微生物实验技术讲义
开课编号：513041Y
微生物学实验技术
Experiment of Microbiology
课程编号：S071005ZY009课程属性：专业课学时/学分：60/1
预修课程：微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学
教学目的和要求：
本课程为微生物学专业研究生专业课，也可作为相关专业研究生的选修课。通过本课程的教学，训练学生掌握微生物学的操作技能；进一步了解、深化微生物学的基本理论，加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识，同时通过实验，培养同学观察、思考、分析问题和辩证思维能力，为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。
实验一微生物实验综合介绍（8h）（刘利新）
1．微生物学实验室安全操作规程讲解
本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）,该《准则》于2003年8月1日实施。规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级及其基本要求。本节课将对其中内容进行选择性讲解，期望对新入实验室的学生规范化管理起到积极的促进作用。
2．微生物实验设备综合介绍
3．细菌、放线菌分离培养基的制备
为保证下节实验课的顺利进行，本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。详细步骤参见实验二中培养基制备。
实验二从自然界分离筛选微生物菌种（8h）（戴欣）
一、实验目的
掌握环境样品微生物分离培养的基本方法，并对分离得到的微生物进行初步分类鉴定二、实验原理
自然界中存在着各种各样的微生物，可以通过人工培养基提供微生物生长所需要的营养物质，将其中部分微生物从环境中分离出来。不同的微生物对营养要求有很大的差别，明确这一点非常重要。
培养基配制的基本原理是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养物质，一般包括碳源、氮源、无机盐和水。
由于微生物无处不在，因此培养基在使用之前必须灭菌。对于大部分培养基而言是可以通过高压湿热灭菌来实现。
由于微生物核糖体小亚基RNA基因功能稳定、分布广泛且由高变区和保守区相间组成，是目前广泛应用的微生物分子分类鉴定标准。本实验通过对微生物的16S rRNA基因序列分析从而对其进行初步分类鉴定。
三、实验内容及步骤
1.细菌、放线菌分离培养基的制备
培养基配制的基本步骤：
1)先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水
2)称量培养基各组分
3)溶化各组分，如需要可搅拌或加热
4)调pH，定容
5)分装。如需配制固体培养基可加入1.5%琼脂粉
6)高压蒸汽灭菌：一般选择121℃/20min，但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择
115℃/20min。
R2A培养基（细菌用）：
酵母提取物：0.5g；蛋白胨：0.25g；酪氨酸：0.75g；葡萄糖：0.5g；淀粉：0.5g；磷酸氢二钾：0.3g；硫酸镁：0.024g；丙酮酸钠：0.3g；加水稀释至1L，调节pH至7.5-7.8，琼脂15g，115℃灭菌20分钟后倒平板；
GYM培养基（放线菌用）：
酵母提取物：4g；麦芽糖：10g；葡萄糖：4g；碳酸钙：2g；加水稀释至1L，调节pH 至7.5-7.8，琼脂15g，115℃灭菌20分钟后倒平板。
2.样品的采集和保存
采集用具和样品放置容器严格灭菌处理，防止样品污染。
微生物分离培养样品短期可4℃保存，长时间存放最好冷冻保存。
3.微生物分离培养
微生物的分类培养要特别注意无菌操作，无菌操作基本环节如下：
1) 接种室或超净台要保持清洁，用前使用紫外灯灭菌
2) 接种的试管、三角瓶等要做好标记，避免弄混。接种使用的枪尖等要做灭菌处理
3) 接种前双手要用70%酒精消毒，并避免直接接触样品
4) 培养箱注意清洁，并经常消毒
首先根据对样品中微生物生物量的估算，按梯度稀释样品，一般制备原液、10-1~10-7稀释液；如果样品生物量较低，也可选择浓缩样品或经液体培养基富集培养样品中的微生物；
然后取100ul稀释（或浓缩）样品液或富集培养物涂布于分离培养基上，28℃（或样品
采集环境温度）倒置培养3~5天。
特定微生物的分离培养：根据微生物的营养需求选择性添加营养元素来富集特定微生物、模拟微生物的特定生境（如人工海水或者高温、低温培养）、利用微生物的某些降解活性（如纤维素降解活性）分离特定微生物等
4.微生物菌株纯化与保存
将长出的菌株挑取在新的培养基上进行划线纯化，一般重复2-3次以上；
将纯化后的菌株可转至试管斜面培养后置于4℃短期保藏，也可经液体培养后添加保护剂（甘油、二甲基亚砜、脱脂奶粉等）置于-20℃或-80℃长期冻存。
5.纯化菌株的（分子）鉴定
