperature]; B: Under 35 ℃ [Y =f (X 2,X 3); X 2, humidity]图5 AFB 1标准曲线图Fig. 5 AFB 1 standard curve表4 响应面模型结论表Table 4 The result of response surface model analysis项目Item100%湿度条件下，黄曲霉菌斑直径随温度、时间的响应Contour plots of plaque diameter responding to temperature and time under 100% humidity35 ℃条件下，黄曲霉菌斑直径随湿度、时间的响应Contour plots of plaque diameter responding tohumidity and time under 35 ℃建议时间 Proposed time frame16~17 d 16~17 d 估计菌斑直径 Estimated plaque diameter150~160 mm 140~150 mm R 20.92700.9600729 5 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取5 Daniel EV, Jimmy DB. Clostridium diffi cile toxins: Mechanism of actionand role in disease. Clin Microbiol Rev, 2005, 18 (2): 247~2636 Ira P, D avid F. Pseudomonas exotoxin: Chimeric toxins. J Biol Chem,1989, 264 (26): 15157~151607 Samapundoa S, Devliegherea F, Geeraerd AH. Modelling of theindividual and combined effects of water activity and temperature on the radial growth of Aspergillus fl avus and A. parasiticus on corn. Food Microbiol, 2007, 24: 517~5298 Peng J (彭坚), Han BZ (韩北忠). The predictive model for the growth ofAspergillus fl avus in wheat．J Henan Univ Technol Nat Sci (河南工业大学学报: 自然科学版), 2005, 26 (2): 51~549 Pardo E, Ramos A J, Sanchis V, Marín S. Modelling of effects of wateractivity and temperature on germination and growth of ochratoxigenic isolates of Aspergillus ochraceus on a green coffee-based medium. Int J Food Microbiol, 2005, 98: 1~910 Li RF (李瑞芳), Han BZ (韩北忠), Chen JY (陈晶瑜). Establishmentof a predictive model for the growth of a Spergillus fl avus and content variation of Afl atioxin. Food Res Dev (食品研究与开发), 2007, 28 (12): 129~13211 Jiang QY (姜启源). Mathematical Models. 3rd ed. Beijing, China: ChinaHigher Education Press (北京: 高等教育出版社), 2003. 162~16612 Zheng MY (郑美英), Du GC (堵国成), Chen J (陈坚), Gu WF (顾王芳).A strategy of temperature control in batch MTG fermentation. Chin JBiotechnol (生物工程学报), 2000, 16 (6): 759~76213 Martin CN, Garner RC, Tursi F, Garner JV, Whittle HC, Ryder RW,Sizaret P, Montesano R. An enzyme-linked immunosorbent procedure for assaying afl atoxin B1. IARC Sci Publ, 1984 (59): 313~32114 Gathumbi JK, Usleber E, Ngatia TA, Kangethe EK, MärtlbauerE. Application of immunoaffinity chromatography and enzymeimmunoassay in rapid detection of afl atoxin B1 in chicken liver tissues.Poult Sci, 2003, 82 (4): 585~59015 R a m BP, Ha r t LP, Shot wel l OL, Pe st k a JJ. En z y me-l i n ke dimmunosorbent assay of aflatoxin B1 in naturally contaminated corn and cottonseed. J Assoc Off Anal Chem, 1986, 69 (5): 904-90716 Gong Y (龚燕), Zhao CC (赵春城), Zhang DS (张东升), Zhao XL (赵晓联). ELISA法检测五类食品中黄曲霉毒素B1前处理方法的改进研究. Sci Technol Food Ind (食品工业科学与技术), 2003, 4 (24): 82~84 17 Chen L (陈玲), Chen L (陈丽), Feng JW (冯建文), Tan BL (谭宝玲),Zhong CY (钟彩英). ELISA在检测饲料黄曲霉毒素总量中的应用.Feed Ind (饲料工业), 2006, 27 (21): 38~3918 Huang YY(黄缘缘). Aflatoxin B1on the mouse liver proteome study on the initial impact: [Master’s Degree Dissertation]. Fuzhou, China: Fujian Agriculture and Forestry University (福州: 福建农林大学), 2008. 17~18。
