bac载体的重要工作元件
bac载体的重要工作元件
重要的bac载体工作元件包括：
1. 起始子（origin of replication）：用于启动DNA复制过程的特定序列，使得DNA在细胞中能够自主地进行复制。
2. 选择标记（selection marker）：用于筛选成功转化了bac载体的细胞。常用的选择标记包括抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（ampicillin resistance gene）或氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene）等。
3. 多克隆位点（multiple cloning site，MCS）：是一个包含多个限制酶切位点的DNA序列，用于插入外源DNA片段。MCS通常位于载体上的转录起始子和终止子之间。
4. 转录起始子（promoter）：用于启动DNA的转录，将外源DNA片段转录成RNA。
5. 5' 端终止子（terminator）：用于终止转录过程，保证转录的准确性和稳定性。
此外，还有一些辅助元件，如DNA复制起始子（replication origin），能够增强复制效率；反向选择标记（counter-selection marker），用于筛选未成功转化的细胞等。这些元件共同协作，构建了有效的bac载体，可以稳定地携带和复制外源DNA。
基因工程选择题
1.限制性内切酶一般保存在（50%）浓度的甘油溶液中。? 2.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显着区别在于（?A?）? 3.?A.?前者是物理图谱后者是连锁图?? 4.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C）????? C.?只能作用于双链?DNA?? 5.已知某一内切酶在一个环状?DNA?上有?4?个切点，当用此酶切割该环状?DNA?，可以得到（?4?）个片段?? 6.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（5%?）以下???? 7.在下列进行?DNA?部分酶切的条件中，控制哪一项最好（?D?）?D.酶量??? 8.DNA?被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C??）? ?A.?蛋白质（如?BSA）同?DNA?结合 B.有外切核酸酶污染? C.酶失活? D.酶切条件不适合??? 8.nick切口?与?gap?缺口的区别在于（A??）?? ?A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指?DNA?的单链中有较小的缺失? ?9.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（?A?）?? A.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） 10.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（?A?）?? ?A.识别相同序列的限制酶称同裂酶? B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶?? C.同裂酶的切割位点一定相同? D.同裂酶的切割位点不相同??? ?11.下列哪一种酶作用时需要引物（B??）?? A.?末端转移酶? B.反转录酶? C.DNA?连接酶? D.限制酶??? 12.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（?C?）不恰当?? A.由作用于同一?DNA?序列的两种酶构成?? B.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对?DNA?进行修饰?? C.不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统?? D.这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶???? 13.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C.双链?DNA?的特定碱基序列??）???? 14.在大肠杆菌中，大多数都有三个位点特异性的?DNA?甲基化酶，以下选项中哪一种酶不包括在内??（D??） A.?dam?? B.?dcm（）? C.?EcoKⅠ? D.?SssⅠ??? 15.在大肠杆菌中，至少有?3?种依赖于甲基化的限制系统，以下选项中不属于这?3?种的为（?C?）?? A.??mcrA? ? B.?mcrBC C.??mcrD? ? D.??mrr???? ?16.下面有关限制酶的叙述哪个是错误的（??A）?? A..?限制酶是外切酶而不是内切酶?? B.?同一种限制酶切割?DNA?时留下的末端序列总是相同的?? C.?一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链?DNA?，产生粘末端?? D.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链?DNA?，产生平末端??? ?17.DNA?连接酶在体内的主要作用是在?DNA?复制、修复中封闭缺口，下列对?DNA?连接酶的描述中，哪项是正确的（??A）?? A.?将双链?DNA?分子中的?5'?磷酸基团同?3'－OH?末端重新形成磷酸二酯键?? B.作用时不消耗能量 C.?需要?Mn2+?等二价辅助离子 D.也可以连接?RNA?分子??? 1.氨苄青霉素的工作原理为（A?）?? A.?可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 3.载体所具备的特点中，以下描述不恰当的是（B??）? ?A.?必须具备复制起点，能够自主复制?? B.必须具备合适的酶切位点，供外源?DNA?片段插入?? C.有一定的筛选标记，用于筛选?? D.?必须具有较高的拷贝数，便于制备??? 4.复制子由三部分组成，以下不属于的为（?D?）??（） ?A.?复制起点? B.?复制区? C.?复制终点? D.启动子??? 5.pBluescript?M13?载体在多克隆位点的两侧引入了?T7?和?T3?两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，以下?4?种功能哪一种是不正确的（D）?
