(整理)限制酶应用
限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。
例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端）：限制酶1：——↓GATC——；限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——；限制酶4：——CCGC↓GG——；限制酶5：——↓CCAGG——。请指出下列哪组表达正确（）
A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对
B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同
解析：限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割产生的黏性末端是:—C T A G，故D错。答案 C
酶工程发展概况及应用前景
酶工程发展概况及应用前景 【摘要】酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。其主要任务是通过预先设计,经人工操作而获得大量所需的酶,并利用各种方法使酶发挥其最大的催化功能。本文意在阐述近年来酶工程在分子水平的研究进展,展示酶工程在医药、农业、食品、环境保护等领域的应用进展,并对其未来前景进行了展望。 【关键词】酶工程；概况；应用；前景 酶工程，从定义上来说，是酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。简而言之，酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶的反应器等方面内容。 酶工程的前景 酶因其反应的专一性，高效性和温和性的特点，已和生物工程，信息科学和材料科学构成了当今的三大前沿科学。而作为生物工程的重要组成部分，将在未来的发展中，在世界科技和经济发展中起着主导和支柱作用。而工业用酶日益广泛地应用于化学，医药，纺织，农业，日化，食品，能源，化妆品以及环保等行业。据报道，到2003年，欧洲工业用酶的市场增加至9亿美元，年增长率达百分之十；而2000年的中国，酶制剂总产量达272吨，同比增长8.8%，可谓发展迅速，前景十分广阔。 酶工程的发展 酶工程的发展，是一部科学的成长史。在二次世界大战后,酶工程发展成为新的工业领域—酶工程工业。酶工程的发展历史从那时算起, 至今已经三十多个年头了。六十年代以后, 由于固定化酶、固定化细胞及固定化活细胞的崛起, 使酶制剂的应用技术面貌一新。七十年代以后，伴随着第二代酶——固定化酶及其相关技术的产生，酶工程才算真正登上了历史舞台。固定化酶正日益成为工业生产的主力军，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大的作用。几十年来酶制剂的品种和应用不断扩大。不仅如此，还产生了威力更大的第三代酶，它是包括辅助因子再生系统在内的固定化多酶系统，它正在成为酶工程应用的主角。近年来, 国际上酶工程技术发展迅速, 硕果累累,主要有基因工程、蛋白质工程、人工合成酶、模拟酶、核酸酶、抗体酶、酶的定向固定化技术、酶化学技术、非水酶学、糖生物学、糖基转移酶、极端环境微生物和不可培养微生物的新品种等。 酶工程的应用 酶工程的发展日新月异，现举几个例子更加形象地说明酶工程地应用： 酶工程在污染处理中的作用：可利用过氧化物酶和聚酚氧化酶处理含酚废水和造纸废水，如辣根过氧化物酶，木质素过氧化物酶，植物来源的过氧化物酶；酪氨酸酶，漆酶等；可利用氰化物酶和氰化物水合酶处理含氰废水；利用蛋白酶，淀粉酶处理食品加工废水；并且，可以通过设计复合代谢途径，拓宽氧化酶的专一性等基因工程的运用，提高微生物的降解速率;拓宽底物的专一性;维持低浓度下的代谢活性;改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性等。酶在废物处理及资源化过程中正在发挥重要作用, 利用基因工程和蛋白质工程扩展酶的代谢途经, 是治理难降解有毒污染物的重要方法。
酶切注意事项
酶切 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。 DNA酶切及凝胶电泳 一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一
常用限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点
BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点
BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点
《酶工程》期末复习题整理#(精选.)
第一章 1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。 4.酶工程的组成部分？ 答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？ 答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。 6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 7.酶作用机制有哪几种学说？ 答：锁和钥匙模型、诱导契合模型 8.酶催化活力的影响因素？ 答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。 9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？ 答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周 蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。 （二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法
酶工程的应用及发展前景.