高产葡萄糖氧化酶菌株的分离鉴定及发酵条件优化
利用 Ｄ Ｎ Ａ ＭＡ Ｎ ６ ． ０软 件 进 行 多 重 序 列 比 较 ， 用
温度为 ３ ０ ｑ Ｃ、 转速 为 １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ的 条 件 下 发 酵 ５ ｄ酶 活 可达
９ ． ５ ５ Ｕ／ ｍＬ 综 合 菌 落 形 态 、 生 长 特 性 镜 栓 形 态及 ５ ． ８ Ｓ
ｒ １ ） ＮＡ— Ｉ ＴＳ 区序 列 系统 进 化 分 析 证 明 所 分 离 的 茵 株 ＧＸ一２ 为 黑 曲霉 （ Ａｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇ ｅ ｒ ） 。
ｆ科技 视 野
ｌ ｍＬ用 灭 菌生理 盐水 稀 释至 ｌ ０ 、 ｌ ０ 两个稀 释 度 ，
测得 的 序列 在 Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ 巾进 行 Ｂ Ｌ Ａ Ｓ Ｔ比对分 析 ，
分 别 用 灭 菌 的 移 液 管 吸取 ０ ． １ ｍＬ涂 布 于 预 先 配 制
并且 灭 菌 的平 板 分 离 培养 基 上 ，在 ２ ８ ℃下 培养 ３ ｄ
科技视野 ｌ ＨＯＲＩ Ｚ ＯＮ ＯＦ Ｓ ＣＩ Ｅ Ｎ Ｃ Ｅ ＡＮ Ｄ Ｔ Ｅ ＣＨ ＮＯＬ ＯＧ Ｙ
高产葡萄糖氧化醵菌株的 分曩鉴定＆发酵 条件优化
辛国 芹 徐海燕 汪孟 娟 董佩 佩 汪祥 燕 谷 巍
（ 山 东 宝来 利 来 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 ）
１ ． ２ 试 验 方 法
１ ． ２ ． １ 菌株 的初 筛一 Ｆ ｉ ｅ ｄ ｕ ｒ ｅ ． Ｋ． Ｊ 显色 法
作 者 简介 ： 辛 国芹（ １ ９ ８ ５ 一） ， 女， 硕 士研 究 生 ， 主 要 从 事
基 础微 生 态研 究 工作 。 通讯作者 ： 徐 海燕， 女， 畜牧 师 ， 院 长助 、 硝 酸钠 ０ ． ２ ％、 磷 酸氢 二 钾 ０ ． １ ％、 氯 化钾 ０ ． ０ ５ ％、 硫酸镁 ０ ． ０ ５ ％、 硫 酸 亚 铁 ０ ． ０ ０ １ ％、 琼 脂粉 １ ． ５ ％。 ｐ Ｈ为 自然 。
黄曲霉的分离及培养条件的优化(改)
黄曲霉的分离及培养条件的优化姓名：郑新疆专业、年级：动植物检疫11-11 试剂和器材察氏培养基、培养皿、恒温培养箱、恒温水浴锅、显微镜2 方法2.1黄曲霉菌的培养、分离和鉴定2.1.1黄曲霉菌的培养、鉴定将干燥的玉米、花生、大米放于阴暗潮湿处，泼上适量水，放置3周，使其霉变。
待霉菌长出后观察霉菌孢子和菌丝颜色，挑选少量黄色菌丝镜检，若镜检下，菌丝呈分隔状，分生孢子头呈连珠状，且可见孢子梗上有孢子囊, 囊上有分生孢子梗, 梗上有分生孢子, 整个孢子的形态呈球拍状。
则可初步判断为黄曲霉菌。
2.1.2黄曲霉菌的分离、鉴定将疑似霉菌接种于察氏培养基，28℃培养6d划线分离得到单菌落，以黄曲霉菌标准菌株3.4408对照，在荧光显微镜下观察进行孢子的形态学鉴定。
若菌落正面色泽随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。
孢子成熟后颜色变为褐色。
表面平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。
而在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。
制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。
顶囊呈烧瓶形或近球形。
分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。
则可判定其为黄曲霉菌。
2.1.3黄曲霉素的鉴定将已鉴定的培养至第6天的培养基倒置于紫外灯（波长360nm,125w）下观察，菌落周围的培养基中出现特殊荧光，即为产黄曲霉毒素的阳性菌株。
2.2 黄曲霉菌的纯化将黄曲霉菌株接种于察氏培养基平板上，28℃恒温培养5d。
取平板上的单菌落接种于察氏斜面培养基上，28℃恒温培养5-6d。
多次反复接种纯化，然后保存纯种菌株。
2.3 黄曲霉菌培养条件优化分别将纯化的黄曲霉菌株接种在察氏培养基平板上，置于28℃条件下培养10d。
每个处理3个重复，观察菌丝的生长，测量菌落直径，按照公式：菌丝体日均生长速度/mm.d-1=菌落半径增长长度(mm) /培养天数(d)。
计算出各处理菌丝体日均生长速度,进一步计重复平均数，并用Excel软件制图。
β-葡聚糖酶生产
β-葡聚糖酶生产
β-葡聚糖酶的生产主要采用微生物发酵法。
其中，Bacillus Licheniformis 菌株是常用的生产菌株，其发酵产生的β-葡聚糖酶是一种内切酶，能够作用于β-葡聚糖的1，3及1,4糖苷键，生成
3-5个葡萄糖单位的低聚糖及葡萄糖。
在生产过程中，首先需要将菌株接种到种子培养基中进行培养，待菌株生长到一定阶段后，将其转移到发酵培养基中进行发酵。
发酵完成后，通过离心、沉淀等步骤收集菌体，再经过洗涤、干燥等处理后即可得到β-葡聚糖酶。
为了提高β-葡聚糖酶的生产效率和酶活性，需要选择适当的培养基配方和发酵条件，并进行条件优化。
此外，分离纯化技术也是影响酶生产的重要因素，可以采用多种分离纯化方法相结合的方式，获得高纯度的β-葡聚糖酶。
总之，β-葡聚糖酶的生产需要综合考虑菌株选择、培养基配方、发酵条件、分离纯化等多个因素，才能获得高质量的酶产品。
β-葡聚糖酶发酵工艺流程
β-葡聚糖酶发酵工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!β-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、饲料等领域。
α-1,4葡聚糖麦芽糖苷酶生产菌的筛选及发酵条件
α-1,4葡聚糖麦芽糖苷酶生产菌的筛选及发酵条件
张亚楠;韩秋惠;李宪臻
【期刊名称】《大连工业大学学报》
【年(卷),期】2009(028)001
【摘要】针对淀粉直接转化麦芽糖相对困难、高浓度麦芽糖生产效率低的工业难题,以麦芽糊精作为碳源,获得一株能将麦芽糊精转化为麦芽糖的α-1,4葡聚糖麦芽糖苷酶生产菌.能够转化糊精为麦芽糖并清除葡萄糖的发酵条件为:酵母粉2 g/L,麦芽糊精50 g/L,培养基初始pH值为6.0,发酵温度为35℃.