基因工程考试 质粒的分子生物学与质粒载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作 练习题 质粒的分子生物学与质粒载体（练习题） 一、填空题 1. 基因工程中有3 种主要类型的载体：、、。 2. 由于不同构型的DNA 插入EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA 的泳动速度，OC DNA 泳动速度，L DNA 居中，通过凝胶电泳和EB 染色的方法可将不同构型的DNA 分别开来。 3. 质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点开始的。然而，质粒的复制可以是向的、或是向的。在杂种质粒中，每个复制子斑点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下的复制起点可能被关闭。 4. 就克隆一个基因(DNA 片段) 来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部 分：、、。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5. 如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于群，这是因为它们的所致。 6. 质粒拷贝数是指细胞中。 7. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。 8. 酵母的2μm 质粒有，可以配对形成哑铃结构。 9. 一个带有质粒的细菌在有EB 的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫。 10. pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 11. 粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过恢复 该基因的性状。 12. ColEl 质粒复制的起始需要三种酶，即、和。 13. YAC 的最大容载能力是，BAC 载体的最大容载能力是。 14. pSCl01 是一种复制的质粒。 15. 把那些没有可检测表型的质粒称为。 16. 转座子主要由下列部分组成：(1) (2) (3) 。 17. pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC 系列的载体是通过和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 二、判断题 1．迄今发现的质粒DNA 都是环状的。 2．线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。 3．有a、b、c 三个质粒，因为a 和b 能够共存于一个细胞，a 和c 也可共存于同一个细胞， 所以b 和c 一定能够共存于同一个细胞。 4. 插入元件(1S)也是一种转座元件，它除了有转座酶基因外，还有附加基因。 5. 如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，这两种质粒则属于同一个不亲和 群。 6. 一个带有反向重复序列的双链DNA 经变性后，复性时其单链可形成发夹环。
厦门大学基因工程课后思考题
第一章核酸的制备 1.名词解释： 脱氧核糖核酸： 核糖核酸： ccc-DNA：当两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA（cccDNA）oc-DNA：如果两条核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA） l-DNA,：发生双链断裂而形成线性分子（L—DNA），L构型 DNA变性：双联变成单链 DNA复性：单链又变成双链 PCR, 模板，引物 2.分别阐述用CTAB裂解法，SDS裂解法，碘化钠裂解法以及蛋白酶K裂解法和溶菌酶裂 解法裂解细胞的依据。 溶菌酶：破坏细胞的细胞壁肽聚糖骨架，在内部渗透压的作用下使得细胞胀破。 CTAB裂解法：CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚SDS裂解法：利用中性去污剂NP-40破坏全血的红细胞膜，离心弃去溶血液，收集白细胞沉淀，加入去污剂SDS以破坏白细胞核膜，并使核蛋白解离，再加入高 浓度的NaCl使DNA溶解，同时使蛋白盐析。通过离心收集水相，加2— —2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA 碘化钠裂解法：低渗破坏细胞，碘化钠破坏核膜 蛋白酶K裂解法：蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白 质的一般降解 3.用于检测样品纯度和浓度的方法有哪些？简述个各方法的基本原理。 电泳、OD值、荧光定量法 第二章基因工程工具酶 1.名词解释： 限制性内切核酸酶：在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开 DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA•裂口连接起来 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与模板的序列互补 Klenow片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分 之二的大肽段,即Klenow 酶 限制性图谱（物理图谱）：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱， 通常以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。 2.简述限制性内切核酸酶的作用机制，并说明其在基因工程操作中的重要性。 3.比较E.coliDNA连接酶与T4DNA连接酶的性质和作用。
基因工程名词解释(全)
1.Gene Engineering基因工程:在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖,培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体(指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱,并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的. 3.Gene Therapy 基因治疗:是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因,补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。 。基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。Vector载体:是把外源DNA(目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。 plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。 质粒不相容性；同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。 multiple cloning sites,MCS多克隆位点:DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案. α—互补：LacZ’基因的互补:lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。 