胡萝卜组织培养系统实验
云南大学生命科学实验教学中心
实验报告
课程名称：细胞工程实验
院系：生命科学学院
年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066
学号：20131070156座号：A2
开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期
任课教师：吕琦、牛芸
云南大学生命科学实验教学中心制
胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗
( 云南大学生命科学学院,昆明650504)
摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表
明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型
愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培
养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高
峰期（生长平台）。
关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织;
The study about inducement, subculture and suspension cell
lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh root s really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.
Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。
本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。
1 材料和方法
1. 1材料来源
胡萝卜肉质根自农贸市场购买.
1. 2 方法
1. 2. 1MS培养基的配制1000ml
1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml
2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量
I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。
3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。
4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一
边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。
5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。
6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。
7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。
探究实验：
( 1) 以胡萝卜肉质根形成层为外植体诱导。用自来水洗净胡萝卜肉质根, 用小刀切成长约6~7cm块段, 将其在 75% 的酒精中消毒 60s, 再用0. 1% 的升汞消毒 10min或用20%次氯酸钠水溶液消毒20min, 最后用无菌水漂洗三遍每遍5~10min..
（2）消毒好的胡萝卜根块, 切去形态学下端的5~10mm厚的一片, 留下部分用消毒好的小刀, 沿截面横切成厚度 3~5mm 左右的小圆片, 然后将小圆片的韧皮部和木质部切去, 留下形成层, 再切成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 3~5mm 的小长块, 分别接种在M1、M2、M3、M4的诱导培养基上.
（3）获得愈伤后进行继代培养, 培养环境条件与诱导培养相同.
1. 2. 3胡萝卜愈伤组织的继代
（1）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。
（2）3~4周后在相同培养基上继代培养1次。
1. 2. 4胡萝卜细胞无菌系的建立悬浮培养
（1）用镊子夹取在固体继代培养基上继代 10d 左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤, 称取鲜重2g左右的胡萝卜愈伤组织，在灭过菌的培养皿中用无菌镊子尽量将其拨散。
（2）将散碎的愈伤组织转移入盛有20ml液体无激素MS培养基的三角瓶中。
（3）置于80~120r/min摇床上25℃暗培养。
（4）每隔3天换液1次，用吸管吸去3/4旧培养液，再加入等量新鲜培养液。连续培养2 代~ 4 代后逐渐形成稳定的细胞系。
1.2.5胡萝卜细胞再分化实验构建——胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”（1）在超净工作台上，用镊子去除继代培养1~2次的疏松愈伤组织，在无菌载台上分割成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 3~5mm 的小长块，去除黑色、灰色或棕色的坏死细胞部分。