首先对得到的菌种进行液体培养至对数生长期，离心收集菌体，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌的总DNA。
然后使用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增条件：94℃4min, 94℃1min,55℃1min, 72℃2min, 30个循环后72℃10min，至4℃停止。PCR产物经电泳检测和PCR产物纯化试剂盒纯化后送公司测序，通过BLAST将获得的序列与GenBank数据库中序列进行相似性比对，初步鉴定菌种的类群。
16S rRNA通用引物如下：
27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'
1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC 3'
实验三厌氧微生物的培养（8h）（佟卉春）
一、实验目的
熟练掌握微生物的厌氧培养方法；观察菌体、菌落形态特征，并测定其生长曲线。二、实验原理
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。目前培养厌氧微生物的技术包括：亨盖特厌氧滚管技术，厌氧手套箱培养技术，及厌氧罐/袋培养技术。
三、试剂与器材
1.器材：普通光学显微镜，需配100倍放大的物镜，恒温培养箱，可见光分光光度计，超
净工作台，制冰机，恒温水浴锅，电磁炉，医用瓷托盘：25cm X 16cm，载玻片（最少每人1张），一次性1ml注射器（大约300支）1ml比色皿（玻璃材质即可，每组或每人一个），厌氧管及配套塞子：500支，2.5L厌氧培养罐：5只，适用于2.5L厌氧培养罐的厌氧产气袋：1包，每包10只，直径9cm标准培养皿（最少80只）
2.试剂：革兰氏染色试剂（应最少可染30张片子），BHI肉汤（Difco公司）：500克国产
琼脂：500克，75%酒精棉球
四、实验内容及步骤
以链球菌为例，进行纯度检查，厌氧培养及生长曲线测定。
1.纯度检查：涂片、革兰氏染色、及显微镜下观察细菌形态及纯度。
2.接种及厌氧培养：
1）预还原无氧培养基制备（演示）：培养基配制；分装，3ml/管；抽气换气法制造厌氧环境：先用真空泵抽成负压99.99kPa（750mmHg），然后充入无氧氮气，反复4次，最后充入80%N2、10%H2和10%CO2的混合气体；高压蒸汽灭菌。
2）接种及厌氧培养：将过夜培养的链球菌以1：20的比例接种到新鲜的预还原的厌氧培养基中，37℃温箱培养，每隔1小时取1ml样品，用分光光度计测定其在600nm处的光吸收
值，记录并绘制生长曲线。
3.Hungate厌氧滚管
1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释。用无菌注射器吸取1ml 原液至另一支装有9ml培养基的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释，制成不同浓度的样品稀释液。取适宜稀释度的样品进行厌氧滚管。
2）厌氧滚管：将预先配制的装有2.7ml无氧琼脂培养基的试管置于沸水中融化，放置于55℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取适宜稀释度的稀释液各0.3ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
2）37℃温箱培养，24小时后观察并记录菌落形态。
4.厌氧罐培养
1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释，取适宜稀释度的样品涂布平板。
2）将平板置于厌氧罐中，厌氧罐由透明的聚碳酸酯或不锈钢制成，盖子内侧有金属网状容器，用于装厌氧指示剂美蓝和用铝箔裹封的催化剂钯粉。然后将气体发生袋放入容器密封后，容器内的氧气在0.5~1小时内被完全吸收，同时产生等量的二氧化碳。
3）37℃温箱培养，24小时后观察、记录菌落形态，并计数菌落数目。
实验四生长谱法选育营养缺陷型菌株（8h）（何秀萍）
一、实验目的
理解营养缺陷型菌株的选育原理及用途，掌握筛选营养缺陷型菌株的方法。
二、实验原理
营养缺陷型菌株是指由于基因水平上的变化，使细胞缺失有功能的某种蛋白质（多数为酶），造成代谢途径的阻断，不能合成某种必需的代谢产物，只能在营养丰富的完全培养基或外源添加被阻断合成的物质的基本培养基中正常生长的一类菌株。利用物理、化学或生物学手段使特定代谢途径中关键酶基因发生突变，并结合有效的筛选方法，就可以获得特定的营养缺陷型菌株。营养缺陷型菌株被广泛应用于代谢调控及代谢工程改造中解除反馈抑制，使中间产物或分支途径中终产物大量积累，如氨基酸、维生素、核苷酸等。同时营养缺陷型也是遗传学研究、传统微生物育种技术（细胞杂交和原生质体融合）及基因工程中应用最为广泛的遗传筛选标记。
三、实验内容及步骤
1、实验材料
(1) 菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
