第五章 酶
第五章酶 (Enzyme)
主要内容：介绍酶的概念、作用特点和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶专一性及高效催化的策略，进而讨论影响酶作用的主要因素。对酶工程和酶的应用作一般介绍。思考题？
第一节酶的概念及作用特点
第二节酶的命名和分类
第三节酶活力测定和分离纯化
第四节酶催化作用的结构基础和
高效催化的策略
第五节酶促反应的动力学
第六节重要的酶类及酶活性的调控
第七节酶工程简介
目录
第一节酶概念及作用特点
一、酶的概念
二、酶催化作用的特点
三、酶的化学本质、酶的类别和组成
酶
是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸；是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
酶催化作用的特点
酶具有一般催化剂的特征：
用量少而催化效率高；不改变化学反应的平衡点；可降低反应的活化能。
酶作为生物催化剂的特点
极高的催化效率
高度的专一性
易失活
活性可调控
有些酶需辅助因子
酶作为生物催化剂的特点
1、催化效率很高：
比较Fe3+和H2O2酶同样条件下的催化效果：
1mol/L H2O2酶 104M
1mol/L Fe3+ 10-6M
酶促反应比非催化反应高10-1020倍；
比一般催化反应高107-1013倍。
酶能够显著降低反应的活化能
活化能(Activation energy)：在一定温度下1mol 底物全部进入活化态所需要的自由能。
0℃，分解H2O2量
2、酶具有高度专一性
是指酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。一种酶只能催化一种或一类十分相似的反应。底物（substrate ，S)：酶作用的物质。
酶专一性类别（P332）
酶专一性类型（ p332）
1 、结构专一性
概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择。
类别：绝对专一性和相对专一性
2 、立体异构专一性
概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求
类别：旋光异构专一性和几何异构专一性
绝对专一性和相对专一性
绝对专一性有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。
相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。
1）键专一性有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。
2）基团专一性另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严
格。
消化道内几种蛋白酶的专一性
（苯丙.酪.色-COOH）
（精.赖-COOH）
（脂肪族）
胰凝乳蛋白酶
胃蛋白酶
弹性蛋白酶
羧肽酶
胰蛋白酶
糜蛋白酶
羧肽酶
3、酶易失活：
凡使pr变性的因素都可使酶破坏,
酶在温和条件下作用。
4、酶活性受到调节和控制：
（1）调节酶浓度
（2）通过激素调节酶的活性
（3）反馈抑制调节酶活性
（4）抑制剂或激活剂对酶活性的调节
（5）其它方式别构调控
酶原激活
共价修饰
酶的化学本质
历史 1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。
1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。
核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。
据酶分子组成分类
单纯蛋白质酶类
结合蛋白质酶类
酶蛋白质
辅助因子
金属离子
金属有机物
小分子有机物
据酶蛋白特征分类
单体酶
寡聚酶
多酶复合体
酶的类别
单体酶、寡聚酶和多酶复合
1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。
2.寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基可以相同也可以不同，亚基之间以非共价键结合。
3.多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶靠非共价键镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
多酶复合体示意图
酶的化学组成
酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅因子
辅酶
：与酶蛋白结合的比较松的小分子有机物。
辅基
：与酶蛋白结合的紧密的小分子有机物。
金属激活剂
：金属离子作为辅助因子。
酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
单纯酶除了蛋白质外，不含有其它的物质
如淀粉酶、脲酶、蛋白酶等。
缀合酶
第二节酶的命名和分类
1、习惯命名
2、国际系统命名法
3、国际系统分类法及酶的编号
1、习惯命名：
根据酶的底物命名：如：淀粉酶、蛋白酶；
根据酶所催化的反应性质命名：如：转氨酶；
综合上述两原则命名：如：乳酸脱氢酶；
上述命名加酶来源或酶的其它特点：胃蛋白酶、碱性磷酸酶。
2、国际系统命名法
以酶所催化的整体反应为基础，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种
酶催化两个底物起反应，应在他们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“:”将他们隔开，若底物中有水可以略去不写。
惯用名系统名
谷丙转氨酶丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶
催化反应： Ala+α-酮戊二酸→ Glu+丙酮酸
脂肪酶脂肪水解酶
催化反应：脂肪＋H2O →脂肪酸＋甘油
3.国际系统分类法及酶的编号
1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类，5.异构酶类，6.合成酶类。分别用1、2、3、4、5、6来表示；再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分成若干亚类，又按照1、2、3…..编号；每个亚类又分为亚亚类仍用1、2、3…编号。每个酶分类编号由4个数字组成，数字间用“.”隔开，编号前冠以EC。例如：
（2）氧化酶类
①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：
②催化底物脱氢，氧化生成H2O：
（3）过氧化物酶
A、氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。
（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。
B、转移酶类：催化化合物中某些基团的转移
A·X + B
A +B·X
根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫
基的酶。
C、水解酶类：催化加水分解作用。
AB + H2O
AOH + BH
水解酶类大都属于细胞外酶，在生物体内分布广泛，数量多，包括水解酯键、糖苷键、肽键等共11个亚类，常见的如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
D、裂合酶类：催化从底物移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。
C—C键
+ CO2
C—O键
+ H2O
C—N键
E、异构酶类：催化各种同分异构体之间的互变，即分子内部基团的重新排列。
常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。
F、连接酶类：催化有ATP参加的合成反应，即由两种物质合成一种新物质的反应。
第三节酶活力测定和分离纯化
一、酶活力的测定
1、酶活力
2、酶活力表示方法
3、酶活力的测定方法
二、酶的分离纯化
1. 酶活力（酶活性 enzyme activity):
指酶催化一定化学反应的能力。酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。
2.酶活力表示方法：
（1）酶活力单位（国际单位，IU）：
最适反应条件下（25℃），在1分钟内把1微摩尔底物转化为产物所需要的酶量。
习惯单位（U）:一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的
酶量
Katal（Kat）：最适条件下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为
产物所需的酶量。
（2）酶的比活力：
指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白表示。
3、酶活力的测定方法
通过两种方法可以测定酶的活力
a)测定完成一定量的反应所需要的时间；
b)测单位时间内、单位体积中底物减少或产物增加量来表示浓度/单位时间.