粘性末端:指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分，这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下，使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子. cos位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子,这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 Cosmid考斯质粒：由于λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的重组质粒,可装载DNA（32～45.5kb）。 pBR322：是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 phagemid or phasmid噬菌粒：是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 人造染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称之为。 BAC细菌人工染色体：是指一种以F质粒为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。 YAC酵母人工染色体:是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体,含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。 19。工具酶;基因工程中分子水平的操作,是依赖于一些重要的酶（如限制性核酸内切酶,连接酶等）作为工具对DNA进行切割和拼接,我们把这些有关的酶统称为基因工程进行切割和拼接，我们把这些有关的酶统称为基因工程工具酶。 20。R—M System限制与修饰系统：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断,细菌自身的DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 21。同裂酶：又称异源同序酶或异源同工酶,是指识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶识别相同序列. 22。同尾酶:是指识别位点不同,但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能互补连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏. 23。star activity星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性
载体
基因工程的载体 载体的特征： 在寄主细胞中能够自主复制； 有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段； 在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征； 载体分子较小，以便体外基因操作； 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件； 载体的类型 ?质粒 ?噬菌体 ?其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒) 质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞 ?并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒 ?质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106 质粒的形态 1) cccDNA—双链闭合环状DNA 2) ocDNA—开环DNA 3) cDNA—线形DNA（L型） 在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用 溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用 随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链 质粒DNA的复制类型 ?严紧型质粒 这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝 ?松弛型质粒 这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。 如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数 穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子
基因工程期末复习资料
一、基因工程的三大关键要素（元件） 基因：目的基因（Vs用途,interesting/targetgene）、外源基因（Vs宿主,foreigngene） 载体：能将外源基因带入受体细胞，并能维持的DNA分子。 受体：宿主，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体） 二、基因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部 分组成，基本过程如下： (1)从供体细胞分离出基因组dna。用限制性核酸内切酶分别将外源dNA(包括外 源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)： (2)用dna连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成dna重组分 子(简称“接”)。 (3)借助细胞转化手段将DNA重组分子导人受体细胞中(简称转”)。 (4)短时间培养转化细胞．以扩增dna重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中 (简称增”)。 （5）筛选和鉴定经转化处理的细胞。获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检） 由此此可见．基因工程的上游操作过程可 简化为；切、接、转、增、检： 三、质粒载体pBR322系列有哪些特征？ BR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面： 第一，具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分子为4363bp。 第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA的插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15），可以有效的检测重组体质粒。 第三，具较高的拷贝数，通常有大约15个左右的拷贝，在氯霉素存在下，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就为重组DNA的制备提供了极大的方便 四、M13系列载体具有哪些优缺点? 答：M13克隆系统具有很多优点： (1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6～7倍的DNA(插入片段可达40kb)。 (2)可直接产生单链DNA，这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链DNA探针都是十分有用的。 (3)单链DNA和双链DNA都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13克隆系列的不足： (1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越大。 (2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。 五、柯斯质粒载体的特点 1、具有λ噬菌体的特性： （1）重组外源片段后，在体外包装成噬菌体颗粒，可以高效转入寄主细胞——大肠杆菌；
基因工程复习总结