（2）接种在M5、M6培养基上，每瓶1~3块，轻轻压实，以保证和培养基充分接触。
（3)标注清楚组别和日期。26℃，光照16h/d，4周后观察实验结果。
2 实验结果
2. 1实验结果记录：
2.1.1培养基配置结果：
我们组负责配置的是M1，M2，M3，M4每种各接种两瓶。
g 值质量g
1 1.98 2.00 2.73 3.90 0.14
2.1.5胡萝卜细胞再分化实验构建——胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”结果：
因实验培养时间问题，还未观察到具体结果。
预测实验结果为：如果愈伤组织脱分化以后进行再分化，则应当先时愈伤组织下部分化出根，在上部发育出芽，随着不断地生长，最终发育成完整的植株；如果是体细胞胚发生，则可以不经过愈伤组织阶段就可以发育为体细胞胚；但是体细胞胚比愈伤组织难生成得多，很多植物还无法进行体细胞胚的诱导生成，体细胞胚一旦形成，便可慢慢的分化为完整的植株。与愈伤组织发生相比，体细胞胚更不容易发生遗传变异，从而诱导分化发育成的植株更稳定。
2.2实验结果图片
第一次培养
M1-1 M2-1 M2-2 M4-1 M3-1 培养成功
M4-2 霉菌
M1-2 细菌污染
M3-2 细菌污染烫伤
污染情况：接种8瓶，污染3瓶，5瓶未污染第二次培养
1-2烫伤
2-1霉菌
1-1 愈伤组织
2-2愈伤组织
继代实验情况因未观察到，所以未附图。
3.分析讨论：
3.1对实验现象、实验结果的分析及其结论
3.1.1胡萝卜愈伤组织诱导实验中，被污染了5瓶，说明在整个实验过程中，一定要注意无菌操作，否则，任何一个环节染菌都会导致外植体被污染，使得实验失败。
3.1.2外植体的选择很重要，由于实验中选了根部上端，但切面比较靠内的胡萝卜，与其他组相比愈伤组织的量或是色泽方面都比较好，但切块太小，也许是因为不一样大小的胡萝卜，但消毒时间是一样的，可能使得胡萝卜组织受伤较重。
3.1.3同一小组中，或同一个人的实验结果都会不一样，这是由于个人操作差异，主要是培养基分装时没混匀，以及无菌操作不够规范，实验熟悉度不过造成的。
3.1.4外植体经过消毒等处理，可在愈伤组织诱导培养基上进行培养，诱导脱分化形成愈伤组织，并且通过改变2,4-D和KT的浓度，可以诱导愈伤组织再分化形成植物体
然后再在继代培养基上可以增殖得到更多更好的愈伤组织。
3.2实验总结
3.2.1植物组织培养实验一般历时较长，因此要及时将实验过程中的每一部分的操作内容以和实验数据记录下来。以后每门实验课都应当准备一本实验记录本，用于记录数据，在实验数据出现问题时也方便排查问题所在。
3.2.2由于是以小组形式进行实验，所以每个人的工作安排合理的话，可以提高效率。各个大组分别轮流成批配置培养基可地有效节约了时间与精力。
3.2.3在本次实验中我了解并掌握了胡萝卜愈伤组织的诱导和继代培养的原理和一般流程。
3.2.4对植物组织培养实验中熟练掌握无菌操作的技术十分的重要，它对实验的成功直接影响，可有效提高愈伤组织的成活率。
3.2.5由于本次实验中所需的培养基配方是由老师提供的，所以对于培养基配方的确定这一方面的把握不够。实验中愈伤组织的诱导培养和继代培养条件和时间等都是由老师进行安排，我们只是来看结果，所以实际上，对于培养条件等我们都掌握不够。
3.2.7总得来说，对于实验操作流程和注意事项，以及实验结果的观察分析还是能够掌握的。
4.展望拓展：
这次的实验总体来说还是失败的，第一次实验成功率低原因在于在做实验前没有好好了解实验流程，虽然老师在上课时做了相应的讲解，但一些细节上的操作和技巧还是没有弄明白,对于无菌操作的重要性还是没有深刻的意识。在第二次实验中我更加注意了这个问题，将无菌操作台上的物品按最合理的方式放置，既不影响操作，也方便拿取，操作过程不离实验台，仪器轻拿轻放，尽量不带起空气大幅度流动，将酒精灯移到空气滤膜附近，在整个过
程都在酒精灯旁操作；另一方面，在以后的实验中自己一定要提前对实验内容有所了解，将课件及实验讲义上的知识吃透,理清实验思路。这是能做出成功实验的基础,否则,在老师讲解时听不懂,自己思路不清晰，这将使我们在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间，实验也不易做成功。
经过这次的测试技术实验,我个人得到了不少的收获,一方面加深了我对课本理论的认识,另一方面也提高了实验操作能力。这次的实验跟我们以前做的实验不同，因为这次实验大部分是个人操作，我觉得这次我是真真正正的自己亲自去完成，所以是我觉得这次实验最宝贵，最深刻的。比较高兴的一点是我的愈伤组织成活率在同班同学里还是比较高的，在准备愈伤组织的扩大化培养中，大多数同学用的都是我的材料，心里感到很自豪。
在这次的实验中我也深深体会到课本上的纯理论知识对于实践的指导作用：弄懂实验原理，然后通过实验的操作的靠自己亲自动手，亲自开动脑筋，亲自去请教别人才能得到提高的。
临近期末，非常感谢牛芸老师和吕琦老师在本学期给予我们的细致生动的教学，也许以后不见得会再学习更多更加专业的后续课程，但是它对于我们拓展专业及相关知识面、温习所学的细胞工程内容、应用理论分析问题、解决问题的方面体现的思维方式却让我受益匪浅。特别是牛芸老师在指导我实验操作时说的那一句“这样来控制会比较省力，可爱的孩子!”谢谢老师的悉心教导，在此，学生提前祝福老师新年快乐，身体健康!