测定酶活力最常用的方法：
终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法（分光光度法、同位素法、荧光法）测定产物或反应物量的变化。
动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。
酶的分离纯化
1、目的：
（1）为了研究酶的理化性质或鉴定酶；
（2）作为生化试剂或药物。
2、步骤：
选材→破碎→抽提→分离纯化→结晶→保存
3、分离纯化的方法
盐析、沉淀、吸附、柱层析、凝胶层析、凝胶电泳等pr提纯的方法都可以用于从粗提液中分离纯化酶。
注意：
低温；0-5℃，有机溶剂在-15至-20℃；
加EDTA，防止金属离子使酶失活；
加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；
不要过度搅拌，应常测酶活。
第四节酶催化作用的结构基础和高效催化的策略
一、酶催化的中间产物理论（p355）
二、酶的活性中心和必须集团(p384)
三、酶作用专一性机理(p334)
四、酶高效催化有关的策略(p388)
酶催化的中间产物理论
酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。
关于酶和底物形成复合物学说的实验证明
（1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构直接
观察到；
（2）许多酶和底物的光谱学特性在形成ES后发生变化；
（3）酶的物理性质在形成ES后发生变化；
（4）已经分离得到某些酶与底物相互作用形成的ES复
合物；
（5）超离心沉降中，观察到酶和底物的共沉降现象。
二、酶的活性中心和必需基团
酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（active center）或活性部位（active site），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。
实例：胰凝乳蛋白酶
1、活性中心的实质
2、活性中心的特点
3、研究活性中心的方法
Asp
His
Ser
胰凝乳蛋白酶的活性中心
活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195
1、活性中心的实质
活性中心即酶分子中在三维结构上相互靠近的几个aa残基或其上的某些基团。
胰凝乳蛋白酶的活性中心
2、活性中心的特点
溶菌酶活性中心
（1）仅为
酶体积的很小部分；
（2）具有一定的空间构象；
（3）S与E靠次级键结合；
（4）酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补；
（5）活性部位是由特定空间构象维持的一个裂隙；
（6）酶的活性部位具有柔性和运动性。
3、研究酶活性中心的方法：
（1）化学修饰法：
差示标记法，亲和标记法
（2）通过研究专一性底物判断确定E活性中
心的结构；
（3）X-衍射直接探明活性中心。
（4）定点诱变法
差示标记法图解
A.非差示标记
B. 差示标记
亲和标记法
根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。
+
三、酶作用专一性机理
锁钥学说(lock and key th0ery)：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。
诱导契合学说(induced-fit hypothesis)：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与
底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。
锁钥学说：1894年E.Fischer 提出：S分子或其一部分
像钥匙一样楔入E活性中心部位。
此学说强调E与S结构互相吻合(刚性模板)，但无法
解释这种结构为何既适合与可逆反应的底物，又适合可
逆反应的产物。
酶专一性的“诱导契合学说”
1958年Koshland
提出：当E与S接近
时，E蛋白受S分子
的诱导，其构象发
生有利于S结合的变
化，E与S在此基础
上互补契合、进行
反应。
四、酶高效催化的策略
1、邻近与定向效应
2、诱导契合与底物扭曲变形
3、酸碱催化
4、共价催化
5、金属离子催化
6、多元催化和协同效应
7、活性部位微环境影响
1、底物和酶的邻近效应与定向效应：
酶和底物形成复合物的过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程，在这一过程中包括两种效应：邻近效应和定向效应。
这两种效应在双分子反应中起的促进作用至少分别可达104倍，两者结合可以使反应速率升高108。
2.底物的形变和诱导契合
X衍射证实：当酶遇到底物时，E使S分子中敏感键中某些基团的电子密度变化，产生电子张力，敏感键的一端更加敏感，使其发生变形，更易于断裂。底物接近于它的过渡态，降低了反应的活化能，反应易于进行。
A：S变形
B：S和E都变形
3. 酸碱催化：
指E分子上某些
基团
作为质子供体和质子
受体以稳定过渡态，
对S进行的酸碱催
化，加速反应的催化
机制。
1、醛的水合作用
2、肽的水解作用
专一酸碱催化
广义酸碱催化
4. 共价催化：
5. 金属离子催化
6、多元催化和协同效应
在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一块起作用。
7、活性部位的微环境的影响
在酶分子表面有一个裂缝，而活性部位就位于疏水环境的裂缝中，当底物与活性部位结合，就被埋没在疏水环境中，大大有利于酶的催化。
第五节酶促反应的动力学（p351）
二、影响酶作用的因素
1、酶浓度
2、底物浓度
3、pH
4、温度
5、激活剂
6、抑制剂
酶促反应动力学是研究酶促反应的速率及影响此速率的各
种因素的科学。
一、化学动力学基础
化学动力学基础
1、反应分子数
即在反应中真正相互作用的分子数目。
大多数反应都是以单分子或双分子反应的步骤进行的，3个分子同时反应的可能性很小，3分子以上的反应还没有发现。
2、反应级数
根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。
1、酶浓度对酶作用的影响
在底物浓度足够大的情况下（酶被饱和），
当[S]>>[E]，V＝K3[E] K3是速度常数
酶促反应速度
酶浓度
2、底物浓度对酶反应速度的影响
?酶反应速度与底物浓度的关系曲线
（Michaelis—Menten曲线）
?米氏方程的提出及推导
?米氏常数和Vmax的意义
?米氏常数的测定
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
酶促反应的米氏方程及Km
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平衡”假说的设想进行推导。
米氏方程:
米氏常数:
Michaelis & Menten根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速率定量关系的公式称～。
稳态：指反应进行一段时间后，系统的ES浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内尽管S和P浓度不断变化，复合物ES也在不断的生成、分解，但是，当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES的浓度保持不变的这种反应状态。