思考题 第二章分子克隆工具酶 1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。 2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。 引起星星活性的因素:甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25 mmol/L），pH 值过高（>8.0），或是加了有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+代替了Mg2+。4.T4 DNA ligase 和 E.coli ligase 有什么异同？
5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？ 连接酶最适的反应温度应是37℃，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16℃间，通常多选用12-16℃ 30分钟到16小时。 6.什么是Klenow酶？有什么作用？ Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3′―5′外切活性不受影响。也称为Klenow片段（Klenow frgment），或 E.coli DNA 聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymeraseⅠlarge fragment）。 它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。 ①补平3′凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。 ②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性 ③通过置换反应对DNA进行末端标记 ④在cDNA克隆中合成第二链 ⑤随机引物标记 ⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA ···7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？ ···8.哪些工具酶可以用于探针标记？ T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。 反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。 第三章分子克隆载体 1.基因工程载体应具备哪些特点？ 能在宿主细胞中独立复制； 有一定的选择标记，易于识别和筛选； 有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源 DNA，而不影响其本身的复制; 最好有较高的拷贝数，便于载体制备。 2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？ 能独立复制的单链或双链DNA; 选择标记基因；
重组DNA技术
重组DNA技术 指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 基因工程 指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程的两个基本特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程的意义： ⑴大规模生产生物活性物质⑵设计、构建生物的新性状甚至新物种⑶分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。 基因工程的基本条件： A核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶。B用于基因克隆的载体：载体的功能及特征、质粒、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒与噬菌粒、人造染色体载体 C用于基因转移的受体菌或细胞：受体细胞应具备的条件、各种基因工程受体的特性、实验室常用的基因工程受体 限制性核酸内切酶的生物功能： 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。 限制性核酸内切酶的类型： 主要特性I 型II 型III 型 限制修饰多功能单功能双功能 蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体 辅助因子ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCC AACN6GTGCCAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割特异性切割24-26bp处 II 型限制性核酸内切酶的基本特性： 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。 II 型限制性核酸内切酶的切割方式： 平头末端5’粘性末端3’粘性末端 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： （1）使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 （2）低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 （3）一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 影响限制性核酸内切酶活性的因素： DNA样品的纯度（B）DNA样品甲基化程度（C)限制性核算内切酶缓冲液性质（D)酶的
基因工程综合练习题
一、单项选择题 1. 生物工程的上游技术是( ) A. 基因工程及分离工程 B. 基因工程及发酵工程 C. 基因工程及酶工程 D. 基因工程及细胞工程 2. 基因工程的单元操作顺序是( ) A. 增，转，检，切，接 B. 切，接，转，增，检 C. 接，转，增，检，切 D. 切，接，增，转，检 3. 下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大?( ) A. 质粒 B. 黏粒 C. 酵母人工染色体(YAC) D. λ噬菌体 E. cDNA 表达载体 4. 同一种质粒DNA以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是() A. OC DNA>SC DNA>L DNA B. SC DNA>L DNA>OC DNA C. L DNA>OC DNA>SC DNA D. SC DNA>OC DNA>L DNA 5. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是( ) A. 修复自身的遗传缺陷 B. 促进自身的基因重组 C. 强化自身的核酸代谢 D. 提高自身的防御能力 6. 基因工程的三大理论基石是（） A. 经典遗传学、细胞生物学、微生物学 B. 分子遗传学、分子生物学、生化工程学 C. 动物学、植物学、微生物学 D. 生物化学、生化工程学、化学工程学 E. 生理学、仿生学、免疫学 7. 基因工程作为一种技术诞生于（） A. 上世纪 50 年代初 B. 上世纪 60 年代初 C. 上世纪 70 年代初 D. 上世纪 80 年代初 E. 上世纪 90 年代初 8. 下述对DNA聚合酶的描述哪些是错误的（）。 A. 具有5’→3’外切酶活性 B. 具有3’→5’外切酶活性 C. 具有5’→3’聚合酶活性 D. 具有3’→5’内切酶活性 9. 下列关于酵母和哺乳动物的陈述错误的是（） A．大多数酵母基因没有内含子，而大多数哺乳动物基因有许多内含子 B．酵母基因组的大部分基因比哺乳动物基因组的大部分基因小 C．大多数酵母蛋白比哺乳动物相应的蛋白小 D．尽管酵母基因比哺乳动物基因小，但大多数酵母蛋白与哺乳动物相应的蛋白大致相同 10. 下列哪一种不是产生星号活性的主要原因？( ) A. 甘油含量过高 B. 反应体系中含有有机溶剂 C. 含有非镁离子的二价阳离子 D. 酶切反应时酶浓度过低 11. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( )外都是正确的。
(整理)BACe克隆.