参考文献：
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[10] 郭勇；崔堂兵；谢秀帧编著.植物细胞培养与应用.北京：科学出版社,2004(07):6~11.
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮 1、本论文课题国内外概况和文献综述： 应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。 胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。 对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高 [1-3] 。 同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根 [1,3,4] 。此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏 根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果 [5] 。 在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基 [1] 。 不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等 [2,3,6] 。此外还 有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7] 。
胡萝卜组织培养系统实验
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066 学号：20131070156座号：A2 开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 ( 云南大学生命科学学院,昆明650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表 明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型 愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培 养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高 峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh root s really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1 材料和方法 1. 1材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量 I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一 边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。 5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。 6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。 7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。
胡萝卜愈伤组织培养
验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月 小组合作： 是○√ 否○ 一、实验预习 1、实验目的： 1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。 1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 2、实验准备： 2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。 药品： NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。 2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。 药品和试剂： MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH 2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器： 100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。
胡萝卜组织培养
. 研究背景 1.1 胡萝卜 胡萝卜(Daucus carota L．)为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，占蔬菜生产总量的3％，达13．5百万吨(Hole，1996)。胡萝卜块根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪[1] 。由于其富含维生素A前体类胡萝b素和植物纤维，因而是一种重要的营养保健品。其适于生食、加工、烹调等多种用途。中国是农业大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。 因此继续深入研究胡萝卜细胞培养还是很有必要的。 1.2 组织培养 植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术[2]。其理论基础是植物细胞具有全能性，即一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有发育成完整植株的潜能，在适宜的条件下能够发育成一个完整的植株。进行离体培养时，植物的组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。 胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。