米氏方程的推导
令：
将（4）代入（3），则：
由于酶促反应速度v与[ES]成正比，即
，所以
(2)
将（2）代入（1）得：
米氏方程的变化：
a、当Km＞＞[S] 时：
υ=Vmax [S]/ Km
初速度与[S]成正比的一级反应
b、当[S]＞＞Km 时：
υ=Vmax
零级反应
c、当[S] = Km 时：
υ=1/2Vmax
酶反应速度与[S]的关系
反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度。
Km的单位为浓度单位mol/L 或 mmol/mL
练习题：已知
某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？
Vmax的意义
Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度
Vmax不是酶的特征常数，但是当[E]一定时，而且当
[S]>>[E]假设条件下，对酶的特定底物而言，Vmax是一定的，Vmax＝K3[E]
与Km相同，同种酶对不同底物的Vmax不同
注意
酶促动力学处理时，反应的初速度，即时间趋向零时的速度极限值，时间越短越好。
时间延长速度会变小，原因：
[S]下降的同时，[P]升高，逆反应加快，产物抑制剂及酶的变性失活
实际工作中，总是使反应进行一段足够短时间后，一般应控制底物的消耗在5％以内。米氏常数的测定
基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。
例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
米氏方程的双倒数形式：
1 Km 1 1
— = —— . — + ——
v Vmax [S] Vmax
双倒数作图法
3、pH对酶反应速度的影响
pH
最适 pH
v
植物、微生物最适pH:4-6.5；动物最适pH:6.5-8。
为酶特性之一、受各种因素影响。
?过酸过硷导致酶蛋白变性
?影响S的极性基团，从而影响这些基团与E的结合；
?影响酶分子附近有关基团的解离，使之易或不易与S 结合
?影响酶的活性中心构象
4、温度与酶反应速度的关系
? 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快
酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快
温度达到一定高度（60℃以上）E活性不再增高，反而下降。
v
温度
最适温度
5、激活剂对酶作用的影响
类别
1）无机离子的激活作用：作为活性部位的组分；作为辅助因子的组分.
由无机离子与E、S或ES结合引起。如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+等。
2）中等大小的有机分子：包括还原剂抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽
（使二硫键还原）、金属螯合剂EDTA（去除重金属杂质）等。
3）蛋白质类大分子物质：激活酶原、解除抑制剂的抑制作用。
凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）
抑制作用(inhibition)：
由于酶的必需基团化学性质的改变，而引起的E活性降低或丧失的作用统称为抑制作用。凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor）。
6、抑制剂对酶作用的影响
抑制剂类型和特点
抑制剂类型和特点
竞争性抑制剂
可逆抑制剂非竞争性抑制剂
反竞争性抑制剂
非专一性不可逆抑制剂
不可逆抑制剂
专一性不可逆抑制剂
（1）可逆抑制
I（抑制剂）与E的结合往往是非共价键结合，而引起酶活力的降低或丧失，可用透析法除去I使酶复活。
可逆抑制根据I与S的关系分三类：
竞争性抑制：
非竞争性抑制：
反竞争性抑制：
①竞争性抑制：
I 在分子结构上与S类似， I与S竞争性与E结合，从而影响了底物与酶的结合，使酶促反应速度下降。
若[S]高，则此效应减小。
无抑制剂
加竞争性抑制剂
应用：磺胺药物设计的依据
②非竞争性抑制：
S与I可同时结合在酶的不同部位上，形成ESI，此三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活性降低。
此类 I 与E活性中心以外的基团结合，其结构可能与S无关，所以不能用增加S的浓度来解除抑制。
加菲竞争性抑制剂
无抑制剂
③反竞争性抑制
有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程
增加[S]不可克服
增加[S]可克服
通常I以较牢固的共价键与E蛋白中的基团结合，引起E失活，透析、超滤不能除去I。
又称酶的修饰抑制。
按照不可抑制的选择性不同，可分为：
非专一性不可抑制剂
专一性不可抑制剂
（2）不可逆抑制：
非专一性不可逆抑制剂
抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。有机磷、烷化剂(敌敌畏、敌百虫)：作用于Ser、Thr的-OH；
氰化物：作用于Fe2+ ，抑制细胞呼吸；
重金属盐（汞、砷）：作用于含-SH的酶；
青霉素：丝氨酸羟基共价结合
专一性不可抑制剂可以分为Ks和Kcat型两类
Ks型这类抑制剂是根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应，进行化学修饰，从而抑制酶的活性。又称为亲和标记试剂
Kcat型这类抑制剂不但具有天然底物的类似结构，而且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似底物的变化，但抑制剂还有一个潜伏基团，当酶对它进行催化反应时，潜伏基团被暴露或活化，并作用于酶的活性部位，使酶不可逆失活。又称为自杀性底物。
专一性不可逆抑制剂：这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。
可逆抑制与不可逆抑制的区别（P370）
第六节重要的酶类及酶活性的调节控制(p413)
一、别构酶(allosteric enzyme)
二、酶原(enzymogen或proenzyme)的激活
三、共价调节酶(covalent regulatory enzyme)
四、同
工酶(isoenzyme)
五、核酶（ribozyme）p339
六、抗体酶(abzyme) p343
一、酶的别构（变构）效应和别构酶
?概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(allosteric regulation)，具有这种调节作用的酶
称别构酶(allosteric enzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。
凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positive effector)或别构激活剂(多为S)，反之称负效应物(negative effector)或别构抑制剂（多为代谢终产物）。
别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。
?实例：天冬氨酸转氨甲酰酶（ ATCase ）