酶工程的应用及发展前景 生物技术一班 41208220 杨青青
酶工程的应用及发展前景 杨青青 （陕西师范大学生命科学学院生物技术专业1201班） 摘要：酶工程是现代生物技术的重要组成部分，它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。本文概要介绍了酶工程的概念，酶工程在农产品加工、医药工业、食品工业、污染治理工业、蛋白质高值化加工等方面的应用以及探讨了在各个工业中的发展前景。 关键词：酶工程、应用、发展前景 一、酶工程的概念 酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定的促成某个化学反应而本身却不参加反应，且具有反应率高、反应条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点。这些特点比传统的化学反应具有较大的优越性。酶的应用不仅可以增强产量，提高质量，降低原材料和能源消耗，改善劳动条件，降低成本，而且可以生产出用其他方法难得到的产品，促进新产品、新技术和新工艺迅速发展。随着现代生物技术的兴起，酶工程技术应运而生，并在制药、食品工业和农产品加工显示出强大的生命力。酶工程就是利用酶催化作用，
通过适当的反应器工业化的生产人类所需的产品或是达到某一目的，它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。酶工程包括自然酶的开发和利用、固定化酶、固定化细胞、多酶反应器（生物反应器）、酶传感器等。 二、酶工程的应用以及发展前景 1、酶工程在农产品加工上的应用与前景 以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。随着研究的发现，蛋白质经消化道中的酶水解后，主要以小肽的形式被吸收，比完全游离的氨基酸更易吸收利用。这一发现启发了科研工作者采用酶工程技术用蛋白质生产生物活性肽的新思路。生物活性肽是蛋白质中20种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能。主要是通过酶法降解蛋白质而制得。 目前已经从大豆蛋白、玉米蛋白、牛奶蛋白、水产蛋白的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。因为各类蛋白质存在的差异性，所以在生产活性肽方面有略微的不同。不论哪种方法，都会用到一定的酶类水解蛋白质。比如：文献报道采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解大豆蛋白，配合活性炭的吸附处理、超滤、真空浓缩和喷雾干
双酶切连接反应常见问题分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
限制性内切酶酶切位点_方便搜索
GACGTC CTGCAG Acc65I 识别位点 GTMKAC CAKMTG AccI 识别位点 GTMKAC CAKMTG AciI 识别位点 CCGC GGCG AclI 识别位点 AACGTT TTGCAA AcuI 识别位点 CTGAAG GACTTC AfeI 识别位点 AGCGCT TCGCGA CTTAAG GAATTC AflIII 识别位点 ACRYGT TGYRCA AgeI 识别位点 ACCGGT TGGCCA AhdI 识别位点 GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAG AleI 识别位点 CACNNNNGTG GTGNNNNCAC AluI 识别位点 AGCT TCGA AlwI 识别位点 GGATC CCTAG
CAGNNNCTG GTCNNNGAC ApaI 识别位点 GGGCCC CCCGGG ApaLI 识别位点 GTGCAC CACGTG ApeKI 识别位点 GCWGC CGWCG ApoI 识别位点 RAATTY YTTAAR AscI 识别位点 GGCGCGCC CCGCGCGG AseI 识别位点 ATTAAT TAATTA GCGATCGC CGCTAGCG AvaI 识别位点 CYCGRG GRGCYC AvaII 识别位点 GGWCC CCWGG AvrII 识别位点 CCTAGG GGATCC BaeI 识别位点 NACNGTAYCN BamHI 识别位点 GGATCC CCTAGG BanI 识别位点 GGYRCC CCRYGG
酶工程 试题及答案
共三套 《酶工程》试题一： 一、是非题（每题1分，共10分） 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。（） 2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性。（） 3、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（） 4、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。（） 5、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。（） 6、膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。（） 7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。（） 8、角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。（） 9、α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。（） 10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。（） 二、填空题（每空1分，共28分） 1、日本称为“酵素”的东西，中文称为__________,英文则为__________,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其实它存在于生物体的__________与__________。 2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__________酶结晶，并指出__________是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。