2. 材料与方法 2.1 材料 培养皿、锥形瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、烧杯、量筒、玻璃棒、酒精灯、无菌操作台、高压灭菌锅、微波炉、PH试纸。 MS培养基、2,4-D、6-BA、活性炭、无菌水、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、1% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液、胡萝卜块根（2012-2-21-怡购，2012-2-24-水果摊，2012-3-13-水果摊，2012-3-21-珠影，2012-3-29-荣一） 2.2 方法 2.2.1 MS培养基的配制200ml ◆用大烧杯取无菌水100-120ml ◆依次用移液管量取加入母液：20ml大量（10x）、2ml微量（100x）、 2ml铁盐（100x）、4ml有机（50x）、2mg/L2,4-D。 ◆称取6g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解。 ◆用量筒定容至20ml。 ◆用pH试纸调pH至6.0-6.2 ◆称取1.6g琼脂加入，搅拌。 ◆放入微波炉内加热直至清澈无沉淀。 ◆分装后高压灭菌3h。 探究实验1激素为1.0mg/L2,4-D，1.0mg/L6-BA[3] 探究实验2激素为2.2mg/L2,4-D[3 4]
胡萝卜组织培养教学设计培训讲学
胡萝卜组织培养教学设计 小组成员：何家会、宋亚伟、冯海艳、尹化、黄洁、牛伟坤 一、教学目标 1、知识目标： 说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行胡萝卜的组织培养。 2、能力目标： 掌握培养基制备、外植体消毒、接种、培养、移栽以及栽培等基本操作技术。 3、情感目标： 关注植物组织培养技术在实践生活中的运用，养成严谨的科学素养。 二、实验目的 1、掌握植物组织培养过程中的愈伤组织诱导和生根培养技术。 2、掌握植物组织培养过程中使用的无菌技术。 三、实验原理 植物组织培养： 指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 ?外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的那部分材料。 ?愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁 细胞，多在植物体切面上产生。 ?脱分化：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。或者说是由高度分化的植物组织或器官产生 愈伤组织的过程。
?再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过程。 ?植物体的任何一个细胞都具有全能性。分化了的植物根、茎、叶等组织器官在一定的条件下进行离体培养，给于一定的营养和激素，可以脱分化为愈伤组织。愈伤组织在不同的营养和激素的作用下，又可以再生出完整的小植株。植物的脱分化和再分化培养，证明分化了的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的全套基因。 四、实验材料与方法 实验材料 ?胡萝卜（新鲜幼嫩） ?MS培养基+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA ?70%酒精2.5%NaCLO无菌水超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 实验方法 ?培养基的配制。 ?小麦籽粒用无菌水浸泡10小时。 ?取材、消毒和接种。 五、实验过程 胡萝卜愈伤组织的诱导 1、外植体消毒 用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 2、外植体接种 把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，
胡萝卜组织培养论文
植物组织培养论文 摘要：在胡萝卜组培试验，用胡萝卜做外植体，在培养基上接种诱导形成愈伤组织，由于接种时对外植体消毒不彻底，接种操作不规范，导致培养基全部污染，实验失败 胡萝卜 胡萝卜（Daucus carrot），又称甘荀，是伞形科胡萝卜属二年生草本植物。以肉质根作蔬菜食用。原产亚洲西南部，阿富汗为最早演化中心，栽培历史在2000年以上。名为Daucus carota，通常为一年生，根可食。常见品种中，根呈球状或锥状，橘黄色、白色、黄色或紫色。原产阿富汗及邻近国家。野胡萝卜已成为分布于欧洲、美国和其他温带国家的杂草。地中海地区早在西元前就已栽培胡萝卜，在 中国和西北欧不迟于14世纪，现栽培于整个温带地区。 组织培养发展简史 Haberlandt(1902)首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。与rechinger不同，Haberlandt相信切块大小不会影响细胞增殖，但由于Haberlandt使用的培养液成分简单，培养的细胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验失败，培养的细胞虽然存活了几个月但没能分裂。Haberlandt 转而对损伤修复发生兴趣，提出激素作用的概念（leptohormone)，与维管组织特别是韧皮部有关；另一类是创伤激素(woundhomone)，与细胞损伤有关，为后来激素理论的建立和在组织培养中的广泛应用奠定了基础。但自Haberlandt的实验之后直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，其间的30多年里，植物组织培养技术几乎没有什么进展。分析其原因，主要就是培养基的成分和实验所选取的材料不够合适。 20世纪60年代，在植物组织培养方面的另外两项成就就是划分小孢子培养和原生质体培养的成功。Guha和Maheshwari（1966，1967），Rourgin和Nitsch（1967）先后利用烟草和胡萝卜的小孢子培养获得单倍体植株，并成功地实现了染色体的加倍，使这种同源二倍体植株在5个月内收获到种子。Cocking等用纯化的纤维素酶和果胶酶处理烟草细胞，获得原生质体，通过调节渗透压的方法控制原生质体膨胀，使培养获得成功，得到了再生植株。自20世纪60年代始，植物组织与细胞培养逐渐走向了工厂化和商品化阶段。 材料与方法
植物组织培养技术所有名词解释