酶的别构（变构）效应示意图
别构酶的反馈调控机理
别构酶的结构
别构酶一般为寡聚酶（两个以上亚基组成），易发生构象改变。
1）活性部位：（催化亚基）
负责E对S的结合与催化；
2）别构部位：（调节亚基）
可结合调节物，负责调节酶反应速度。
这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上。
E.coli的ATCase的亚基排列
催化(C)亚基（catalytic subunit）
调节(R)亚基（ regulative subunit）
T态
R态
ATCase
ATCase所催化的反应
氨甲酰磷酸
天冬氨酸
氨甲酰天冬氨酸
二、酶原的激活
体内合成出来的酶，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中心，变成有活性的酶。这个不具活性的蛋白质称为酶原（zymogen或proenzyme），这个过程称为酶原的激活。
该变化过程，是生物体的一种调控机制。这种调控作用的特点是，蛋白质由无活性状态转变成活性状态是不可逆的。
实例：胃蛋白酶原的激活
胰蛋白酶原的激活
凝血机制（自学）
酶原激活的生理意义
胰蛋白酶原
胰蛋白酶
六肽
肠激酶
活性中心
胰蛋白酶原的激活示意图
酶原激活的生理意义
保护和定位作用
消化管内的蛋白酶以酶原的形式分泌，可以保护消化器官本身不被水解；同时保证酶在特定的部位和环境中发挥作用。
酶的储存形式
血液中的凝血酶和纤溶酶以酶原的形式储存在血液循环中，需要时在转变成有活性的酶。
三、酶的共价修饰
某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发
现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。
由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。
四、酶的多种分子形式——同工酶
概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。
生物学功能：?遗传的标志
?和个体发育及组织分化密切相关
?适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要
在各学科中的应用
同工酶在各学科中的应用
(1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。
(2) 发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情
况，以及个体发育和系统发育的关系。
(3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、
底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，
从而解释它们代谢功能的差别。
（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤
，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。
五、核酶
六、抗体酶
抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。
抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子相结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样
产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。
抗体酶
中间产物类似物免疫动物抗体
此抗体具：
1）加快反应速度102-105倍；
2）具酶性质：专一性、催化活性、酶动
力学行为均符合；
抗体酶的研究和应用前景
催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。
目前已经发现具有催
化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。
充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。
抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。
第七节酶工程简介 p344
一、化学酶工程
?天然酶
?固定化酶
?化学修饰酶
?人工模拟酶
二、生物酶工程
?克隆酶
?突变酶
?新酶
将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
一、化学酶工程：
由酶学与化学工程技术相结合而形成。
通过化学修饰、固定化处理、甚至化学合成法等手段改善酶的性质，以提高催化效率及降低成本。
天然酶
固定化酶
化学修饰酶
人工模拟酶
固定化酶
概念：将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学的方法处理，使酶与载体（琼脂糖、聚丙烯
酰胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。
应用：此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使反应过程连续化、自动化，简化工艺；提高产品质量。
此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、环境保护、生物化工等方面。
酶的改造和模拟
酶的改造：功能基团的化学修饰酶
酶蛋白侧链的化学修饰
酶分子内或间的交联反应
酶的模拟：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构较简单,高效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小肽。
二、生物酶工程：
是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。包括：
1）用DNA重组技术大量生产酶；
2）对酶基因进行修饰，产生突变酶；
3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。
生物酶工程示意图
酶的蛋白质结构功能
新酶分子蓝图
选择性修饰方案
突变酶
新酶
克隆酶
产品
效用
发展
酶基因
遗传设计
遗传修饰
DNA重组技术
DNA重组技术
问答题
1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？
2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。
3、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是
什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的99％时，所需求的底物浓度（用Km表示）
4、简述酶催化作用的特点
5、试述使酶具有高效催化效率的因素
6、酶的活性调节方式有哪些
7、什麽是同工酶？同工酶在科学研究和实践中有何应用？
名词解释
活性中心全酶酶原比活力米氏方程 Km 诱导契合变构效应 ribozyme 辅酶和辅基固定化
酶
《酶工程》期末复习题整理#(精选.)