图位克隆 图位基因克隆原理原自参考文献2 图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年首 先由剑桥大学的Alan coulson 提出[5 ] ,用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI 等。二是开展以下几项工作:1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC 库或YAC) ;4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。（正文来自参考文献1） 细菌人工染色体 细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，长用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。 该质粒主要包括oriS，repE(控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。以BAC为基础克隆的载体成嵌合体的频率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化，已被科学界广泛接受。 人工染色体 英文：artificial chromosome
bac制备方法
bac制备方法 （原创实用版4篇） 《bac制备方法》篇1 BAC（细菌人工染色体）是一种基因载体，可以用于基因克隆和转化。BAC 制备方法主要包括以下步骤： 1. 构建BAC 载体：首先需要构建一个BAC 载体，通常包括一个选择标记、一个表达载体和一个人工染色体。选择标记用于筛选转化的细胞，表达载体用于表达目标基因，人工染色体则是BAC 载体的主要组成部分。 2. 提取基因组DNA：从目标物种中提取基因组DNA，可以使用血液、组织或细胞等样本。提取DNA 后，需要进行质量检测，确保DNA 的质量和纯度。 3. 构建BAC 文库：将提取的基因组DNA 片段化，并将其与BAC 载体连接起来，构建BAC 文库。这一步通常需要使用限制性内切酶和DNA 连接酶等工具。 4. 转化细胞：将BAC 文库转化到受体细胞中，通常使用显微注射技术将BAC 载体注射到细胞中。转化后，需要筛选出成功转化的细胞，并进行扩增和保存。 5. 筛选和鉴定：通过筛选和鉴定，确认BAC 载体是否成功导入目标基因。筛选方法包括PCR、Southern blot 等。 《bac制备方法》篇2 BAC（细菌人工染色体）是一种基因载体，用于携带外源基因并
将其导入细胞中。BAC 制备方法通常包括以下步骤： 1. 构建BAC 载体：首先需要构建一个BAC 载体，通常包括一个选择标记、一个表达盒和一个复制起点等组件。选择标记用于筛选携带外源基因的细胞，表达盒包含外源基因和其所需的启动子和转录因子，复制起点用于在细胞中复制BAC 载体。 2. 获取细菌宿主：通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）作为细 菌宿主。需要选择一种能够承受BAC 载体并包含适当选择标记的菌株。 3. 转化BAC 载体：将BAC 载体通过转化方法引入细菌宿主中。转化方法包括化学法（如钙离子处理）和电击法等。 4. 筛选转化细胞：通过选择标记筛选成功转化BAC 载体的细胞，并进行扩增。 5. 提取BAC 载体：从细菌宿主中提取BAC 载体，通常使用碱裂解法或超声波法等方法。 6. 检测BAC 载体：通过南印迹杂交或荧光定量PCR 等方法检 测BAC 载体中是否包含目标外源基因。 需要注意的是，BAC 制备方法可能因实验目的和条件而有所不同。 《bac制备方法》篇3 BAC（细菌人工染色体）是一种基因载体，用于携带外源基因并将其导入细胞中。BAC 制备方法通常包括以下步骤： 1. 构建BAC 载体：首先需要构建一个BAC 载体，通常包括一个启动子、一个选择标记和一个表达载体。启动子用于启动基因的转
bac载体工作原理
bac载体工作原理 Bac载体是一种广泛应用于基因工程和生物技术领域的工具，它能够有效地将外源基因导入到靶细胞中。它的工作原理主要包括载体构建、转染和基因表达三个步骤。 一、载体构建 载体是一种能够携带外源基因并将其导入到靶细胞中的DNA分子。在构建bac载体时，首先需要选择合适的载体骨架。常见的bac载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。在选择载体骨架时，需要考虑到载体的稳定性、复制能力和基因插入的效率等因素。 需要将目标基因插入到载体DNA分子中。这一步骤常常通过限制性内切酶切割和连接酶连接的方法完成。首先，将载体DNA和目标基因分别进行酶切，生成具有互补末端的DNA片段。然后，利用连接酶将目标基因与载体连接起来，形成重组DNA分子。最后，将重组DNA分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，得到含有目标基因的bac载体。 二、转染 转染是指将构建好的bac载体导入到靶细胞中的过程。常见的转染方法包括热激冲击法、电穿孔法和病毒介导转染等。这些方法都可以有效地将bac载体导入到靶细胞中，实现基因的传递。
在转染过程中，首先需要选择适合的转染方法。不同的转染方法有不同的优缺点，需要根据实验需求选择合适的方法。其次，将构建好的bac载体与靶细胞进行共培养或注射，使其发生接触和交互作用。最后，通过合适的培养条件和筛选方法，筛选出含有目标基因的转染细胞。 三、基因表达 基因表达是指在转染细胞中使目标基因得到表达的过程。在bac载体中，通常会引入启动子和选择性标记基因等元件来调控基因的表达。启动子可以使基因在特定的时间和空间表达，而选择性标记基因则可以通过筛选方法来选择表达了目标基因的细胞。 在基因表达过程中，首先需要确定适合的培养条件，包括培养基的配方、温度和气氛等。其次，需要选择适当的检测方法来验证基因的表达情况。常用的检测方法包括荧光显微镜观察、Western blotting和实时定量PCR等。最后，可以根据实验需求对基因表达进行进一步的研究和分析。 总结起来，bac载体的工作原理主要包括载体构建、转染和基因表达三个步骤。通过合理地构建和选择载体，选择适合的转染方法，以及调控基因的表达，我们可以有效地实现外源基因的导入和表达，为基因工程和生物技术的研究提供了重要的工具和平台。