【总页数】3页(P1-3)
【作者】张亚楠;韩秋惠;李宪臻
【作者单位】大连工业大学,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连工业大学,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连工业大学,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3;TQ925
【相关文献】
1.β-半乳糖苷酶产生菌的筛选和发酵条件优化 [J], 孟繁一
2.泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化 [J], 刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强
3.产α-葡萄糖苷酶抑制剂乳酸菌的筛选及发酵条件优化 [J], 韩瑨;季红;周方方;吴正钧
4.β-半乳糖苷酶产生菌的筛选及发酵条件优化 [J], 王衍鑫;刘兴华;陈琛;孙艳玲;谢玉锋
5.麦芽四糖淀粉酶产生菌的筛选与发酵条件的研究 [J], 严自正;佘晓红
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
三株大型真菌的发酵条件优化及其胞外多糖的结构与功能研究的开题报告
三株大型真菌的发酵条件优化及其胞外多糖的结构
与功能研究的开题报告
一、选题背景
真菌是一类生长迅速、繁殖能力强、代谢物种类繁多的微生物。
其中，许多真菌可以合成和分泌多糖，这些多糖在医药、食品、生物技术
等领域具有广泛的应用。
因此，开展真菌的发酵条件优化及多糖的结构
和功能研究具有重要的科学意义和应用前景。
二、研究目的
本研究的主要目的是优化三株大型真菌的发酵条件，并通过对其胞
外多糖的结构和功能进行研究，探究这些真菌胞外多糖的潜在应用价值。
三、研究内容和方法
本研究选择三株大型真菌作为研究对象，分别是A菌、B菌和C菌。
首先，通过单因素实验和正交试验方法，优化这三株真菌的发酵条件，
包括温度、pH值、碳源、氮源等因素。
其次，通过紫外-可见吸收光谱、红外光谱、核磁共振等方法，研究这些真菌胞外多糖的结构。
最后，通
过体外实验探究这些多糖的抗氧化、抗炎、免疫调节等生物活性。
四、研究意义和预期结果
本研究的意义在于优化大型真菌的发酵条件，寻找新的多糖资源，
同时对多糖的结构和功能进行深入探究，为其在医药、食品、生物技术
等领域的应用提供科学依据和理论支持。
预期结果是得到三株大型真菌
的发酵条件，以及它们胞外多糖的结构和功能。
这些研究成果将有望为
真菌胞外多糖的开发利用提供新的思路和方法。
一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌发酵条件的优化张晓玲;陈历俊;牟光庆【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2012(000)001【摘要】多糖是广泛存在于动物、植物、微生物中的生物高分子聚合物,因其具有多种多样的生物活性及功能,并且安全无毒,近年来成为研究与开发的热点.本文对实验室保藏的一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌进行了初步研究.通过单因素试验及正交试验得到枯草芽孢杆菌产胞外多糖(Exopolysaccharide)的最优发酵条件.结果表明:发酵温度为37℃,摇瓶培养转速为160r/min,接种量为3％,发酵时间为36h,在优化后的条件下胞外多糖的产量最大可达到4.135g/L,产量提高了2.87％.【总页数】5页(P181-185)【作者】张晓玲;陈历俊;牟光庆【作者单位】大连工业大学食品学院,大连116034;北京三元食品股份有限公司,北京100085;北京三元食品股份有限公司,北京100085;大连工业大学食品学院,大连116034【正文语种】中文【中图分类】TM344.1【相关文献】1.一株海洋真菌Sw-25产胞外多糖发酵条件研究 [J], 杨柳;祖国仁;孔繁东;刘阳2.一株产胞外多糖土壤细菌培养条件的优化 [J], 尚天翠;卫刚;赵玉3.一株放射性土壤杆菌（Agrobacterium cradiabacter）产胞外多糖性质的鉴定及其发酵工艺条件初探 [J], 赵双枝;吉武科;张彦昊4.产胞外多糖罗汉果内生菌的筛选及其发酵条件优化 [J], 王琪;付强;周巧丽;金岳;胡梦琪;赵丰丽5.类芽孢杆菌ZX-5产胞外多糖的发酵条件优化及其保湿特性 [J], 杨棒棒;符运会;周佳;屈建航;罗宇;李海峰;孙静怡;张鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组大肠杆菌发酵生产β1-3,1-4-葡聚糖酶培养基优化研究
第36卷第2期2006年6月工业微生物I ndustrial M icrob io lo gyV o l .36N o.2Jun.2006基金项目：厦门市科技计划项目资助（NO ：3502Z20055017）作者简介：程志敬（1980~），女，硕士研究生。
!通讯联系人，T e l ：0755-********E -m ail ：den g xu @szu .edu .cn重组大肠杆菌发酵生产B 1-3，1-4-葡聚糖酶培养基优化研究程志敬1，邓旭2!，卢英华1，何宁1，陈文谋1（1.厦门大学化学工程与生物工程系，厦门361005；2.深圳大学生命科学学院，深圳518060）摘要通过对重组E .c o l i J M 109发酵生产B 1-3，1-4-葡聚糖酶条件的研究，发现培养基中氮源含量是影响B -葡聚糖酶产量的主要因素。
优化后的培养基组成为：酵母粉12g /L ，甘油6g /L 、N ac l 10g /L ，N a NO 37.21g /L ，KH 2PO 42.4g /L ，K 2HPO 412.5g /L 。
优化条件下，发酵30h ，B-葡聚糖酶活力达到297.71 /mL ，约为初始时的14.3倍。
关键词：B -葡聚糖酶；大肠杆菌；培养基；优化B -葡聚糖（B1-3，1-4-葡聚糖）属于一种非淀粉多糖，在水溶液中具有较高粘性。
麦类饲料中含有丰富的B -葡聚糖，单胃动物由于自身不具备合成B -葡聚糖酶的微生物及分解B -葡聚糖的酶系，使食糜在肠道中具有较高的粘度，而阻止蛋白质和脂肪营养的吸收，降低饲料的转化率，成为一种抗营养因子，最终导致动物产出成本的增加［1］。
大麦是啤酒制造的主要原料，B-葡聚糖占大麦胚乳细胞壁内物质的75%，水溶性B -葡聚糖是造成啤酒酒体混浊，泡沫持久力和挂杯力不强的主要原因之一。
已知，麦类饲料添加B -葡聚糖酶，不仅降低B -葡聚糖粘度，而且能改善麦类营养值，同时减少对环境的污染；在啤酒工业中应用B -葡聚糖酶，可降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒稳定性。
芽孢杆菌属来源1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性研究
芽孢杆菌属来源1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性研究1,3-1,4-β-葡聚糖酶,以下简称β-葡聚糖酶,是一种重要的工业用酶。
β-葡聚糖酶通过专一性切割1,4-β-糖苷键可以有效降解禾本科植物细胞壁中的高分子量β-葡聚糖。
在啤酒酿造行业中,外源添加β-葡聚糖酶可以有效加快麦汁过滤速度,提高麦汁浸出率和成品啤酒的非生物稳定性。
在饲料行业中,添加外源β-葡聚糖酶可以消除β-葡聚糖的“抗营养因子”效应从而提高禽畜对麦类饲料的吸收效率,同时维护禽畜的肠道健康。
然而目前β-葡聚糖酶依然存在热稳定性差、催化效率低等问题,其在麦芽制备、麦汁糖化和颗粒饲料制备过程中完全失活。
因此,提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有重要工业应用价值。
本论文通过表面赖氨酸改造、二硫键引入和突变热点区域分析法等理性/半理性手段成功提高了芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶的热稳定性并在枯草芽孢杆菌WB600中实现表达,最后将高热稳定性β-葡聚糖酶在麦汁协定糖化过程中进行应用。
主要结论如下:(1)对芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶表面赖氨酸在其热稳定性中作用进行分析。
首先采用亚硝酸对β-葡聚糖酶表面赖氨酸进行化学修饰,发现赖氨酸ε-氨基基团的修饰有效提高了酶热稳定性。
和野生酶相比,修饰酶的T50值提高了2.5℃,在50℃和60℃的半衰期分别提高了56%和76.8%。
基于化学修饰研究,将特基拉芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶表面赖氨酸选择性突变为丝氨酸。
以蛋白质总能量值、氢键数量和比活力值为标准对热稳定性有利突变进行筛选,发现突变酶K20S、K117S和K165S的热稳定性优于野生酶。
经过组合突变,组合突变酶K20S/K117S/K165S的最适温度和T50值和野生酶相比分别提高了15℃和14℃,而其在50℃和60℃的半衰期分别延长了170.9%和81.5%。
与此同时,组合突变酶的催化性质优于野生酶。
蛋白质结构分析发现在组合突变酶中形成了更多有序二级结构及更多氢键,这可能是赖氨酸突变后β-葡聚糖酶热稳定性提高的原因。
啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化
啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化郑元平;袁康培;冯明光【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2004(12)3【摘要】对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育,获得产β-葡聚糖酶达27.3 U/mL的突变株H302.采用均匀实验设计对H302菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验,所获优化配方(W/V)为麦麸1.41%,鱼粉0.80%,硝酸钾0.34%,硫酸镁0.11%,起始pH 6.0;用含孢量108个/mL的种子菌液按体积比3.3%接种上述液体培养基,在36℃下发酵52 h,菌株H302的产酶活力达到115.1 U/mL,是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9.4倍.对突变株H302所产β-葡聚糖酶性质的研究表明,该酶最适作用温度为60℃,最适作用pH为5.5,适用于啤酒生产中的麦芽糖化.【总页数】6页(P316-321)【作者】郑元平;袁康培;冯明光【作者单位】浙江大学微生物研究所,杭州,310029;浙江大学微生物研究所,杭州,310029;浙江大学微生物研究所,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.饲用葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件研究 [J], 刘德海;何蔚荭;王红云;安明理;徐文涛2.N+注入选育高产β-葡聚糖酶菌株及其发酵条件优化的研究 [J], 方华平;程茂基;赵彩艳;陈丽娟3.N+注入选育高产β-葡聚糖酶菌株及其发酵条件优化的研究 [J], 方华平;程茂基;赵彩艳;陈丽娟4.β-葡聚糖酶和木聚糖酶高产菌株的选育及在小麦加工中的应用 [J], 陈红歌;赵玮莉;李瑞丰;贾新成5.氮离子注入选育β-葡聚糖酶高产菌株的研究 [J], 赵彩艳;李庚飞;尤跃钧;李忠建;程茂基因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化
泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化刘二伟;杨绍青;闫巧娟;江正强【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2017(038)016【摘要】从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33.依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6d.在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447U/mL,为优化前的17.6倍.【总页数】7页(P29-35)【作者】刘二伟;杨绍青;闫巧娟;江正强【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471000;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.产β-1,3-1,4-葡聚糖酶特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis CGX5-1发酵培养基的优化 [J], 刘晓玲;王金晶;李永仙;李崎2.拟青霉WPG-1的鉴定及固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件的优化 [J], 唐艳斌;胡婉峰3.泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化 [J], 刘二伟;刘学强;杨绍青;江正强4.泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化、性质及其用于制备β-葡寡糖 [J], 陈子贤;刘学强;张彬;闫巧娟;江正强5.黄曲霉产胞外β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件优化 [J], 刘璐;陈洲;陈瑶瑶;刘杨柳;李思霆;贾英民;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第37卷第1期2019年1月食品科学技术学报Journal of Food Science and TechnologyVol.37No.1Jan.2019 doi:10.3969/j.issn.2095⁃6002.2019.01.005文章编号:2095⁃6002(2019)01⁃0028⁃08引用格式:刘璐,陈洲,陈瑶瑶,等.黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化[J].食品科学技术学报,2019,37(1): 28-35.LIU Lu,CHEN Zhou,CHEN Yaoyao,et al.Optimization of fermentation conditions forβ⁃1,3⁃1,4⁃glucanase production by Aspergillus flavus[J].Journal of Food Science and Technology,2019,37(1):28-35.黄曲霉产胞外茁⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化刘 璐, 陈 洲, 陈瑶瑶, 刘杨柳, 李思霆, 贾英民*(北京工商大学食品学院,北京 100048)摘 要:研究发现一株高产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值㊂依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19g/L㊁磷酸氢二铵30g/L㊁吐温⁃6021g/L㊁NaCl5g/L㊁MgSO4㊃7H2O0.5g/L㊁KH2PO4 0.75g/L㊁培养基初始pH值8.0㊁培养温度38℃㊁培养时间6d㊂在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活达155.9U/mL㊂水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β⁃葡聚糖,并直接生成葡萄糖㊂这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景㊂关键词:黄曲霉;β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶;发酵条件;响应面分析;水解中图分类号:TS201.3;Q814 文献标志码:A收稿日期:20181007基金项目:国家自然科学基金资助项目(31771951;31801510);北京市博士后工作经费资助项目(2018⁃ZZ⁃009);中国博士后科学基金资助项目(2018M631288)㊂第一作者:刘 璐,女,硕士研究生,研究方向为食品微生物㊂ *通信作者:贾英民,男,教授,博士,主要从事食品微生物方面的研究㊂ β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖是由β⁃葡萄糖苷通过β⁃1,3和β⁃1,4⁃糖苷键混合连接而成的线性多糖,广泛分布于大麦㊁燕麦㊁高粱㊁大米和小麦等谷物的胚乳细胞壁中[1-2]㊂β⁃葡聚糖具有黏性高㊁水溶性差等特点,这给富含β⁃葡聚糖谷类作物的应用造成了众多不利影响[3-4]㊂例如,在啤酒酿造中,因β⁃葡聚糖的过量存在,使得麦芽汁黏度增加,造成过滤困难,降低了啤酒的产量和质量[5];在饲料工业中,过高的β⁃葡聚糖会造成动物胃液黏度的增加,阻碍动物的营养吸收,从而降低饲料的转化率,限制了谷物及其副产品在饲料添加中的应用[6-7]㊂可见,寻求β⁃葡聚糖的 绿色”㊁高效降解方法将成为有效提升其工业化应用的关键㊂一般来说,β⁃葡聚糖可通过酸解㊁碱解㊁酶解及其协同降解等多种方式转化生成小分子的葡萄糖或纤维寡糖㊂酶解法因具有安全高效㊁专一性强及无毒副产物生成等优势而成为β⁃葡聚糖降解的最理想方法[8]㊂β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶(EC3.2.1.73)属于糖苷水解酶,它能专一性水解β⁃葡聚糖主链中的β⁃1,3/1,4⁃葡萄糖苷键,是一类重要的工业化酶制剂,目前在啤酒酿造㊁饲料营养强化等领域中应用广泛[9]㊂β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶主要来源于动㊁植物及微生物,微生物因产酶量高㊁发酵周期短且易于实现工业化生产等优势而成为该酶的主要生产者㊂产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的菌株种类繁多,其中,曲霉菌是最主要真菌来源㊂目前的研究主要集中于黑曲霉β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶[10-11],有关其他曲霉来源的β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的报道还很少,因此,进一步挖掘产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的曲霉菌种对促进该酶的生产和应用具有重要指导意义㊂通过初步探索,本课题组获得了一株优良的黄曲霉菌株,并发现该菌株具备分泌胞外β⁃1,3⁃1,4⁃82葡聚糖酶的能力㊂为深入了解该菌株发酵产β⁃1, 