第一章 1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。 4.酶工程的组成部分？ 答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？ 答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。 6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 7.酶作用机制有哪几种学说？ 答：锁和钥匙模型、诱导契合模型 8.酶催化活力的影响因素？ 答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。 9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？ 答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周 蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。 （二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法
第五章 酶
第五章酶 (Enzyme) 主要内容：介绍酶的概念、作用特点和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶专一性及高效催化的策略，进而讨论影响酶作用的主要因素。对酶工程和酶的应用作一般介绍。思考题？ 第一节酶的概念及作用特点 第二节酶的命名和分类 第三节酶活力测定和分离纯化 第四节酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略 第五节酶促反应的动力学 第六节重要的酶类及酶活性的调控 第七节酶工程简介 目录 第一节酶概念及作用特点 一、酶的概念 二、酶催化作用的特点 三、酶的化学本质、酶的类别和组成 酶 是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸；是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 酶催化作用的特点 酶具有一般催化剂的特征： 用量少而催化效率高；不改变化学反应的平衡点；可降低反应的活化能。 酶作为生物催化剂的特点 极高的催化效率 高度的专一性 易失活 活性可调控 有些酶需辅助因子 酶作为生物催化剂的特点 1、催化效率很高： 比较Fe3+和H2O2酶同样条件下的催化效果： 1mol/L H2O2酶 104M 1mol/L Fe3+ 10-6M 酶促反应比非催化反应高10-1020倍； 比一般催化反应高107-1013倍。 酶能够显著降低反应的活化能 活化能(Activation energy)：在一定温度下1mol 底物全部进入活化态所需要的自由能。
0℃，分解H2O2量 2、酶具有高度专一性 是指酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。一种酶只能催化一种或一类十分相似的反应。底物（substrate ，S)：酶作用的物质。 酶专一性类别（P332） 酶专一性类型（ p332） 1 、结构专一性 概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性 2 、立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性 绝对专一性和相对专一性 绝对专一性有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。 相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。 1）键专一性有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。 2）基团专一性另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严 格。 消化道内几种蛋白酶的专一性 （苯丙.酪.色-COOH） （精.赖-COOH） （脂肪族） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶 胰蛋白酶 糜蛋白酶 羧肽酶 3、酶易失活： 凡使pr变性的因素都可使酶破坏, 酶在温和条件下作用。 4、酶活性受到调节和控制：
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
酶工程 (2)
第二章 1.六大类酶基本概念和特点 （1）氧化还原酶：催化氧化还原反应，需要电子供体或受体 （2）转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 （3）水解酶：催化底物的加水分解反应 （4）裂合酶：脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键外加入某一基团。 （5）异构酶：催化生成异构体反应的酶，分别进行外消旋，差向异构，顺反异构，醛酮异构，分子内转移，分子内裂解等 （6）连接酶：需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。 应用最多的是氧化还原酶，利用率最高的是水解酶 2.必需基团及其作用特点 必需基团包括：（1）活性部位，包括结合基团和催化基团 （2）维持酶空间结构的基团 必需基团是酶分子氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。必需基团在空间结构上相互靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异性结合并将其转化为产物 3.两种酶与底物的结合模型 （1）锁钥模型：底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。 三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。 （2）诱导锲合模型：酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。 4.影响酶催化作用的五种模型 （1）广义的酸碱催化 能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱。广义的酸碱催化就是指组成酶活性中心的极性基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用，这就是广义的酸碱催化。发生在细胞内的许多类型的有机反应都是广义的酸碱催化。 组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基团。 影响酸碱催化速率的因素：一是酸碱的强度，在这些功能基团中，组氨酸的咪唑基的解离情况pK值为6.0，在生理pH条件下，既可以作质子的供体又可作质子的受体。因此，咪唑基是催化中最有效最活泼的一个催化功能基团；二是这些功能基团供出质子或接受质子的速度，其中的咪唑基的情况特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半衰期小于10-10秒。而且，供出或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要，在许多酶的活性中心处都含有组氨酸 （2）共价催化 酶活性中心处的极性基团，在催化底物发生反应的过程中，首先以共价键与底物结合，生成一个活性很高的共价型的中间产物，此中间产物很容易向着最终产物的方向变化，故反应所需的活化能大大降低，反应速度明显加快。 常见形式是酶的催化基团中亲核原子对底物的亲电原子攻击。 （3）邻近效应和定向效应 邻近效应：在酶促反应中，由酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度增加。
生物制药工艺学题库
第一章生物药物概述 1、生物药物(biopharmaceuticals) 指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液或其代谢产物，综合利用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理和方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。 2、抗生素（antibiotics）： 抗生素是生物，包括微生物，植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的(或由其它方法获得的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质”。 3、生化药品 从生物体分离纯化得到的一类结构上十分接近人体内的正常生理活性物质，具有调节人体生理功能，达到预防和治疗疾病的物质 4、生物制品（biological products） 是指用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 5、基因工程药物 采用新的生物技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，进行生产的作为治疗、诊断等用途的多肽和蛋白质类药物 6、生物药物分类 按生理功能和用途分类 （1）治疗药物：对疑难杂症如肿瘤、爱滋病、免疫性疾病、内分泌障碍等具有特殊的作用；（2）预防药物：对传染病的预防； （3）诊断药物：免疫诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、酶诊断试剂、放射性诊断药物和基因诊断药物等；某些生物活性物质亦是检测疾病的指标，如谷草转氨酶等； （4）其它生物医药用品：生物药物在其他方面应用也很广泛：如生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料等。 按原料的来源分类 （1）人体组织来源的生物药物：主要有人血液制品类、人胎盘制品类、人尿制品类；（2）动物组织来源的生物药物：动物的脏器、其他小动物制得的药物如蛇毒、蜂毒等。（3）植物组织来源的生物药物：中草药、有效成分； （4）微生物来源的药物：抗生素、酶、氨基酸、维生素等； （5）海洋生物来源的药物； 7、生物药物的特性 （1）药理学特性 （2）在生产、制备中的特殊性 （3）检验上的特殊性 （4）剂型要求的特殊性 （5）保藏及运输的特殊性 第二章生物药物的质量管理与控制 1、生物药物质量检验的程序与方法 基本程序：取样、鉴别、检查、含量测定、写出检验报告 2、药物的ADME A: absorption，药物在生物体内的吸收； D: distribution, 药物在生物体内的分布； M: metabolism，药物在体内的代谢转化； E: excretion，药物及其代谢产物自体内的排除。 3、药物的三级质量标准 1. 国家药典：凡例、正文、附录三大部分； 2. 部颁药品标准：性质与药典相同，具有法律的约束力。收载《中国药典》未收载的，但常用的药品及制剂。 3. 地方药品标准：对药典以外的某地区常用的药品、制剂的规格和标准，常制定地区性的