(2) 培养基及试剂
酵母菌完全培养基(YPD)：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，溶于蒸馏水，自然pH。
配置固体培养基需加入1%琼脂粉。8磅灭菌30min；
酵母菌基本培养基(SC)：0.67% (Yeast Nitrogen Base, Difco)，1%葡萄糖，溶于蒸馏水，自然pH。配置固体培养基需加入1%琼脂粉。8磅灭菌30min；
其他试剂：0.25 g/L尿嘧啶、1g/L色氨酸、0.35g/L组氨酸、0.3g/L亮氨酸、0.3g/L赖氨酸。
2、方法和步骤
(1) 诱变后菌液处理：诱变后细胞悬浮液进行10倍的梯度稀释，然后涂布在YPD固体培养
基平板上，30℃温箱培养48 h；
(2) 营养缺陷型突变株的检出：将YPD平板上长出的单菌落挑到装有1ml无菌水的小试管
中制成菌悬液，室温静置4 h；分别取一接种环菌悬液点接于SC和YPD固体培养基上，30℃温箱培养48 h；在YPD固体平板上能够生长，在SC固体平板上不能生长的就是可能的营养缺陷型菌株；
(3) 营养缺陷型的鉴定：通过在基本培养基SC中补充不同的营养元素，检测细胞生长情况，
确定突变菌株具体缺失了那种物质的合成能力。一般先进行大类的鉴定，如氨基酸、核苷酸或维生素等营养缺陷型；然后对大类内部各物质缺陷型进行具体的鉴定。
营养缺陷型大类的鉴定：将可能的营养缺陷型细胞转接到无菌水中，5000 rpm离心5分钟离心收集细胞，用无菌水洗两次，重悬于无菌水中，使细胞浓度约为106个/ml，取1ml 菌悬液，与融化后冷却到45-50℃的15 ml SC固体培养基充分混合，倒入培养皿中，凝固后，将培养皿底部划分为三个区域并做标记，然后在平板里的三个对应区域分别贴上蘸有氨基酸混合液、维生素混合液、碱基混合液的滤纸片，30℃温箱培养48 h，根据在滤纸片周围是否出现微生物生长圈，确定突变株属于哪一大类的营养缺陷型；
营养缺陷型的具体确定（以氨基酸缺陷型为例）：按照每次缺少一种氨基酸的策略，制备含有不同氨基酸组合的SC固体培养基平板；将YPD斜面上培养的细胞接一环于无菌水中，室温静置4 h，然后将菌悬液分别对应点于上述不同的固体平板上，30℃温箱培养
48 h，在缺少了某种氨基酸的培养基上不能生长的突变株即为该氨基酸的营养缺陷型菌
株。
四、思考题（可有可无）
在营养缺陷型菌株的检出和鉴定过程中，将细胞接于无菌水中，室温静置4 h的目地是什么？
实验五乳酸测定及酸乳制备（8h）（钟瑾）
发酵液乳酸含量的测定
乳酸是一种重要的食品添加剂，乳酸钙、乳酸锌、乳酸铁等衍生物是重要的药品；同时，乳酸也是合成新型可降解材料聚乳酸(PLA)的单体物质，因此，乳酸一直受到国内外研究者的广泛关注。现有的乳酸定量测定方法，包括对羟基联苯法、高效液相法、气相色谱法、酶法等。本实验采用特异性好、灵敏度高的对羟基联苯法测定发酵液中乳酸的含量。
一、实验目的
1.掌握发酵液中乳酸含量的测定方法。
2.了解不同样品环境下乳酸含量的测定方法。
二、实验原理
乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在565 nm处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量与565 nm 处吸光度呈线性关系，因此可以通过测定565 nm处的吸光度来测定乳酸的含量。
三、实验内容及步骤
1.发酵液样品预处理
取适量发酵液样品5000 r/min 离心10 min，以除去菌体和碳酸钙沉淀,取上清液适当稀释，吸取稀释液2 mL于洁净离心管中，加入2 mL 钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物，10000 r/min离心10 min，取上清液置于10 mL 洁净离心管中，60℃水浴保温30 min左右，冷却待用。
2.吸光度测定
精确吸取5 mL待测液于10 mL EP管中，加入0.05 g 氢氧化钙，混匀，然后加入0.8 ml 20%硫酸铜，迅速混匀，沸水浴3 min，水浴冷却，3000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL 加入比色管中；加入6 mL 浓硫酸，混匀，沸水浴加热5 min，取出后冰水浴冷却；加入1.5%对羟基联苯溶液0.125 mL，充分混匀，静置15 min；置于沸水浴中加热5 min，冰水浴冷却，以蒸馏水为参比液，在565 nm处测吸收。
3.标准曲线的制作
0.5 mg/mL乳酸标准液与发酵液同样预处理后，取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL处理液，分别加进8支预先编号的试管，再用蒸馏水补足体积至5 mL，按上述步骤操作，分别测定吸光度。以乳酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到标准曲线。
4.利用标准曲线所得的回归方程，结合样品的吸光值，计算样品中乳酸的含量。