3⁃1,4⁃葡聚糖酶的水平以及该酶的功能特性,本研究重点对该菌株产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件进行了优化,并初步探索了该酶降解谷物内β⁃葡聚糖的应用潜能㊂1 实验部分1.1 实验材料大麦葡聚糖,爱尔兰Megzyme公司;燕麦粉㊁大麦粉,北京永辉超市;酵母提取物㊁胰蛋白胨,英国Oxoid公司;吐温㊁曲拉通和十二烷基硫酸钠(SDS)等,中国国药集团化学试剂有限公司;玉米苞皮㊁小麦麸皮㊁稻壳㊁玉米芯㊁白酒酒糟㊁花生壳等农业废弃物,北京官园花鸟市场;其他试剂如无特殊说明均为分析纯㊂黄曲霉(CICC No.2476,不产黄曲霉毒素)购买于中国工业微生物菌种保藏中心,保存于本研究室㊂初始发酵培养基(g/L):玉米芯20,胰蛋白胨10,酵母提取物10,NaCl5,MgSO4㊃7H2O0.5, KH2PO40.75,自然pH,121℃灭菌20min㊂1.2 实验仪器PDA培养基(g/L):马铃薯200,葡萄糖20,琼脂粉20,自然pH,121℃灭菌20min㊂MJPS-150型霉菌培养箱,上海精宏有限公司; ZWF-100型摇床,上海智诚分析有限公司; HH.S11-4型电热恒温水浴锅,上海博讯医疗有限公司;TGL-20BR型高速冷冻台式离心机,上海安亭科学仪器厂;TU-1810PC型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器设备有限责任公司㊂1.3 实验方法1.3.1 发酵产酶将黄曲霉划线接种于PDA平板上,置于30℃下培养3~5d㊂将大小为1cm2黄曲霉菌块接种到含50mL初始发酵培养基的250mL锥形瓶中㊂在37℃㊁200r/min的条件下培养4d,离心(10000 r/min,10min)取上清液,测定β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活力㊂1.3.2 发酵产酶的优化采用单因素实验优化黄曲霉产酶条件㊂考察碳源对黄曲霉产酶的影响,包括碳源种类(玉米芯㊁麸皮㊁燕麦粉㊁大麦粉㊁稻草㊁玉米苞皮㊁白酒酒糟㊁花生壳㊁葡萄糖㊁木糖㊁蔗糖㊁乳糖㊁麦芽糖㊁可溶性淀粉和葡聚糖)及其添加量(质量浓度)0~50g/L对产酶的影响;考察氮源种类(胰蛋白胨㊁酵母提取物㊁蛋白胨㊁牛肉膏㊁大豆蛋白胨㊁豆粕粉㊁硫酸铵和磷酸氢二铵)及其添加量(质量浓度)(0~35g/L)对产酶的影响;考察表面活性剂种类(吐温⁃20㊁吐温⁃40㊁吐温⁃60㊁吐温⁃80㊁曲拉通⁃110㊁曲拉通⁃114和SDS(十二烷基硫酸钠))及其添加量(质量浓度)(0~30g/L)对产酶的影响㊂继续优化培养基初始pH值(5.0~8.5)和培养温度(25~40℃,每隔5℃),基于较佳培养基组成和较优培养条件的研究结果,考察该菌摇瓶发酵的产酶过程㊂1.3.3 β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活力及蛋白含量测定酶活力测定参照Tang等[12]的方法:150μL大麦葡聚糖(质量浓度为5g/100mL)底物置于45℃下预热3min,加入50μL适当稀释的酶液并在45℃下反应10min;加入200μL DNS(3,5⁃二硝基水杨酸)煮沸15min显色,最后加入200μL酒石酸钾钠溶液(质量浓度为40g/100mL),待冷却后测定A540nm值,以葡萄糖为标准㊂β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活力单位(U)定义为:在上述条件下每分钟水解大麦β⁃葡聚糖生成1μmol/L葡萄糖所需要的酶量㊂蛋白含量的测定参照Lowry等[13]的方法,以牛血清白蛋白为标准㊂1.3.4 黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶降解谷物中β⁃葡聚糖能力研究水解条件:向1g大麦粉/燕麦粉中加入9mL MOPS(4⁃(N⁃morpholino)propanesulphonic acid)缓冲液(50mmol/L,pH值7.5)混匀;加入10U/mL的胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶进行水解反应,不同时间点取样并于沸水中蒸煮5min灭活,10000r/min离心10min后取上清液待测㊂TLC检测条件:采用德国Merk公司60F254型号硅胶板,展层剂为正丁醇/乙酸/水,三者体积比为2∶1∶1,显色剂为5%硫酸甲醇溶液,展层2次㊂1.3.5 响应面优化试验基于单因素研究,选取麸皮浓度㊁吐温⁃60浓度和温度3个因素为自变量,以酶活为响应值,以单因素实验所得最适结果为响应面试验的中心,进行三因素三水平中心组合设计响应面试验(表1)㊂通过多元回归拟合,并对回归方程进行方差分析及拟合度检验,讨论响应面特征,确定优化的产酶条件㊂最终通过实验进行验证,将实验值与预测值进行比较,92第37卷第1期 刘 璐等:黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化验证模型的有效性㊂表1 响应面设计的因素及水平Tab.1 Factors and their corresponding levels forresponse surface methodology水平因素Aρ(麸皮)/(g ㊃L -1)Bρ(吐温⁃60)/(g ㊃L -1)C 温度/℃-1151535.00202037.51252540.02 结果与分析2.1 碳源对黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响碳源对黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的能力有重要影响,实验结果见表2㊂当以麸皮为唯一碳源时,黄曲霉产酶能力最强,且在麸皮添加量为20g /L 时达到最高酶活,为35.5U /mL㊂表2 碳源与黄曲霉发酵产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的关系Tab.2 Effects of carbon sources on β⁃1,3⁃1,4⁃glucanaseproduction by A.flavus碳源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活/(U ㊃mL -1)玉米芯0.42±0.10小麦麸皮35.53±1.03燕麦粉11.94±0.34稻草0.19±0.00玉米苞皮4.36±1.99白酒酒糟0.21±0.01花生壳0.23±0.01可溶性淀粉0.31±0.01碳源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶酶活/(U ㊃mL -1)蔗糖0.11±0.01葡萄糖0.42±0.04麦芽糖0.33±0.05木糖3.29±1.15葡聚糖0.13±0.03乳糖9.80±0.85大麦粉12.11±0.03 碳源是微生物自身骨架合成过程中主要的营养物质和能源物质,提供菌体生长所需的碳骨架和维持菌体生命活动所需的代谢能量,是影响菌体生长和代谢产物合成的重要因子[14]㊂不同的微生物由于代谢酶系可利用的碳源不同,且不同碳源条件下微生物产生的代谢产物具有一定的差异[15-16]㊂β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶是一种诱导型酶,不同碳源诱导其产酶能力不尽相同㊂本研究发现,黄曲霉利用纤维质原料诱导产酶的能力明显强于其他单一糖类,可能是由于农业废弃物所富含的营养成分更丰富,利于黄曲霉的代谢利用㊂此外,农业废弃物价格低廉,用于发酵产酶还可以节约酶的生产成本㊂2.2 氮源对黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响氮源同样能显著影响黄曲霉产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的能力,实验结果见表3㊂由表3可知,当以磷酸氢二铵为氮源时,黄曲霉的产酶水平最高,酶活可达68.3U /mL㊂进一步研究发现,添加30g /L 的磷酸氢二铵最为合适,此时的酶活为79.1U /mL㊂表3 氮源与黄曲霉发酵产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的关系Tab.3 Effects of nitrogen sources on β⁃1,3⁃1,4⁃glucanaseproduction by A.flavus氮源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶活力/(U ㊃mL -1)酵母提取物12.31±2.43胰蛋白胨24.74±3.98蛋白胨29.17±2.73牛肉膏28.19±0.99氮源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶活力/(U ㊃mL -1)大豆蛋白胨53.5±3.77豆粕粉33.15±3.84硫酸铵29.25±1.16磷酸氢二铵68.27±3.832.3 表面活性剂对黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响表面活性剂对黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响结果如图1㊂非离子型表面活性剂对黄曲霉产酶的促进作用明显高于离子型表面活性剂,以吐温⁃60的作用效果最好㊂添加20g /L 的吐温⁃60时黄曲霉产酶水平最高,酶活可达123.3U /mL㊂吐温⁃60的添加显著促进了黄曲霉产酶的能力,可能是由于吐温⁃60能够有效增强细胞膜的通透性,有助于胞内酶透过细胞膜而分泌出来,从而提高胞外酶的产量[17]㊂另外,添加浓度的变化会对黄曲霉产酶能力造成较大影响,添加20g /L 的吐温⁃60时产酶水平最高,但继续增大吐温⁃60的添加量,酶活又出现下降的趋势,说明过高浓度的表面活性剂可能会一定程度上抑制菌株产酶㊂2.4 培养条件对黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响培养基的初始pH 值及培养温度对黄曲霉发酵产酶的影响较大,实验结果见图2㊂研究发现,培养03食品科学技术学报 2019年1月图1 表面活性剂与黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的关系Fig.1 Effect of surfactants on β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase production图2 初始pH 值和温度与黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶能力的关系Fig.2 Effects of initial pH and temperature on β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase production基初始pH 值为8.0㊁发酵温度选择37℃时酶活最高,为121.5U /mL㊂pH 值的变化会使微生物合成酶的类型和酶系的组成产生不同程度的改变,进而影响微生物的代谢活动;因此pH 值是影响微生物代谢产物的产量及活性的重要因素[18]㊂由图2(a)可知,随初始pH值的增加,酶活不断增加,当pH 值升至8.0时酶活最高,继续提高pH 值时酶活又开始逐渐降低㊂温度是影响微生物生长代谢的重要因素,随着温度的升高微生物的生长不断加快,从而促进微生物代谢以加快分泌酶等活性物质㊂在37℃下培养黄曲霉,能够分泌最高活力的胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶,但随着温度的继续升高,酶活又开始出现较大幅度的下降㊂这可能是由于温度的升高一定程度上抑制了菌株的正常生长,造成代谢异常从而导致了酶活的降低㊂2.5 黄曲霉发酵产胞外茁⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的过程分析确定优化培养基及培养条件后,最终考察了培养时间对黄曲霉产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的影响(图3)㊂β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的酶活力随着培养时间的延长而增长,发酵至第6天时酶活力最高,达155.4U /mL㊂图3 黄曲霉发酵产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的产酶历程Fig.3 Time course of β⁃1,3⁃1,4⁃glucanaseproduction from A.flavus 目前,国内外已报道的β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶主要来源于细菌,如芽孢杆菌和类芽孢杆菌等[19-22],有关真菌产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的研究还很少㊂曲霉菌是多数工业酶制剂生产的重要菌种,也是目前真菌源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶研究的主要对象,但13第37卷第1期 刘 璐等:黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化关于黄曲霉分泌的β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的相关研究至今未见报道㊂2.6 响应面优化结果分析表4是依据响应面设计的不同因素及水平的试验结果㊂表5则是对模拟回归系数的方差分析结果㊂表4 响应面试验结果Tab.4 Analysis of response surface试验号麸皮吐温⁃60温度酶活/(U㊃mL-1)1-1-10135.421-10122.93-110140.64110130.25-10-1130.8610-1113.97-101133.18101120.390-1-1130.5 1001-1133.7 110-11142.4 12011145.1 13001157.5 14001155.5 15001157.1 16001153.8 17001154.9表5 响应面试验回归分析Tab.5 Analysis of variance of regression model来源自由度平方和均方F值P值模型9327.562948.0048.43<0.0001 A1345.84345.8451.140.0002 B142.3242.326.260.0409 C1128.00128.0018.930.0034 AB11.101.100.160.6984 AC14.204.200.620.4564 BC10.0630.0639.241×10-0.0030.9261 A211432.111432.11211.75<0.0001 B21107.06107.0615.830.0053 C21689.04689.04101.88<0.0001剩余747.3447.34失拟36.7637.875.330.0698回归412.629.47总和162.372995.34 表4㊁表5结果表明,因变量和自变量间的线性关系明显,线性回归系数值P<0.05,表现为显著性,说明该实验方案可行㊂同时,失拟项系数值P为0.0698(>0.05),表现为不显著,表明试验模型拟合度较好,误差等偶然因素对试验的影响不显著㊂进一步分析了各因素交互作用,响应面分析结果见图4㊂通过考察3个因素相互间作用对响应值的影响,再经Design⁃Expert8.0软件分析获得优化条件为麸皮19.14g/L㊁吐温⁃6021.09g/L㊁温度37.87℃,相应的酶活为156.9U/mL㊂最终经修正,选择麸皮19.0g/L㊁吐温⁃60 21.0g/L㊁温度38℃进行验证实验,测得酶活为155.9U/mL,结果与预测值相当㊂经单因素实验和响应面试验优化发酵条件后,黄曲霉产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的最高酶活力达155.9U/mL,产酶水平高于已报道的黑曲霉(20.0 U/mL)[10],但低于泡盛曲霉的产酶水平[23]㊂与其他丝状真菌相比,黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的能力明显高于樟绒枝霉和嗜热拟青霉,但不如米黑根毛霉[12,24-25]㊂此外,本研究的黄曲霉还可利用农业废弃物(麸皮)来制备β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶,这不仅有助于降低酶的生产成本,还利于增加农业废弃物的附加值㊂2.7 黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶降解谷物内β⁃葡聚糖的应用潜力初探β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶能够特异性水解β⁃葡聚糖,具备促进富含β⁃葡聚糖类谷物营养吸收的功能㊂为研究黄曲霉β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的应用潜能,重点考察了该酶降解大麦粉和燕麦粉水溶液(富含β⁃葡聚糖)的能力,实验结果见图5㊂由TLC 分析结果显示,该酶能够直接降解大麦粉和燕麦粉中的可溶性β⁃葡聚糖;随着水解反应的进行,水溶液中的可溶性β⁃葡聚糖最终被降解成葡萄糖和少量低聚糖㊂微生物源β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的主要功能是降解β⁃葡聚糖并生产纤维寡糖㊂纤维寡糖作为一种益生元,具有调节肠道菌群平衡的特殊功效,但纤维寡糖却并不能被机体消化和吸收,还有可能造成机体腹部胀气等不适反应㊂本研究发现,黄曲霉分泌的胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶不但能实现天然谷物中β⁃葡聚糖的有效降解,还能将β⁃葡聚糖降解成小分子的葡萄糖㊂这一独特属性对于该酶在葡萄糖制备和生产领域,以及促进人类或者动物机体消化㊁吸收富含β⁃葡聚糖类的谷物具有重要实用价值㊂23食品科学技术学报 