酶工程电子教案
酶工程电子教案 第一章绪论 1、酶的基本概念 酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。 酶工程：酶的生产与应用的技术过程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用等。 2、酶的发展史 19世纪以前： 4000 多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术。 3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品。 2500多年前的春秋战国时期，就懂得用麴来治疗消化不良等疾病。 19 世纪30年以来： 1833年，佩恩（Payen）和帕索兹（Persoz）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到淀粉酶（Diastase）。 19 世纪中叶，巴斯德( Pasteur)认为在活酵母细胞内有一种可以将糖发酵生成酒精的物质。1878年昆尼（Kunne）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶（Enzyme ），这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中”。 1896年，巴克纳（Buchner）兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。 1902年，亨利（Henri）根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出中间产物学说。 k1k2 E ＋S ======== ES ========E ＋P
K－1 1913年，米彻利斯（Michaelis ）和曼吞（menten ）米氏方程： V m [S] v == K m + [S] “酶是生物体产生的具有生物催化功能的物质”。但是尚未搞清楚究竟是哪一类物质？ 1920年，德国化学家威尔斯塔特（Willstater）将过氧化物酶纯化12 000倍。 1926年，萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。 1960年，雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年，切克（Thomas Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26 S rRNA前体具有自我剪接功能（Self-splicing）。并将这种具有催化活性的RNA 称为ribozyme。1983年，阿尔特曼（Sidney Altman）等人发现核糖核酸酶P（RNase P）的RNA部分M1 RNA 具有核糖核酸酶P 的催化活性。 由此引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）”的新概念。 3、酶催化作用的特点 3.1酶催化作用的专一性强 酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。 酶的专一性按其严格程度的不同，可以分为绝对专一性和相对专一性两大类。
酶工程习题
习题： 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_______和_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是___________。 3、进行分子内催化的核酸类酶可以分为_______，_______。 4、酶活力是_____的量度指标；酶的比活力是__________的量度指标；酶转换数是________的量度指标。 5、某酶的分类编号是，其中EC是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与的反应表明无氧气参与（） 7、酶工程是_____________的技术过程。 8、酶的转换数是指（） A、酶催化底物转化为产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的分子数 9、酶的改性是指____________________________. 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶的反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加（）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂 C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成 6、操纵子是由_________、_______和启动基因组成的。 7______________和______是影响酶生物合成模式的主要因素。 8、RNA前体的加工是指____________ 6、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。 实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中，于37°C振荡培养，当OD550为时，经培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 （A）3ml无菌水 （B）1ml乳糖溶液（L）和2ml无菌水 （C）1ml乳糖溶液（L）、1ml葡萄糖溶液（L）和1ml无菌水 （D） 1ml乳糖溶液（L）、1ml葡萄糖溶液（L）和1mlcAMP钠盐溶液然后在相同的条件下于37°C振荡培养2h，分别取样测定β-半乳糖苷酶的活力。 实验结果（A）和（C）瓶的β-半乳糖苷酶的活力为0，（B）瓶和（D）瓶β-半乳糖苷酶的活力为1000U/ml左右
生物技术制药期末
第四章抗体制药 1．Ig分子是由二硫键连接起来的4条（两对）条多肽链构成的。 2．单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为体内免疫和体外免疫。 3．一般来说PEG的相对分子质量和浓度越大，细胞的融合率越高。 1.Ig分子的抗原结合部位是由（V L和V H的CDR区）共同构成。 2.制备单克隆抗体时一般采用与（骨髓瘤细胞）供体同一品系的动物进行免疫。 3.生物药物检验要求（理化指标和生物活性指标缺一不可）。 4.下列不属于基因产品液态保存的方法是（低浓度保存） 5.前预防乙型肝炎使用的生物制品属于（疫苗）。 单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的，这种抗体是针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 双功能抗体：就是双特异性单链抗体，将抗A抗原抗体的轻链可变区基因与抗B抗原抗体的重链可变区通过短肽链接子连接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体。多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。 抗体：是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 免疫球蛋白：将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。 类型基本结构 人-鼠嵌和抗体人IgC-小鼠IgV 改型抗体小鼠CDR替换人CDR Fab 完整L链和Fd Fv V H和V L 单链抗体（scFv） V H-或-V L 单域抗体 V H或 V L 最小识别单位（MRU）一个CDR 人-鼠嵌和抗体：由于抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫原决定于抗体分子的稳定区（C）,如果在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链（H）和轻链（L）可变区分离出来，分别与人Ig的重链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。 Fab抗体：用胃蛋白可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段，在Fab片段之间仍保留有铰链区与二硫键，为Fab双体，具有完整的双价抗体活性，但相对分子质量减少了1/3，为10000，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应也相应降低30%，由于仍保持抗体分子的立体构型，因此在人体任然很稳定，成为小分子抗体的锥形。 单链抗体：是由一段弹性链接肽把抗体可变区重链（VH）与轻链（vl）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能单位。 单域抗体：抗体的V H-或-V L是具有结合抗原特异性的小抗体片段。 改形抗体：Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR 区），而不是整个可变区。 H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR 序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。又称CDR移植抗体。 （单克隆抗体）免疫导向疗法障碍有：1，单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，难以维持有效药物作用靶组织时间；2，完整的抗体分子，
《酶工程》课后习题答案