植物组织培养复习材料 一、名词解释。 1、植物组织培养(plant tissue culture)：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术 2、脱分化（dedifferentiation）：指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。 3、再分化（redifferentiation）：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。 4、外植体(explant)：植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。（如器官、组织、细胞、原生质体、种子等） 5、愈伤组织(callus)：原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。 6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。包括细胞分化和器官形成。 7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。可进一步发育成植株。 8、细胞全能性（cell totipotency）：指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。 9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。 10、极性：细胞（也可指器官或植株）内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。 11、试管苗：通过组织培养产生的植株。 12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。这块愈伤组织被称为看护组织。 13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。 14、悬浮细胞培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。适用于大规模的培养，使细胞工程的基本平台。 15、植板效率=（每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数）*100 16、实验室的组成及功能：1.基本实验室（1）准备室（2）接种室（3）培养室2.辅助实验室（1）细胞学实验室（2）摄影室及暗室（3）生化分析室（无菌操作室、化学实验室、培养室、细胞学观察室、暗室）。 17、植物种质：物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质，植物种质资源即为携带各种不同遗传物质的植物总称。 18、玻璃化现象：指试管苗的一种生长失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。其苗称为玻璃化苗。 19、基本培养基：包括大量元素和微量元素（无机盐类）、维生素和氨基酸，还有糖和水等。 20、完全培养基：在基本培养基基础上，根据各种不同试验要求，添加各种植物生长调节物质以及其他复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物。21、外植体褐变：在组织培养过程中，外植体向培养基中释放褐色的物质（醌类）致使培养
胡萝卜组织培养系统实验
胡萝卜组织培养系统实 验 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 2013级生物技术（国家生命科学与技 年级专业： 术基地班） 姓名：杨梦梅选课号： 学号：座号：A2 开课日期：学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究 第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 (云南大学生命科学学院, 昆明 650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特 别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方 面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次 生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1材料和方法 1. 1 材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、 10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放 在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续
《植物组织培养技术》
《植物组织培养技术》 一、课程性质 本课程是生物技术及应用专业的一门专业核心课程，是一门理论性和实践性较强的应用性科学，是培养基配制工、组培接种工、组培技术研发工和组培室（车间）主管必须的技能课程。 通过本课程的学习，培养生物技术及应用专业四大核心职业能力之一的植物组织培养技术应用能力，使学生具备植物组织培养的基本知识，能准确配制培养基，熟练无菌操作，科学设计培养方案，有效调控培养条件，正确分析解决组培异常问题，保证组培苗质量，获得从事植物组培技术应用岗位工作的职业能力，同时具备组织培养工的职业素养、自主学习能力和持续发展能力，为今后从事苗木组培快繁与脱毒工作奠定基础。 本课程以生物科学基础、应用化学、园艺植物识别等理论和实践课程为基础，同时为名优花卉工厂化生产、园艺作物无土栽培、园艺种苗繁育等其它核心课程提供新技术、新方法支持。 二、课程定位 1、理念定位 校企合作开发课程；以能力为本位，基于岗位与职业能力分析，并结合植物组织培养工
职业工种鉴定要求和行业、企业标准，构建学习领域课程内容的结构与体系；以学生为本，关注学生的职业生涯发展，遵循认知规律和职业能力形成的需要来设计安排教学活动，实施教学做考合一，体现教学目标的针对性、教学内容的实用性与科学性、教学设计的导向性和教学方法的适用性、有效性。 2、服务面向定位 服务组培企业生产一线。 3、目标规格定位 培养适应园艺作物组培生产、管理、组培苗木销售与服务需要的高素质技能型人才。 4、教学模式定位 基于行动导向理论，实施工学结合，理实一体化教学，做中学，培养组培岗位能力。 5、考核评价定位 树立“能力本位”现代高职考试观，坚持多元整体评价观，知识、技能与素质同步考核，充分发挥考试的导学促教作用，促进学生全面发展。 三、课程目标 通过不同项目和具体任务的完成，使学生具备植物组织培养的基本理论知识；能准确配制培养基，熟练无菌操作，培养出组培苗木；能科学设计培养方案，正确分析解决组培异常问题，从而控制组培苗质量；具备组织培养工的职业素质，使学生最终成为适应组培生产、管理、组培苗木销售与服务需要的、具有良好职业道德、较强组培技能和可持续发展能力的高素质技能型人才。具体目标如下： 1.专业能力 ●熟悉组培含义、类型、特点与具体应用。 ●熟悉组培工作程序、组培设施与建造要求，能使用和维护组培仪器设备，会设计组 培室，科学管理组培室。 ●熟练进行培养基制备、外植体选择与灭菌、接种、培养、组培苗驯化移栽等组培的基本操作。 ●会设计与实施组培试验方案、核算组培成本和效益分析。 ●能准确观察组培苗长势、长相，科学分析、解决组培的异常问题，有效控制组培苗质量。
胡萝卜组织培养系统实验