酸乳的制备
酸乳是以鲜乳为主要原料，经过预处理，然后接种乳酸菌（例如，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌等）作为发酵剂，并保温发酵一定时间，使乳中蛋白质凝结的一种乳制品。酸乳中的蛋白质更易被机体合成细胞时所利用，具有更好的生化可利用性，含有更多的易于吸收的钙质和丰富的维生素，减轻“乳糖不耐受症”；同时，酸乳成品中含有大量的活性微生物，能改善肠道菌群，抑制致病菌的生长繁殖，增强免疫，刺激肠胃蠕动等。
一、实验目的
1.学习实验室制作酸乳的方法。
2.了解酸乳制品质量（酸度和乳酸菌含量）的检测方法。
二、实验原理
利用乳酸菌发酵牛奶中的乳糖，产生大量的乳酸，使酪蛋白变性凝固，而使整个奶液呈
现凝乳状态。
三、试剂与器材
1.器材：天平，恒温水浴锅，恒温培养箱，无菌操作台，灭菌的三角烧瓶（250 mL）
2.试剂：牛奶，酸乳，蔗糖
四、实验内容及步骤
1.将市售牛奶100 mL加到250 mL的三角烧瓶中，再加5 g蔗糖，摇匀，用无菌封口膜封
好瓶口；
2.三角烧瓶放入80℃的恒温水浴锅中，不时摇动，保持15 min，然后立即从水浴锅中取
出，用冷水冲洗其外壁，使巴氏消毒奶冷却至45℃；
3.将市售酸乳按5%-10%接种量，加入上述三角烧瓶中，充分摇匀，盖好封口膜；
4.将三角烧瓶放于40-42℃的培养箱中发酵6-8 h，当发酵奶出现凝固状时，停止发酵；
5.接着将三角烧瓶放在低温（4-6℃）下后熟，持续24 h以上，这样就得到酸乳成品了；
6.对制备的酸乳进行乳酸菌活菌计数和酸度的测定（略）。
酸乳中乳酸菌活菌计数
一、实验目的
1.学习利用稀释涂布平板法对样品中的活菌进行计数。
2.了解乳酸菌的培养过程。
二、实验原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀
释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含活菌数。
三、试剂与器材
1.附：GM17固体培养基配方（1 L）
胰蛋白胨 5 g MgSO4.7H2O 0.25 g
大豆蛋白胨 5 g 琼脂粉15 g
牛肉膏 5 g 酵母提取物 2.5 g
葡萄糖 5 g β磷酸甘油二钠19 g
维生素C 0.5 g
四、实验内容及步骤（需无菌操作）
1．编号
一个样品，取无菌平皿3个，分别标明10-7、10-8、10-9。另取6支离心管，依次标明-1, -3, -5, -6, -7, -8，分别加入900, 990, 990, 360, 360, 360 μL的生理盐水。(提前一天倒好平板，标号和稀释液预先准备)
2．重悬及稀释
用移液器精确地吸取酸乳100 μL加入-1号离心管中，另取枪头来回吹吸使其混合均匀。自-1号离心管吸取10 μL放入-3号离心管中，混匀。由-3到-5经同样的操作。接下来的梯度稀释过程如下：即40 μL-5号离心管加入-6号，40 μL-6号离心管加入-7号，40 μL-7号离心管加入-8号中，操作同上。
3．涂布平板
分别从-6，-7，-8离心管中吸取100 μL菌液，涂布到已倒好培养皿中，涂布均匀，待菌液渗透后，倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4．计数
培养24小时后，取出培养皿，并按下列公式进行计算：
每mL酸乳中总活菌数= 菌落数×稀释倍数× 100
五、一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算菌落数最为合适。在这个范围
内，各
实验六动物病毒的鸡胚培养（8h）（严景华）
一、实验目的
了解流感病毒在鸡胚尿囊腔中的增殖过程；
掌握流感病接种毒鸡胚的方法和途径及流感病毒收获的方法；
掌握红细胞凝集实验的操作方法及结果判定；
掌握RT-PCR检测流感病毒的原理和方法
二、实验原理
鸡胚是正在发育的机体，它的组织分化程度低，许多病毒在鸡胚中都能适应繁殖而且从感染病毒的鸡胚中可以收获大量病毒，此外，鸡胚接种操作简单，现有的鸡胚来源充足且是SPF，对接种病毒不产生抗性。因此常用来进行病毒的分离、培养以及毒力的测定，中和试验和制备疫苗等。
鸡胚是流感病毒培养和疫苗生产的重要材料。因此，本实验将利用流感病毒为材料学习动物病毒鸡胚培养技术。流感病毒的检测通常采用细胞凝集实验和PT-PCR的方法。流感病毒颗粒膜蛋白HA蛋白可以识别和结合宿主细胞表面的含唾液酸的糖蛋白和脂蛋白，鸡血红细胞表面均含有此种蛋白，因此它能够被流感病毒识别并结合发生红细胞凝集现象。流感病
毒8个基因片段5’和3’非编码区都含有一段保守序列，因此可以通过设计通用引物扩增流感病毒基因片段。
1.尿囊腔接种流感病毒
1.1活胚检查
购买9-11日龄的鸡胚，在使用前进行检查。首先，活胚的血管明显可见；其次，活胚有明显的胎动，尤其在轻轻转动时可见脐带活动；最后，良好的鸡胚可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。若鸡胚血管模糊甚至不见、胎动不明显或没有、绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断鸡胚濒死或已经死亡。