第一章酶工程基础 1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学 ①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。 ②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。 ③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。 ④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。 ⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。 2.说说酶的研究简史 酶的研究简史如下： (1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。 (2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科 医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国 科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 (3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从 刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。 3.说说酶工程的发展概况 I.酶工程发展如下： ①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化： ②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤； ③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清； ④1949年，用微生物液体深层培养法进行 －淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕； ⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量； ⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。 II.在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只 能使用一次，分离纯化困难等，解决的方法之一是固定化。 固定化技术的发展经历如下历程： ①1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性； ②1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸； ③1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。 4. 酶的催化特点 酶催化作用特性有： ①极高的催化效率：在37℃或更低的温度下，酶的催化速度是没有催化剂的化学反应速率 的1012-1020倍；
第二章_基因工程中常用的工具酶
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
酶工程名词解释
名词解释 第一章酶学与酶工程 酶：生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学。从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。 单体酶（monomeric enzyme）：由一条多肽链组成，如溶菌酶；由多条肽链组成，肽链间二硫键相连构成一整体。 寡聚酶（oligomeric enzyme）：由两个或两个以上的亚基组成的酶。 多酶复合体（multienzyme complex）：由几种酶非共价键彼此嵌合而成。 催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 酶活力(酶活性)：指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小：一定条件下所催化的某一化学反应的反应速度， 酶反应速度：单位时间内底物的减少量或产物的增加量。 酶的活力单位（U，activity unit）：酶活力的大小及酶含量的多少。 酶单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。 Katal（Kat）单位：一个katal单位是指在最适反应条件下，1秒钟催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。 酶的比活力（specific activity）：代表酶的纯度，比活力用每mg蛋白质所含有的酶活力单位数表示。对同一种酶比活力愈大，纯度愈高。 酶的转换数：以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数来表示酶的催化效率。 酶动力学：是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。 抑制剂:任何分子直接作用于酶使他的催化速度降低即称为~。 不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。 可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活。 第二章酶的发酵生产 酶的生物合成：生物体在一定的条件下都能产生多种多样的酶。酶在生物体内产生的过程，称为~。 酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产——是现在酶生产的主要方法。 固体发酵法（麸曲培养法）：以麸皮和米糠为主要原料，添加谷糠、豆饼，无机盐和适量水分，制成固体或半固体状态，经灭菌、冷却后，供微生物生长和产酶用。 液体表面发酵法：将已灭菌的液体培养基接种后，装入可密闭的发酵箱内的浅盘中，液体厚约1~2cm，然后向盘架间通入无菌空气，维持一定的温度进行发酵。 液体深层发酵法：采用液体培养基，置于发酵罐中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。 保藏：性能优良的产酶细胞选育出来后，必须尽可能保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。 细胞活化：保藏细胞在使用前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这叫做~。
5章 酶化学
第五章酶与维生素 一、名词解释 1．米氏常数（Km值） 2. 活性中心 3．辅基 4．单体酶 5. 酶的比活力 6．多酶体系 7．激活剂 8．抑制剂 9．变构酶 10．同工酶 11．酶原 二、填空题 1．酶是产生的，具有催化活性的。 2．酶具有、、和等催化特点。 3．影响酶促反应速度的因素有、、、、和。 4. 与酶催化高效率有关的因素有、、、 、等。 5．丙二酸和戊二酸都是琥珀酸脱氢酶的抑制剂。 6．变构酶的特点是：（1），（2），它不符合一般的，当以V对[S]作图时，它表现出型曲线，而非曲线。它是酶。 7．一条多肽链Asn-His-Lys-Asp-Phe-Glu-Ile-Arg-Glu-Tyr-Gly-Arg经胰蛋白酶水解可得到个多肽。 8．全酶由和组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中决定酶的专一性和高效率，起传递电子、原子或化学基团的作用。
9．辅助因子包括、和等。其中与酶蛋白结合紧密，需要除去，与酶蛋白结合疏松，可以用除去。 10．根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可分为六类、、、、、和。 11．根据酶的专一性程度不同，酶的专一性可以分为、 和。 12．酶的活性中心包括和两个功能部位，其中直接与底物结合，决定酶的专一性，是发生化学变化的部位，决定催化反应的性质。 13．酶活力是指，一般用表示。 14．通常讨论酶促反应的反应速度时，指的是反应的速度，即 时测得的反应速度。 15．T.Cech从自我剪切的RNA中发现了具有催化活性的，称之为这是对酶概念的重要发展。 16．有一种化合物为Ａ－Ｂ，某一酶对化合物的Ａ，Ｂ基团及其连接的键都有严格的要求，称为，若对Ａ，Ｂ之间的键合方式有要求则称为。 17．酶发生催化作用过程可表示为Ｅ＋Ｓ→ＥＳ→Ｅ＋Ｐ，当底物浓度足够大时，酶都转变为此时酶促反应速度为。 18．竞争性抑制剂使酶促反应的km 而Vmax 。19．磺胺类药物能抑制细菌生长，因为它是结构类似物，能性地抑制酶活性。 20．当底物浓度远远大于Km，酶促反应速度与酶浓度。 21．pH对酶活力的影响，主要是由于它和。 22．温度对酶作用的影响是双重的：①②。 23．同工酶是一类酶，乳酸脱氢酶是由种亚基组成的四聚体，有种同工酶。 24．对于某些调节酶来说，、Ｖ对［Ｓ］作图是Ｓ形曲线是因为底物结合到酶分子上产生的一种效应而引起的。 25．在某一酶溶液中加入Ｇ-ＳＨ能提出高此酶活力，那么可以推测
酶工程习题(答案全)