2019年1月图4 各因素交互作用的响应面分析结果Fig.4 Response surface plot showing effects of interactions among three factors on enzyme activityG:葡萄糖图5 黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶降解谷物中葡聚糖的TLC 分析Fig.5 TLC analysis of hydrolytic products of glucan fromgrain by β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase from A.flavus3 结 论本研究通过单因素实验和响应面分析法优化了黄曲霉产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的液体发酵条件,得到优化的发酵条件:麸皮19g /L㊁磷酸氢二铵30g /L㊁吐温⁃6021g /L㊁NaCl 5g /L㊁MgSO 4㊃7H 2O 0.5g /L㊁KH 2PO 40.75g /L㊁培养基初始pH 值8.0㊁培养温度38℃㊁培养时间6d㊂在此条件下发酵,黄曲霉能产155.9U /mL 的β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶,其产酶水平高于多数国内外报道的丝状真菌㊂麸皮是小麦制粉后的副产品,资源丰富且成本低廉,是微生物工业发酵的良好碳源㊂本研究发现黄曲霉可利用麸皮作为碳源生产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶,有效降低了生产成本㊂另外,水解实验发现,黄曲霉分泌的β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶具有独特水解性能,不仅能有效降解天然谷物粉中的可溶性β⁃葡聚糖,还能将这些β⁃葡聚糖降解成葡萄糖,这对于促进天然谷物的消化和吸收具有重要意义㊂参考文献:[1] JOHANSSON L,TUOMAINEN P,YLINEN M,et al.Structural analysis of water⁃soluble and ⁃insoluble β⁃glu⁃cans of whole⁃grain oats and barley [J].Carbohydrate Polymers,2004,58(3):267-274.[2] TAKETA S,YOU T,TONOOKA T,et al.Functional33第37卷第1期 刘 璐等:黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化characterization of barley beta⁃glucanless mutants demon⁃strates a unique role for CslF6in(1,3;1,4)⁃β⁃D⁃glucanbiosynthesis[J].Journal of Experimental Botany,2012,63(1):381-392.[3] PLANAS A.Bacterial1,3⁃1,4⁃β⁃glucanases:structure,function and protein engineering[J].Biochimica Et Bio⁃physica Acta,2000,1543(2):361-382. [4] MCNAB J M,SMITHARD R R.Barley beta⁃glucan:anantinutritional factor in poultry feeding[J].NutritionResearch Reviews,1992,5(1):45-60. [5] 毕静.β⁃葡聚糖酶在啤酒生产中的应用研究[J].中国酿造,2011(9):105-106.BI J.Application ofβ⁃glucanase in beer production[J].China Brewing,2011(9):105-106.[6] FERNANDES V O,COSTA M,RIBEIRO T,et al.1,3⁃1,4⁃β⁃glucanases and not1,4⁃β⁃glucanases improve thenutritive value of barley⁃based diets for broilers[J].Ani⁃mal Feed Sciences&Technology,2016,211:153-163.[7] 刘德海,王红云,刘金娥.饲用β⁃葡聚糖酶的研究及应用进展[J].饲料工业,2011(s1):37-39.LIU D H,WANG H Y,LIU J E.The research andapplication ofβ⁃glucanase in feed[J].Feed Industry,2011(s1):37-39.[8] 陈龙军,陈济深,陈亚兰,等.β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆和表达[J].食品工业科技,2013,10:170-174.CHEN L J,CHEN J S,CHEN Y L,et al.Clone and ex⁃pression ofβ⁃1,3⁃1,4⁃glucanase in Pichia pastoris[J].Science and Technology of Food Industry,2013,10:170-174.[9] BECKMANN L,SIMON O,VAHJEN W.Isolation andidentification of mixed linked beta⁃glucan degrading bac⁃teria in the intestine of broiler chickens and partial char⁃acterization of respective1,3⁃1,4⁃beta⁃glucanase activi⁃ties[J].Journal of Basic Microbiology,2010,46(3):175-185.[10] 吴鹏,王知龙,吴秀.黑曲霉HS⁃5高产β⁃葡聚糖酶发酵条件的优化[J].中国酿造,2015,34(3):54-57.WU P,WANG Z L,WU X.Optimization ofβ⁃glu⁃canase fermentation conditions by Aspergillus niger HS⁃5[J].China Brewing,2015,34(3):54-57. [11] 陈接锋,郑毅,吴松刚.黑曲霉固体发酵β⁃葡聚糖酶培养基优化的研究[J].福建轻纺,2001(2):1-4.CHEN J F,ZHENG Y,WU S G.Studies on mediumfor solid⁃state fermentation ofβ⁃glucanase from Aspergil⁃lus niger FSN65[J].The Light&Tex tile Industries ofFujian,2001(2):1-4.[12] TANG Y B,YANG S Q,YAN Q J,et al.Purificationand characterization of a novelβ⁃1,3⁃1,4⁃glucanase(lichenase)from thermophilic Rhizomucor miehei withhigh specific activity and its gene sequence[J].Journalof Agricultural and Food Chemistry,2012,60(9):2354-2361.[13] LOWRY O H,ROSEBROUGH N J,FARR A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265.[14] 宋圆亮,殷建忠,张忠华,等.云南传统发酵豆豉中产β⁃半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究[J].中国微生态学杂志,2011,23(5):398-403.SONG Y L,YIN J Z,ZHANG Z H,et al.Screening ofβ⁃galactosidase producing lactic acid bacteria from Yun⁃nan traditional Douchi and its enzyme producing condi⁃tion[J].Chinese Journal of Microecology,2011,23(5):398-403.[15] 姜云芸,蔡淼,邵淑娟,等.植物乳杆菌K25发酵产胞外多糖的影响因素及其应用[J].