1.2接种
照检后，在胚胎面与气室交界边缘处避开血管做标记。在标记周围用先用2.5%碘酒消毒，再用75%酒精脱碘，在标记以上约1mm处打孔。用注射器抽取要接种的病毒液，垂直插入约1cm，注射约0.1-0.2ml病毒液，用融化的石蜡封口。
1.3后期观察
将接种后的鸡胚置于孵箱中继续培养，每日照检一次。在24小时内死亡的鸡胚为非特异性死亡应弃去。鸡胚在24-72小时内死亡后应及时收取尿囊液。在72小时仍未死亡的鸡胚置于4℃6小时或过夜，或者置于-20℃1小时，目的是致死鸡胚使血液凝固。
1.4收获
用碘酒消毒，再用75%酒精脱碘。将气室上方的卵壳敲碎并取走，用镊子等按压胚胎同时将尿囊液吸出置于无菌管中，并离心。
2.血凝检测
2.1实验前准备1% 鸡红细胞悬液：将采取的鸡血（含阿氏液未凝血）转移到离心管中，用PBS稀释，1500rpm离心10min，弃掉上清和白细胞，留取红细胞，重复3次；最后用PBS 配成1% 鸡红细胞悬液，置于4℃；
2.2在96孔血凝板中加入25 μL PBS/孔，在第1列加入25 μL病毒液，混匀，吸取25 μL混合液加入到第2列中，混匀，以此类推，倍比稀释病毒液。稀释到倒数第2列时，混匀弃掉25 μL混合液。最后一列作为阴性对照，不做任何处理；
2.3每孔加入25 μL 1%鸡红血细胞。相混后置于室温，25-30 min时观察血细胞的凝集情况。一般来说，将血凝板直立，若血红细胞呈泪滴状流下说明无病毒，若血细胞弥散在整个孔中则有病毒。
3.RT-PCR检测流感病毒
3.1病毒RNA提取
取100ul鸡胚扩增的流感病毒，按试剂盒说明书（QIAamp Viral RNA Mini Kit）提取病毒RNA。
3.2反转录
取5ul RNA，70℃5分钟，冰浴2分钟。按试剂盒（Reverse Transcription System，Promega）说明书配制反应体系，室温放置10min，42℃反应1小时。
3.3 PCR
取1ul反转录cDNA做模板，加入M基因通用引物，进行PCR扩增。扩增条件：预变性95℃5min，循环参数：94℃1min, 55℃1min, 72 2min, 30循环。
3.4 PCR产物鉴定
取10ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（1% 琼脂糖凝胶）。凝胶成像仪观察结果。
实验七固定化枯草芽孢杆菌连续发酵生产α淀粉酶（8h）（钞亚鹏）一、实验目的
了解固定化细胞和固定化酶的基本原理和方法；掌握运用物理包埋法固定枯草芽孢杆菌的技术以及连续生产α-淀粉酶的实验过程。
二、实验原理
聚乙烯醇/海藻酸钠/细胞混合溶液在氯化钙/硼酸混合液中可以形成不同粒度的球形颗粒，这种颗粒有一定的硬度、韧度和孔径。同时具有生理活性的细胞被固定在这些颗粒里。当给予适当的生长或反应条件时，细胞可以不断的分泌人们所需的蛋白、酶、以及各种代谢物，或者将外源底物催化转化成目的产物。在反应结束后，固定化细胞可以方便的从反应体系中分离出来，经过适当的处理后用于下轮反应。固定化细胞最大的特点是高效性和可以重复使用。
三、试剂与器材
1.器材：超净工作台、培养箱、分析天平、灭菌锅、微波炉，磁力搅拌器，磁转子，分光
光度计，水浴锅。500ml三角瓶10个，250ml三角瓶1个，小试管约50支、大试管10支、10μl，100μl 、200μl ，1ml，5ml移液枪各一支及其相配套的枪头盒，1000ml烧杯5个，药匙3个，500mL量筒1个，棕色瓶1个，带盖试剂瓶1个，洗瓶1个，注射器，比色皿3个。
2.试剂：聚乙烯醇，海藻酸钠，氯化钙，硼酸，可溶性淀粉，浓盐酸，碘化钾，碘
四、实验内容及步骤
1.枯草芽孢杆菌发酵培养及菌体收集
在牛肉汁斜面上划线活化枯草芽孢杆菌一次。然后将斜面种子接种于牛肉汁液体培养基（500ml摇瓶装液量100ml，共10瓶），37oC振荡培养过夜。离心收集菌体（6000r/min，15min），用生理盐水洗涤1次，后将细胞悬浮于50ml 生理盐水中。
2.固定化细胞过程
10%聚乙烯醇+1%海藻酸钠溶液50ml，加入5ml处理好的菌悬液（载体：菌悬液=10：1），混匀，温度控制在40℃左右，然后用注射器滴加到冷却的含有2%氯化钙和4%硼酸溶液中，边滴加边搅拌，室温交联4小时，4℃下硬化16-20小时，取出用无菌水洗涤后待用。
3.利用固定化细胞发酵生产α淀粉酶
取适量的固定化细胞颗粒置于500ml摇瓶中，加入100ml新鲜无菌的牛肉汁培养基，37oC振荡培养2h以上，取上清液测定淀粉酶活性。
4.淀粉酶水解活性测定方法：
预先配制0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L I2液：
0.1mol/L HCl溶液：取4.95mL的浓盐酸，加水定容到500mL，放入试剂瓶中保存
0.1mol/L I2 液：称取6.5g碘及17.5g碘化钾，溶于少量水中，然后移入500mL棕色试剂瓶中，加水稀释至500mL，用磁力搅拌器搅匀。用时稀释100倍。