第一章绪论 一、名词解释 1、酶：是具有生物催化功能的生物大分子 2、酶工程：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。它是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合而形成的新技术，是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学 3、核酸类酶：为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。它可以催化本身RNA 剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应 4、蛋白类酶：为一类具有生物催化功能的蛋白质分子，它只能催化其他分子进行反应。 5、酶的生产：是指通过人工操作获得所需酶的技术过程。主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶，酶提取和分离纯化等 6、酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子的修饰，酶固定化，酶非水相催化等 7、酶的应用：是通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择和设计以及酶在各领域的应用等。 8、酶的专一性：又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即在一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。 9、酶的转换数：酶的转换数Kp。又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数 二、填空题 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_________和____________两大类。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是__________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是________________。 3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为________________，_________________。 4、酶活力是_______________的量度指标，酶的比活力是_______________的量度指标，酶的转换数的主要组分是________________的度量指标。 5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm__________________，米氏常数Km______________。 三、选择题 1、酶工程是（）的技术过程。 A、利用酶的催化作用将底物转化为产物 B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶 C、酶的生产与应用 D、酶在工业上大规模应用 2、核酸类酶是（）。 A、催化RNA进行水解反应的一类酶 B、催化RNA进行剪接反应的一类酶
酶工程题4-5章
酶工程作业题 第四章酶的提取与分离纯化 一、名解 1、等电点沉淀 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀。 2、盐析沉淀 是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特点，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 二、问答 1、在酶的提取与分离纯化过程中细胞破碎的方法有哪些？ 有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法等。 2、生物热敏性材料的干燥方法有哪些？ 喷雾干燥、冷冻干燥 第五章酶分子修饰 一、名解 1、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 2、分子内交联修饰：含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。 3、酶的有限水解修饰：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。 4、酶的定点突变技术：定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。 5、侧链基团修饰：采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。 二、问答 1、对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？
（1）被修饰酶的性质，包括酶的稳定性，酶活性中心的状况，侧链及基团的性质及反应性 （2）修饰反应的条件，包括酸碱度与离子强度，修饰反应时间和温度，反应体系中酶与修饰剂的比例等。 2、以单甲氧基聚乙二醇(MPEG)对天冬酰胺酶修饰为例阐述大分子结合修饰的方法与步骤 答：MPEG可以采用多种试剂进行活化，制成可以在不同条件下对酶分子上不同基团进行修饰的聚乙二醇衍生物。 聚乙二醇均三嗪衍生物的形成及其对天冬酰胺酶的修饰：单甲氧基聚乙二醇与均三嗪在不同的反应条件下反应，制得活化的聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1和MPEG2。通过这些衍生物分子上的活泼的氯原子，可以对天冬酰胺酶等酶分子上的氨基进行修饰。（详解见PPT） 3、什么是酶的定点突变技术，方法与步骤怎样？ 答:定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。 (1)新的酶分子结构的设计,根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间 结构及其特性，设计出欲获得的新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。 (2)突变基因碱基序列的确定(核酸类酶、蛋白类酶)对于核酸类酶，根据欲获得的 酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及位置。 对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定此mRNA 所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。 (3)突变基因的获得：根据欲获得的基因和碱基序列及其需要置换的位置，首先 合成有1~2个碱基被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物，通过定点突变技术获得所需的大量突变基因。 利用定点突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置换的碱基数目一般只有1~2个，就能达到修饰目的。 (4)新酶的获得将获得的突变基因进行体外重组,插入到适宜的基因载体中,然后通过转
生物制药 (完整版)
第一章绪论 1、生物技术药物：一般来说，采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类 药物。 2、生物药物按其功能用途可以分为三类：（1）治疗药物；（2）预防药物；（3）诊断药物。 3、生物技术药物的特性：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强， 疗效高；（4）稳定性差；（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内的半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络效应；（10）检的特异性 4、生物技术制药的特性：高技术；高投入；长周期；高风险；高收益。 第二章基因工程制药 1、基因工程制药的药物都是用传统方法很难生产的珍贵稀有的药品，主要是医用活性蛋白 和多肽类，包括：(1)免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体。(2)细胞因子，如各种干扰素,白细胞介素，集落刺激生长因子，表皮生长因子及凝血因子。（3）激素，如胰岛素，生长激素，心钠素。（4）酶类，如尿激酶，链激酶，葡激酶，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2、我国科学家经过8年刻苦攻关，成功地研制出世界上第一个采用中国健康人白细胞中克 隆的A1B型干扰素基因，组建杂交质粒，传染大肠杆菌使之高效表达的人A1B干扰素。 3、基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体，拼接，转入新的宿主细胞，构建 成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 4、基因工程药物制造的主要步骤：获得目的基因—组建重组质粒—构建基因工程菌—培养 工程菌—产物分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装。 5、简单叙事反转录法克隆基因的主要步骤：mRNA的纯化；CDNA第一链的合成；CDNA 第二链的合成；CDNA克隆；将重组体导入宿主细胞；CDNA文库的鉴定；目的CDNA 的分离和鉴定。 6、目前克隆真核基因常用的方法：化学合成和反转录法。 7、基因表达的微生物宿主细胞分为两类：原核生物，目前常用的有大肠杆菌，枯草芽孢杆 菌，链霉菌。真核生物，常用的有酵母，丝状真菌。 8、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。 9、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的剂量；（2）外源基因的表达效 率：启动子的强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码的间距；密码子组成。（3）表达产物的稳定性；（4）细胞的代谢负荷；（5）工程菌的培养条件。 10、融合蛋白：融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由 一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。 11、非融合蛋白：是指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核的mRNA的AUG为起始，在 其氨基端不含任何细菌多肽序列。 12、质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 13、质粒的分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象，它 主要与两个因素有关，一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌，质粒特性和培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。 14、提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌；选择合适的载体；选择压力；分阶段 控制培养；控制培养条件；固定化。 15、接种量：是指移入的种子液体积和培养液的体积的比例。 16、基因工程药物的分裂纯化特点：（1）目的产物在初始物料中含量低；（2）含目的产 物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差；（4）种类繁多；（5）应用面广。17、分离纯化的基本过程的5个步骤：包括细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高