3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为__________,高产液化酶优良菌株菌号为___________。在微生物分类上，前者属于__________菌，后者属于__________菌。 4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、__________基因和__________基因。 5、1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）__________,催化__________的底物转化为产物的__________为一个国际单位，即1IU。 6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的__________、减少__________，增加__________。 7、酶的生产方法有___________，___________和____________。 8、借助__________使__________发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 9、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有__________法，__________法和__________法三种。 10、由于各种分子形成结晶条件的不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是__________，也是__________。 三、名词术语的解释与区别（每组6分，共30分） 1、酶生物合成中的转录与翻译 2、诱导与阻遏 3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比） 4、酶的变性与酶的失活
酶工程的发展状况及其应用前景
酶工程的发展状况及其应用前景 摘要：酶在现代生物生产中扮演着重要角色，酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，以及酶工程不断的技术性突破，使得酶在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。 关键词：酶工程生物催化剂酶的固定 正文： 随着酶生产的不断发展，酶的应用越来越广泛。现在，酶工程已在医药、食品工业、农业、饲料、环保、能源、科研等领域广泛应用。成为基因工程、细胞工程、蛋白质工程等新技术领域的科学研究和技术开发中不可取代的工具。 一、酶工程的发展及应用现状 （一）国内外酶制剂的发展现状 BCC最新研究报告显示，未来4年全球工业酶制剂市场价值将以％的复合年增长率继续增长，由2011年的39亿美元增加至2016年的约61亿美元。该报告将工业酶市场细分成3个部分：生物酶、食品和饮料酶以及其他酶制剂。2011年生物酶的市场价值达12亿美元，预计还将以％的复合年增长率继续增长，2016年达17亿美元。2011年食品和饮料活性酶的市场价值接近13亿美元，未来4年还将以％的年均复合增长率增长，预计2016年达21亿美元。2011年其他酶制剂的市场价值为15亿美元，预计还将以％的复合年增长率增长，到2016年市场价值将达到22亿美元①。 我国酶制剂工业面经过近几十年的发展，初步具有一定的规模，取得了很大的进步。但是，国外酶制剂公司仍然处于绝对的领先地位，特别是一些比较出色的公司，例如，诺和诺德公司（Novo Nordisk）、丹尼斯克公司（Danisco）等②。 （二）酶工程的应用现状 一、酶工程技术在医药工业中的应用 1、酶的固定化技术 酶的固定化(enzyme immobilization)是指采用有机或无机固体材料作为载体(carrierorsupport)，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。不使用固体材料作为载体，通过酶分子之间的相互交联形成聚集体，也可将酶固定化，称为无载体酶固定化。由于酶的蛋白质属性，进人人体后产生免疫反应，因稀释效应，而无法集中于靶器官组织，常不能保持最适合的治疗浓度，而固定化酶则很好的克服了游离酶的这些缺点，应用于治疗镁缺乏症、代谢异常症及制造人工内脏方面，如固定化L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。葡萄糖氧化酶被固定化在纳米微带金电极上可用于活体检测的微生物传感器③。 固定化酶技术可用于治疗一些代谢障碍疾病。已知人类关于新陈代谢的疾病已过120余种，很多病因归结为人体缺乏某种酶的活性，一种可能的治疗方法就是通过某种方式给病人提供他所缺乏的酶。其提供的方式主要有：①将固定化酶用于体内作为治疗药物；②将固定化酶组装成体外生物反应器，通过体外循环作为临床治疗剂。将固定化酶用于临床诊断的例子很多，如各种酶测试盒层出不穷，采用固定化酶柱反应器的FIA(流动注射法)可用于临床诊断检测尿酸、葡萄糖、氨、尿素、胆甾醇、谷氨酸、乳酸、无机磷等。 2、酶催化技术 主要介绍非水相介质中的酶催化，传统的酶催化反应主要在水相中进行，但自1987年Kilibanov等。用脂肪酶粉或固定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽以及手性的醇、脂和酰胺以来，对酶在非水相介质的催化反应技术的开发及研究报道迅速增加，特别在手性药物的不对称合成及手性药物拆分的生物技术开发中得到了很多应用。目前非水相中的酶催化技术已衍生出以下几类体系：①水与有机溶剂的互溶均相体系；②水与有机溶剂形
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007） 1、目的及适用范围 利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。 2、主要试剂及仪器 微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer 3、操作步骤 按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。 反应物体积（μL） 灭菌水3 DNA40 10× Buffer K 5 EcoR I1 BamH I1 总体积50 4、问题向导 4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 21