2022-2023年生物技术期末复习-基因工程原理(生物技术)考试精选专练V(带答案)试卷号;5
2022-2023年生物技术期末复习-基因工程原理（生物技术）考试精选专练V（带答案） 一.综合考核题库(共35题) 1. 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因？ 正确答案:可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。 2. ________________是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶。 正确答案:TaqDNA聚合酶 3. 基因重组的载体必须具备下列哪些特点： A、本身是一个复制单位，能在受体细胞中复制 B、插入外源DNA后也不影响自身的复制 C、易于进入受体细胞 D、通过自身的酶系在受体细胞中复制 E、通常带有抗性基因，易于筛选和鉴定 正确答案:A,B,C,E 4. __________通常是指通过基因工程、抗体工程、细胞工程技术等制备生物药品用于疾病诊断、预防和治疗的行业。 正确答案:生物制药 5. _________是指编码产物能够被快速测定，常用来判断外源基因是否已经成功导入寄主细胞并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 正确答案:报告基因
______________也叫做依赖于RNA的DNA聚合酶或RNA指导的DNA聚合酶。 正确答案:逆转录酶 7. 在微生物遗传学和分子遗传学研究领域中的技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用，这三大发明是下列哪些 A、利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA片段 B、遗传密码子的破译 C、质粒改造成载体以携带DNA片段克隆 D、逆转录酶的使用 E、明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制 正确答案:A,C,D 8. 构建GST蛋白表达系统的载体是为了使目标蛋白以哪种方式表达? A、融合表达 B、分泌表达 C、独立表达 D、包涵体表达 正确答案:A 9. 克隆基因目的蛋白的表达形式主要有哪些类型？ 正确答案:表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白。 10. ______________是应用最广也是研究最深入的DNA聚合酶。 正确答案:大肠杆菌DNA聚合酶I 11. 欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题？正确答案:应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。
基因工程
名词解释： 1.启动子：启动子（promoter）是基因表达调控的重要顺式元件，是DNA链一段能被RNA聚合酶识别和结合并 能起始mRNA合成的DNA序列，位于结构基因转录起始点上游。 2.基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通 过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。 3.表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，使目的基因能够表达的载体。 4.转化：DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程。 5.插入失活：外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征。 6.YAC：酵母人工染色体，是进行大片段克隆的线状载体。 7.退火：当温度突然降低时，反应体系中寡核苷酸引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 8.cDNA文库：是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌 形成的重组DNA克隆群。 9.MCS：多个限制酶的单一切点，即多克隆位点。 10.同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同 尾酶。 11.COS质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有λDNA cos序列和质粒复制子特殊类型的载体。 12穿梭载体：是指能在两种不同的生物中复制的载体。 13.Ti 载体：利用土壤根癌农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞的质粒构建成的载体。 14.基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。 15.融合型表达蛋白：蛋白质的N未端由原核DNA 序列或其他DNA 序列编码，C端由真核DNA 的完整序列 编码，蛋白质由一条短的原核多肽或具其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称融 合蛋白。 16.反转录酶：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 17.末端转移酶：一种能将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DNA片段上3′-OH基上的酶。 18.碱性磷酸酶：催化有机单磷酸酯水解为磷酸和甘油的非特异性酶。 19.Sl核酸酶：来源于稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，催化降解单链DNA或单链RNA，产生以 5′-磷酸基末端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。 20.平台效应：由于循环次数增加，引物、dNTPs被消耗，酶活性下降，退火时模板互补链间的复性也逐渐增