胡萝卜组织培养系统实验 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 2013级生物技术（国家生命科学与技 年级专业： 术基地班） 姓名：杨梦梅选课号： 学号：座号：A2 开课日期：学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究 第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 (云南大学生命科学学院, 昆明 650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特 别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方 面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次 生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1材料和方法 1. 1 材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、 10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放 在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续
最新植物组织培养技术
1 三．组培苗生长环境有何特点？如何针对这些特点提高移栽成活率？ 2 1.组培炼苗是组培过程较为重要的一个环节，是一个较为复杂的技术体系，3 提高炼苗成活率是决定组培成败和降低组培成本的关键。试管苗一般在高湿4 （100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒温（25℃）下培养， 5 2.1组培苗的特点 6 叶片无保护组织（角质层、蜡质、表皮毛等），加之细胞间隙大，气孔开张大，7 因此水分散失较快，易于萎蔫。根无根毛或极少，并且有些从愈伤组织上发育8 的根与芽的疏导组织不相同，因此吸水能力较弱。 9 2.2提高移栽成活率的方法 10 而当炼苗移栽时，环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、11 温差变大。具以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能12 力不足，即吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。另一种情况13 是，空气温度上升要比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温14 度是成正比的，当气温升高时，加之湿度较低，叶片蒸腾急速增加，此时基质15 温度上不去，根系吸水能力不够，造成蒸腾大于吸水的失衡状态，从而萎蔫死16 亡。要想获得高的炼苗成活率就得针对以上问题，一方面提高出瓶苗的质量，17 提高其抗逆性，生根前的壮苗、理想的生根配方和生根培养环境的调控是关键； 18 另一方面就得有针对组培苗特点创造一个适宜的炼苗环境，比如保证空气湿度，19 平衡空气和基质的温度平衡关系等。 20 四、生长素类分裂素类调节剂在主培中有哪些生理作用？在快速繁殖的起始， 21 芽增殖及生根培养阶段应该如何使用？ 22 培养中生长素一方面用于诱导愈伤组织的形成和生根，另一方面是与一定量23 的细胞分裂素配合使用共同诱导不定芽的分化，侧芽的萌发与生长以及某些植
胡萝卜愈伤组织诱导
胡萝卜愈伤组织的诱导 摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。 关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素 一、引言 19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。 外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质,这就是褐变现象。目前已在许多植物组织培养中发现有褐变现象,尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变现象主要发生在外植体,外植体的部位不同,取材时期不同,褐变程度亦不同,如油棕用幼嫩器官或组织,胚等作外植体进行培养,褐变较轻,而用高度分化的叶片作外植体,接种后很容易褐变。选择适当的外植体进行预处理之后,选择适宜的培养基,在黑暗或弱光下进行培养,并在培养基中加入活性碳可以防止细胞褐变的发生和发展;在外植体接种后1-2天既转移到新鲜培养基上,使细胞在褐化之前及时转移可以大大减轻或避免褐化。 胡萝卜营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。从20世纪初到近几年，胡萝卜一直是科研人员的主要研究对象。同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根。 植物组织培养首先不仅可以生产大量良性系，而且可以获得人类需要的多种代谢物质；其次，细胞融合可打破种属间的界限，客服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培养和种性的改良中发挥着巨大的作用；再次，还可获得单倍体，三倍体及其他多倍体，非整倍体;最后，组织培养的植物细胞液成为在细胞水平上分析研究的理想材料。 二.材料和方法 （一）试剂器材
胡萝卜愈伤组织的培养
胡萝卜愈伤组织的培养 摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。针对这一问题我们反复实验。通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。 关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制 1.实验流程 （1）实验总流程： MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录 （2）无菌操作流程： 实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程： 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养 （4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程： 器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种 2.实验仪器及材料 胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 3.实验方法与步骤 3.1胡萝卜愈伤组织的诱导 ①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 ②外植体接种。