常用限制性内切酶酶切位点
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点
BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
酶工程各章试题
酶工程各章试题 酶工程第一章测试试题卷 一填空（每空1分,共20分） 1.1878年, ___ 首次将酵母中酒精发酵的物质称为酶? 2.1913年,Michaelis 和Menten根据中间产物学说,推导出酶催化反应的基 本动力学方程----米氏方程,可用公式表示为 _______ . 3.1982年Thomas Cech等人发现四膜虫的rRNA可以在没有蛋白质存在的 情况下自身催化切除内含子，完成加工过程?这一具有催化活性的RNA的发现改变了传统的酶的化学本质是_______________ 的概念。 4.对同一种酶可同时采用系统命名和______ 名两种方法. 5.乳酸脱氢酶可标识为[EC1.1.1.2],其中EC代表___________ . 6.催化L-谷氨酸D —谷氨酸的酶属于____________ 酶. 7.核酸类酶的基本组成单位是___________ . 8.酶的有机辅助因子在催化过程中起_________________ ■勺作用. 9.在酶的二级结构B—片状折叠中, __________ 式结构更稳定. 10.酶的绝对专一性又称为____________ 一性. 11.PH对酶的影响主要是影响到了氨基酸的_________ 状态. 12.在测酶活力时，为了使酶反应速度不受底物浓度底限制，反应系统应使用足 够高的底物浓度,一般要求: ___________ . 13.酶分离纯化整个工作包括三个基本环节：抽取纯化和____________ . 14.工业应用的三大酶制剂是蛋白酶__________ 和脂肪酶. 15核酸类酶催化反应的类型,可以将R-酶分为三类：剪切酶,剪接酶和____________ 酶. 16、具有不同分子形式但却催化相同反应的酶称为 ___________ . 17、每毫克蛋白或RNA中所具有的酶活力数称为酶的_______ .用u/mg表示. 18、酶制剂可分为液体酶制剂,固体酶制剂,纯酶制剂和_________ 酶制剂. 二. 选择题（每题2分,共10分）
酶工程在现实方面的应用
酶工程在现实生活的应用 学院：生命科学与食品工程学院 姓名：沈峰学号：5602209078 班级：生工092 摘要：酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通 过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。酶工程技术与我们生活息息相关，比如酿酒，制药工业等等。 Abstract:The enzyme is a specific protein, RNA or its complex which is used to catalytic specific chemical reaction.it's biological catalyst .It can accelerate reaction velocity by reduce the activation energy of reaction ,without changing the point of balance. The vast majority of enzyme's chemical nature is protein.so it have lots of Characteristics as high catalytic efficiency, high specificity, mild conditions and so on.The enzyme engineering is closely linked with our life ,for example,making wine pharmaceutical industry and so on. 关键字：酶工程酶啤酒制药 酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。 如果要了解酶工程在现实生活方面的应用的话，首先先要知道什么是酶，什么是酶工程，和哪些酶可以在起作用及酶的特性有哪些。 首先酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。目前已发现有2000 多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，它能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶的种类众多，而在酿酒等工业方面方面应用的酶也不少。比如，曲霉，根霉，红曲霉，拟内孢霉，木霉，青霉，等等。所以没对于现实生活有着广而深的影响，对于酶的特性的了解也就十分必要。 酶工程：酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。 酶的特性主要四点：1、酶具有高效率的催化能力；其效率是一般无机催化剂的10的7次幂~~10的13次幂。2、酶具有专一性；（每一种酶只能催化一种或一类化学反应。）3、酶在生物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数量都不会发生改变(与催化剂相似)；4、酶的作用条件较温和。 一酶工程在酿酒制造业的作用 总所周知，现实生活中的许多家庭每天都或多或少会在酒的方面消费，还有社交
(完整版)酶练习题及参考答案
－－第三章酶测试题－－ 一、单项选择题（在备选答案中只有一个是正确的） 1．关于酶的叙述哪项是正确的？ A．所有的酶都含有辅基或辅酶B．只能在体内起催化作用C．大多数酶的化学本质是蛋白质 D．能改变化学反应的平衡点加速反应的进行E．都具有立体异构专一性（特异性） 2．酶原所以没有活性是因为： A．酶蛋白肽链合成不完全B．活性中心未形成或未暴露C．酶原是普通的蛋白质 D．缺乏辅酶或辅基E．是已经变性的蛋白质 3．磺胺类药物的类似物是： A．四氢叶酸B．二氢叶酸C．对氨基苯甲酸D．叶酸E．嘧啶 4．关于酶活性中心的叙述，哪项不正确？ A．酶与底物接触只限于酶分子上与酶活性密切有关的较小区域B．必需基团可位于活性中心之内，也可位于活性中心之外C．一般来说，总是多肽链的一级结构上相邻的几个氨基酸的残基相对集中，形成酶的活性中心D．酶原激活实际上就是完整的活性中心形成的过程E．当底物分子与酶分子相接触时，可引起酶活性中心的构象改变 5．辅酶NADP+分子中含有哪种B族维生素？ A．磷酸吡哆醛B．核黄素C．叶酸D．尼克酰胺E．硫胺素