食品科学技术学报,2018,36(1):25-34.JIANG Y Y,CAI M,SHAO S J,et al.Factors affectingof Lactobacillus plantarum K25fermentation to produceexopolysaccharide and its application[J].Journal ofFood Science and Technology,2018,36(1):25-34.[16] 石芳,赵墨元,杨柳青,等.不同碳源和生长因子条件下粒毛盘菌代谢产物初步研究[J].微生物学杂志,2017,37(4):53-59.SHI F,ZHAO M Y,YANG L Q,et al.Initial study onmetabolites of Lachnum sp.with different carbon sources&growth factors[J].Journal of Microbiology,2017,37(4):53-59.[17] 刘文玉,史应武,王杏芹,等.低温β⁃半乳糖苷酶产生菌14⁃1摇瓶发酵研究[J].中国乳品工业,2007,35(8):19-22.LIU W Y,SHI Y W,WANG X Q,et al.Study on theconditions of cold⁃adaptedβ⁃galactosidase flask fermen⁃tation by strain14⁃1[J].China Dairy Industry,2007,35(8):19-22.[18] 曹永强,王辑,赵笑,等.植物乳杆菌YW11生产胞外多糖的发酵条件研究[J].食品科学技术学报,2016,34(1):42-49.CAO Y Q,WANG J,ZHAO X,et al.Optimization offermentation conditions of Lactobacillus plantarum YW11for exopolysaccharides production[J].Journal of FoodScience and Technology,2016,34(1):42-49.43食品科学技术学报 2019年1月[19] CHO H J,JANG W J,MOON S Y,et al.Immobiliza⁃tion of β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase from Bacillus sp.on porous silica for production of β⁃glucooligosaccharides[J].Enzyme and Microbial Technology,2018,110:30-37.[20] ZALILA⁃KOLSI I,SELLAMI S,TOUNSI S,et al.Heterologous expression and periplasmic secretion of an antifungal Bacillus amyloliquefaiens BLB 369endo⁃β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase in Escherichia coli [J].Journal of Phy⁃topathology,2018,166(1):28-33.[21] BAEK S C,HO T H,LEE H W,et al.Improvement ofenzyme activity of β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase from Paeniba⁃cillus sp.X4by error⁃prone PCR and structural insightsof mutated residues [J].Applied Microbiology &Bio⁃technology,2017,101(10):1-11.[22] ZHANG B,LIU Y,YANG H Y,et al.Biochemicalproperties and application of a novel β⁃1,3⁃1,4⁃glu⁃canase from Paenibacillus barengoltzii [J ].FoodChemistry,2017,234:68-75.[23] 刘二伟,杨绍青,闫巧娟,等.泡盛曲霉液体发酵产β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的条件优化[J].食品科学,2017,38(16):29-35.LIU E W,YANG S Q,YAN Q J,et al.Optimization of liquid⁃state fermentation conditions for β⁃1,3⁃1,4⁃glu⁃canase (lichenase)production by Aspergillus awamori[J].Food Science,2017,38(16):29-35.[24] YANG S Q,XIONG H,YAN Q J,et al.Purificationand characterization of a novel alkaline β⁃1,3⁃1,4⁃glu⁃canase (lichenase )from thermophilic fungus Mal⁃branchea cinnamomea [J].Journal of Industrial Micro⁃biology &Biotechnology,2014,41(10):1487-1495.[25] JIA H Y,LI Y N,LIU Y C,et al.Engineering a ther⁃mostable β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase from Paecilomyces ther⁃mophila to improve catalytic efficiency at acidic pH [J].Journal of Biotechnology,2012,159:50-55.Optimization of Fermentation Conditions for β⁃1,3⁃1,4⁃GlucanaseProduction by Aspergillus flavusLIU Lu, CHEN Zhou, CHEN Yaoyao, LIU Yangliu, LI Siting, JIA Yingmin *(School of Food and Chemical Engineering ,Beijing Technology and Business University ,Beijing 100048,China )Abstract :An Aspergillus flavus with the ability to yield high production of β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase was found.The fermentation conditions for this enzyme in the shake flask were optimized using a combination of one⁃single⁃factor method and response surface methodology.The results indicated that the optimal culture mediumcomponents for β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase production were 19g /L wheat bran,30g /L (NH 4)2HPO 4,21g /L Tween⁃60,5g /L NaCl,0.5g /L MgSO 4㊃7H 2O and 0.75g /L KH 2PO 4at an initial pH of 8.0.The high⁃est enzyme activity of 155.9U /mL was obtained when the strain was cultured at 38℃for 6d in the opti⁃mized culture medium.The crude β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase from Aspergillus flavus could hydrolyze oat and barley powder to mainly yield glucose.These results indicated that the extracellular β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase produced by Aspergillus flavus possess great potential for its industrial applications.Keywords :Aspergillus flavus ;β⁃1,3⁃1,4⁃glucanase;fermentation condition;response surfacemethodology;hydrolysis(责任编辑:叶红波)53第37卷第1期 刘 璐等:黄曲霉产胞外β⁃1,3⁃1,4⁃葡聚糖酶的发酵条件优化。