锅炉检验员试题和答案
一．判断 1.《特种设备安全监察条例》规定，特种设备检验检测机构，应当接受特种设备安全监督管理部门依法进行的特种设备安全监察。（√） 2. 《中华人民共和国进出口锅炉压力容器监督管理办法（试行）》中规定：凡列入国家商检局制定的《商检机构实施检验的商品种类表》的进出口锅炉、压力容器，都必须经过商检机构和省级锅炉压力容器安全监察机构的监督检验。（√） 3.按照《中华人民共和国进出口锅炉压力容器监督管理办法（试行）》的规定，进口锅炉、压力容器经安全性能检验不合格者，可由授权检验单位直接向外商提出索赔要求。（×） 4.《特种设备检验检测机构管理规定》仅适用于从事《特种设备安全监察条例》规定的特种设备检验检测活动的检验检测机构的监督管理，不适用于从事其他相关法规、规章规定的特种设备检验检测活动的检验检测机构的监督管理。（×） 5. 《特种设备检验检测机构管理规定》规定，特种设备使用单位的检验机构，不能如期完成本单位经核准的特定范围的检验检测工作时，该检验机构应将检验检测工作转包给其他检验检测机构。（×） 6.《锅炉压力容器压力管道及特种设备检验人员资格考核准则》中规定：只有受聘于经国家质量技术监督局锅炉压力容器安全监察机构 注册的检验单位的符合相应条件的人 注 员，才能申报锅炉检验资格。（√） 注：现为国家质量技术监督检验检疫总局特种设备安全监察局。 7.按照《锅炉压力容器压力管道及特种设备检验人员资格考核规则》的规定，锅炉检验员（GL）可以从事额定蒸汽压力≤的蒸汽锅炉、热水锅炉、有机热载体炉的定期检验、监督检验和进出口安全性能检验。（×） 8.《蒸汽锅炉安全技术监察规程》中规定：锅炉出厂技术文件必须包括热力计算书。（×） 9.按照《蒸汽锅炉安全技术监察规程》规定，锅炉结构设计应确保锅炉运行时各个部件能自由膨胀。（×） 10. 《蒸汽锅炉安全技术监察规程》规定，外径108mm的锅炉下降管采用插入式结构与集箱连接时，可不开坡口。（√） 11. 《蒸汽锅炉安全技术监察规程》中规定：焊接环境温度低于0°C时，没有预热措施，不得焊接受压元件。（√） 12. 《蒸汽锅炉安全技术监察规程》中规定，不同厚度的钢板对接但不需削薄时，在测量实际边缘偏差时，不计入两板厚度差。（×） 13.按照《蒸汽锅炉安全技术监察规程》的规定，锅炉产品焊接接头冲击试验不合格，应再取原试样数量的双倍重新试验。（×） 14. 按照《蒸汽锅炉安全技术监察规程》的规定，对于采用胀接的锅壳锅炉，直接与火焰（烟温800°C以上）接触的烟管管端必须进行90°扳边。（√） 15. 《蒸汽锅炉安全技术监察规程》规定，几台锅炉排污合用一根总排污管时，应采用两台或两台以上的锅炉同时排污的方式进行锅炉的排污。（×） 16. 《蒸汽锅炉安全技术监察规程》中规定：检验人员进入锅筒、炉膛、烟道前，必须切断与邻近连接的烟、风、水、汽的管路。（√） 17.《热水锅炉安全技术监察规程》中规定：用焊接方法对锅炉受压元件的修理可采用贴补的焊接方法。（×）
基因工程选择题
1 2.限制性内切酶一般保存在（50%）浓度的甘油溶液中。 3. 4.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显著区别在于（ A ） 5. 6. A. 前者是物理图谱后者是连锁图 7. 8.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） C. 只能作用于双链DNA 9. 10.已知某一内切酶在一个环状DNA 上有 4 个切点，当用此酶切割该环状DNA ，可以得到（ 4 ） 个片段 11. 12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办 法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（5% ）以下 13. 14.在下列进行DNA 部分酶切的条件中，控制哪一项最好（ D ） D.酶量 15. 16.DNA 被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C ） A. 蛋白质（如BSA）同DNA 结合 B.有外切核酸酶污染 C.酶失活 D.酶切条件不 适合 8.nick切口与gap 缺口的区别在于（A ） A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA 的单链中有较小的缺失 9.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（ A ） A. B.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） 10.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（ A ） A.识别相同序列的限制酶称同裂酶 B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C.同裂酶的切割位点一定相同 D.同裂酶的切割位点不相同 11.下列哪一种酶作用时需要引物（B ） A. 末端转移酶 B.反转录酶 C.DNA 连接酶 D.限制酶 12. 13.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（ C ）不恰当 A.由作用于同一DNA 序列的两种酶构成