配制质量分数0.25%(w/v)的可溶性淀粉溶液，煮沸。将各试管标号，先向各试管中分别加入0.4mL 0.25%可溶性淀粉溶液，然后于40℃恒温水浴预热15min。然后向各试管中加入
0.1mL适度稀释的酶液（用蒸馏水稀释），对照组在加酶之前先加入0.1 mol/L HCl 溶液
1.5mL，混匀，然后置于40℃恒温水浴反应10 min。反应10min后，取出各试管，立即向实验组补加1.5 mL 0.1mol/L HCl溶液，然后向各试管中均加入3 mL 1mmol/L I2 液及5 mL 蒸馏水，混匀，迅速于700 nm处测定OD值，用蒸馏水作为空白调零，记录数据。
在上述条件下定义，以每分钟降低10%吸光度所需的酶量定义为1个酶活力单位。
按以下公式计算酶活：酶活单位(U/mL)=(a-b)/a×100×酶液稀释倍数式中：a为对照组的吸光值，b为实验组的吸光值；
五、思考题（可有可无）
固定化酶技术大体有哪几种？在新型微加工技术不断发展的今天，固定化酶的技术、固定化酶颗粒尺度、固定化酶的性能有何新的进展？
实验八实验结果总结、分析（4h）（全体老师）
主要参考书：
1、赵斌、何绍江《微生物学实验》科学出版社2002年
2、沈萍、范秀容、李广武《微生物学实验》第三版高等教育出版社1999年
3、钱存柔、黄仪秀《微生物学实验教程》北京大学出版社1999年
4、黄秀梨《微生物学实验指导》高等教育出版社1999年
教学方式：实验室讲解，实验
考核方式：实验报告
撰写人：（国科大生命科学学院）刘利新
撰写日期：2011年11月
修改日期：2012年12月（全体授课教师）
微生物学实验知识点总结与实践应用
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
实验生物学讲义
实验四多重序列比对及系统发生树的构建 【实验目的】 1、掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法； 2、熟悉构建分子系统发生树的基本过程，掌握使用MEGA软件构建系统发生树的操作方法。 3、进一步熟练BLAST的使用 【实验原理】 在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。 对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤： ⑴要对所分析的多条目标序列进行比对； ⑵要构建一个进化树（phyligenetic tree）。 构建进化树的算法主要分为两类：基于距离的方法和基于形状的方法。基于距离的方法是指计算序列之间的两两距离，构成距离矩阵，然后采用聚类算法推断进化树。最常见的基于距离的方法是UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean，不加权算数平均对群法）与Neighbor-joining（邻接法），前者不如后者准确。基于性状的方法是指把序列中每个位点的状态视为性状，建立进化树模型来描述序列之间的性状差异。最常见的基于性状的方法包括最大简约法，最大似然法以及贝页斯方法。基于距离的方法相对于基于性状的方法，在计算速度上快很多，而且适用于各种类型的数据（如SNP数据，基因表达数据等）；基于性状的方法计算速度较慢，搜索空间更大，得到的结果也往往更加准确。在研究中一般都会尝试不同的方法来建立进化树，综合多种方法得到的结果更加可靠。 ⑶对进化树进行评估。进化树的构建是一个统计学问题，我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟，需要进行统计学检验和评估。现在主要采用的方法是bootstraping，该方法的原理是每次以位点为单位对用于建树的多序列比对进行重新采样，看得到的进化树跟使用原有多序列比对得到的进化树的相似性。简单的说，就是看如果只用多序列比对的部分信息（2/3左右）构建进化树，得到的序列间的关系是否比较稳定。 在实际应用中，多序列比对常用的软件包括ClustalW/X, MUSCLE, MAFFT 等，三者的准确性相当，但计算时间依次减少；进化树构建常用的软件包括PHYLIP(软件包，包括多种建树方法），MEGA，MrBayes，Phyml等等。从用
微生物学实验讲义
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
微生物学实验讲义
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
《生物技术基础实验-Ⅰ》教学大纲.doc