把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。为了操作简便、快速，外植体美观，建议使用打孔器切取胡萝卜外植体。具体操作方法: 把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中(建议使用一次性塑料培养皿)，用小刀将其切成2~3cm的小段，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2~3cm的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L KT的固体培养基上，放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d后长出淡黄色愈伤。 3.2胡萝卜愈伤组织悬浮体系的建立 用镊子夹取在固体培养基上继代20d的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤用解剖刀切碎，接种在MS+0.3mg/L 2，4-D+3%蔗糖的液体培养基(pH5.8)中，每100mL的三角瓶中加入MS液体培养基50mL，摇床转速为110r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，
植物组织培养技术
“植物的组织培养技术”知识归纳及试题例析 一、知识归纳 注：在这两种技术中均需要一定的营养物质，但营养物质的划分标准不同。 二、相关试题
1．利用菊花的茎段进行组织培养过程中，下列哪项操作或条件是可以省略的（） A．消毒灭菌B．适宜的温度 C．适宜的养料D．添加生长素和细胞分裂素 2．（2010·浙江理综，6）将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是（）3．下列关于植物组织培养的叙述中，正确的是（） A．为了提供营养和调节渗透压，培养基中应添加葡萄糖 B．培养液中的生长素和细胞分裂素会影响愈伤组织的生长和分化 C．器官、组织的细胞在不离体的情况下必须通过脱分化才能形成愈伤组织D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织的基因是相同的 4．植物组织培养的特点不包括（） A．一般需经历脱分化和再分化两个过程 B．培养抗病毒植株 C．不改变原植物的基因型 D．通过平衡的植物激素配比进行调控 5．在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是（） A．接种时培养基灭菌不彻底 B．接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体 C．愈伤组织形成初期没有给予充足的光照 D．培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的比例 6．下列关于植物组织培养的叙述中，正确的是（双选）（）A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B．培养时先使用生长素后使用细胞分裂素，细胞既能分裂，又能分化 C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D．在进行花药离体培养时确定花粉发育时期可用刚果红染色法 7．植物组织培养技术指的是在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。请回答下列问题： （1）植物组织培养用到的是固体培养基，原因是培养基中添加 了，培养基的主要成分是和有机物、植物激素。
胡萝卜组织培养导学案
植物组织培养技术 教学目标 1.简述植物组织培养的过程 2.理解植物组织培养的原理 3.通过对植物组织培养条件的分析培养学生分析问题、解决问题的能力 教材分析 重点：植物组织培养的原理 难点：植物组织培养的过程 学法指导：在讨论基础上，引领学生分析影响组织培养的因素 自主学习： 通读P34—35 胡萝卜的组织培养实验，思考以下问题 一、实验原理和材料 1、该实验的结果是什么？ 2、培养基中应该含有哪些成分？（P36小知识） 3、什么是灭菌？为什么要对培养基灭菌？ 二、方法步骤 （一）取材 （外植体定义：由活体植物体上取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等） 1、培养的是胡萝卜的哪一部分? 2、前面提到培养基要严格灭菌，你认为外植体也要严格灭菌吗？ （二）接种 1、接种过程要不要严格的无菌操作？ 2、结合材料用具，想一想，接种应该在什么环境操作？ （三）培养 1、初步培养得到的是幼苗吗？ 2、愈伤组织细胞是具有什么特征的细胞？（P33第二段） 3、什么叫脱分化？（P33第二段） 4、培养过程需要更换培养基吗？ 5、什么叫再分化？ 6、培养初期需要控制怎样的条件？ 三、理论基础（P33—34正文部分）
1、为什么通过对组织块的培养能得到完整的小植株？ 2、什么是细胞的全能性？ 3、高度分化的植物体细胞为什么具有全能性？ 4、在生物体的生长发育过程中细胞会不会表现全能性？ 合作探究 1、从培养基的配制到外植体的处理，再到接种和最后的培养，你最大的感触是什么？ 2、脱分化过程中通常要避光培养是因为更容易诱导出愈伤组织。而再分化过程通常要给以周 期性的光照，这是为什么呢？ 3、你认为影响脱分化和再分化的关键因素有哪些？ 4.、在生物体的生长发育过程中细胞不会表现全能性，怎样才能让植物细胞表现出全能性？ 5、请概括出植物组织培养的流程简图。 当堂反馈 1、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织过程中，下列哪项是不需要的（） A．无菌的培养环境B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2、用高度分化的植物细胞组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是（） 该愈伤组织是细胞经过脱分化形成的 B．该愈伤组织的细胞没有全能性 C．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成 D．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状体 3、在下列选项中，没有利用植物组织培养技术的是（） A．利用花药离体培养得到单倍体植株 B．利用基因工程培育抗棉铃虫的棉花植株 C．利用胡萝卜形成层培养成胡萝卜幼苗 D．利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到多倍体植株 预习指导 1、植物体细胞杂交的目的是什么？ 2、植物体细胞杂交和有性杂家相比有何突破之处？ 3、植物体细胞杂交技术用到了植物组织培养技术吗？ 4、怎么处理得到原生质体？ 5、诱导原生质体融合的方法有哪些？