6．下列关于酶蛋白和辅助因子的叙述，哪一点不正确？ A．酶蛋白或辅助因子单独存在时均无催化作用B．一种酶蛋白只与一种辅助因子结合成一种全酶C．一种辅助因子只能与一种酶蛋白结合成一种全酶D．酶蛋白决定结合酶蛋白反应的专一性E．辅助因子直接参加反应 7．如果有一酶促反应其〔8〕=1/2Km，则v值应等于多少Vmax？ A．0．25 B．0．33 C．0．50 D．0．67 E．0．75 8．有机磷杀虫剂对胆碱酯酶的抑制作用属于： A．可逆性抑制作用B．竞争性抑制作用C．非竞争性抑制作用D．反竞争性抑制作用E．不可逆性抑制作用 9．关于pH对酶活性的影响，以下哪项不对？ A．影响必需基团解离状态B．也能影响底物的解离状态C．酶在一定的pH范围内发挥最高活性D．破坏酶蛋白的一级结构E．pH改变能影响酶的Km值10．丙二酸对于琥珀酸脱氢酶的影响属于： A．反馈抑制B．底物抑制C．竞争性抑制D．非竞争性抑制E．变构调节二、多项选择题（在备选答案中有二个或二个以上是正确的，错选或未选全的均不给分） 1．关于酶的竞争性抑制作用的说法哪些是正确的？ A．抑制剂结构一般与底物结构相似B．Vm不变C．增加底物浓度可减弱抑制剂的影响D．使Km值增大 2．关于酶的非竞争性抑制作用的说法哪些是正确的？ A．增加底物浓度能减少抑制剂的影响B．Vm降低C．抑制剂结构与底物无相似之处D．Km值不变
常见分子实验限制性内切酶酶切位点大全
Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点
BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点
哈工大酶工程试题(A)答案
酶工程试题(A) 年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？ 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？ 4.
酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 1.Km值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求？ 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？ 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。 （A）答案及评分细则 一 1. 酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
酶工程试题及答案
一、名词解释（本题共8个小题，每小题2分，共16分）。 1、固定化酶： 2、原生质体： 3、超滤： 4、酶的催化特性： 5、生物酶工程： 6、酶的必需基团和活性中心： 7、诱导与阻遏： 8、酶反应器： 二、填空题（本题共5个小题，每空2分，共24分）. 1、酶的分类（）（）（）。（三种即可） 2、酶活力是（）的量度指标，酶的比活力是（）的量度指标，酶转换数是（）的量度指标。 3、微生物产酶模式可以分为同步合成型，（）中期合成型，（）四种。 4、酶的生产方法有（），生物合成法和化学合成法。 5、优良的产酶微生物所具备的条件：（1）（）（2）（）（3）（）（写出三种即可）。 三、判断题（本题共10个小题，每空1.5分，共15分）。 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。 2、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。 3、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 4、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。 5、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。 6、补料是指在发酵过程中补充添加一定量的营养物质，补料的时间一般以发酵前期为好。 7、酶固定化过程中，固定化的载体应是疏水的。 8、在酶的抽提过程，抽提液的 pH 应接近酶蛋白的等电点。 9、青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。 10、亲和试剂又称活性部位指示试剂,这类修饰剂的结构类似于底物结构。 四、问答题（本题共5个小题，共45分）。 1、试述提高酶发酵产量的措施。（8 分，答出四点即可） 2、酶失活的因素？（8分） 3、酶的提取方法有哪些？（8分） 4、酶分子修饰的意义有哪些？（6分） 5、试简述酶分子的定向进化。（5分） 6、固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？（10分，优缺点答五点即可） 答案 一、1、固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶；2、原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞；3、超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；4、酶的催化特性：①极高的催化效率②高度的专一性③酶活性的可调节性④酶的不稳定性5、生物酶工程：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等；6、酶的必需基团：指酶分子中与酶的活性密切相关的基团；活性中心：是与底物结合并催化反应的场所；7、酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程；酶合成
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。