《生物技术基础实验-1》教学大纲 课程编号：0231209 课程名称：生物技术基础实验-1 实验学时：80 %1.实验课的性质、任务与目的 地位： 生物技术基础实验- I所依托的理论课主要有普通生物学、生物化学和微生物三门课程。因此，生物技术基础实验-1起着承上启下的作用，它是学生在完成化学基础实验后向生物学专业实验过渡的桥梁，是培养“生物”意识的起始，对后续专业理论课和实验课的学习具有重要的影响。 作用： 普通生物学是高等院校理工类生物技术专业的一门实践性很强的基础课程。实验环节的教学对于学生加深理解并掌握基木概念、原理、理论和研究方法，培养其实验技能、形象思维和创新能力有着重要的作用。 微生物学一门以实验科学为基础的学科，生命学科很多理论上的突破都是基于微生物学实验而取得的。对生物技术专业来说，微生物学实验课程的设置，不仅是必需，而旦是需要加强的。微生物实验课程是进行本专业其它学科的学习所必需具备的主要基础知识之一。任务：生物化学实验的任务是教授生物化学实验技术的基础理论及应用，并通过具体的实验教学使学生掌握常用的生物化学实验技术理论和方法，并能进行独立的实验操作，促进学生创新意识的形成和综含素质的提高。 通过微生物学实验课程的学习，要求学生能牢固树立无菌概念，熟练掌握一整套的无菌操作技术，学会常规仪器、设备的正确使用，了解在生物学科研工作中常用的材料、方法和手段，尽量多提供动手机会，使学生具备训练有素的操作能力，并且能够运用理论知识来分析解释实验过程中的现象和结果，作出正确的推理和判断,使理论与实验课的学习相辅相成, 培养学生实事求是的科学态度和良好的工作作风，为学习后续课程打下基础。 目的： 1 .使学生了解“生物大分了的分离和纯化方法，糖、蛋白质及主要次生代谢产物的定性、定量和有关生物化学性质的分析技术。 2.使学生掌握酶活性测定、动力学分析等基本知识、方法和基木技能技巧。
微生物学实验
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
食品微生物学实验技术思考题答案
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
水处理微生物学实验讲义
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
生物学基础实验技能讲义
生物学基础实验技能 实验讲义 王玉倩冯晓英郭娟张潮汤晓辛唐婧编 贵州师范大学生命科学学院 2012年6月
目录 一、显微操作 (2) 实验一显微镜的使用方法与绘图 (2) 实验二简单临时装片的制作与观察，油镜的使用 (6) 实验三压片的制作，涂片的制作 (8) 实验四生物材料的解剖结构观察 (10) 二、溶液配制 (11) 实验五玻璃器皿的洗涤 (11) 实验六、溶液的配制Ⅰ (13) 实验七、溶液的配制Ⅱ (15) 实验八溶液pH值的调节 (18) 三、分光光度计的使用 (20) 实验九分光光度法的介绍及分光光度计的使用方法 (20) 实验十混合物中CuSO4的测定 (24) 实验十一分光光度法测定叶绿素的含量 (26) 四、无菌操作 (28) 实验十二无菌操作技术 (28)
一、显微操作 实验一显微镜的使用方法与绘图 一、实验目的 1、掌握显微镜的构造及原理，熟练使用光学显微镜。 2、了解显微镜使用的基本要求、注意事项及一般维护方法。 3、学习生物绘图的基本要求及方法。 二、实验原理 显微镜的原理是经过两次成像，成为倒立的虚像。第一次先经过物镜成像，在物镜的一倍焦距和两倍焦距之间成放大的倒立的实像。第一次成的物像，经过目镜的第二次成像，是一个虚像。倒置的像常常使初学者使用发生困难。 1、显微镜的构造 机械部分 (1) 镜座 显微镜最下面呈马蹄形或园形的部分，起稳定和支持镜身作用。 (2) 镜柱 从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。 (3) 镜臂 弯曲成马蹄形的部分，便于手持，下端与镜柱相连接的地方有一个倾斜关节，可使镜臂倾斜，便于观察。 (4) 载物台 自镜臂下端向前伸出，放置标本用的平台，其中央有一个园孔，叫通光孔。台上有一移动器（老式的左右各有一个压片夹），用以固定和移动标本。 (5) 镜筒 和镜臂上方连接的园筒部分。有的显微镜镜筒内有一抽管，可适当抽长，一般长度是160－170毫米。镜筒上端装有目镜，下端有一个可转动的园盘，叫物镜转换器（或叫物镜旋转盘，固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜）。作用是保护成像的光路与亮度。 (6) 调节器（也叫调节螺旋） 为镜壁上两种可转动的螺旋，一大一小，能使镜筒上下移动，调节焦距。大的叫粗准焦螺旋，位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距，升降镜筒较快，用于低倍镜对焦；小的叫细准焦螺旋，位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，升降镜筒较慢，可以细调焦距。 (7) 倾斜关节 镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。 (8) 载物台 从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移
微生物学实验
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
微生物学实验教案
微生物实验教案 实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察 一、实验目的 以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 1显微镜油镜使用的原理 （1）光学部分 : 接目镜、接物镜、照明装置 ( 聚光镜、虹彩光圈、反光镜等 ) 。它使检视物放大 , 造成物象。（ 2）机械部分 : 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转 移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。 2 显微镜的放大倍数和分辨 率（ 1）放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公 式表示为： D=λ /2n ·sin(α/2 ) 式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55 μ m） n:物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。 3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒 精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。 2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。 四、实验方法与步骤 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （ 2）调节光亮度。 （ 3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。 （ 4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （ 5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油， 使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （ 6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （ 7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
微生物学实验指导(10.10)
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
《生物化学》实验讲义
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在 碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。
3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL ，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g 茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH 溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。 (2) 另取1支试管，加入1mL 蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH 溶液摇匀，然后再加入 2滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL ，再加 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
微生物学实验报告
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
水处理微生物学实验指导书
水处理微生物学实验指导书 班级 姓名 学号 市政与环境工程学院 年月
目录 实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察实验二革兰氏染色技术 实验三培养基的配制和灭菌 实验四水中细菌总数的测定
实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察 一、实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2）观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。 （1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，