杂环胺中国烟草标准化

《卷烟主流烟气中主要杂环胺类化合物（AαC, MeAαC, Trp-p-1和Trp-p-2）的测定液相色谱－串联质谱法》

标准项目实验报告

中国烟草总公司郑州烟草研究院

2011.8

目录

一、前言 (1)

1 概述 (1)

2 卷烟主流烟气中杂环胺的前处理方法 (3)

3 卷烟主流烟气中杂环胺的分析测定方法 (3)

3.1 气相色谱和气质联用法 (3)

3.2 液相色谱和液质联用法 (4)

3.3 毛细管区域电泳 (5)

3.4 酶联接免疫吸附剂测定法 (5)

3.5 小结 (6)

二、卷烟主流烟气中主要杂环胺类的分析 (6)

1 仪器与试剂 (6)

2 卷烟主流烟气中主要杂环胺类化合物的收集和前处理 (7)

3 液相色谱和质谱条件 (8)

4 标准曲线的配制 (9)

5 主流烟气中主要杂环胺的定性和定量测定 (10)

三、讨论 (11)

1 超声萃取溶剂选择 (11)

2 不同萃取方式的影响 (11)

3 不同超声萃取时间的影响 (12)

4 固相萃取过程中待测目标物的保留情况 (12)

5 待测目标物洗脱体积的确定 (13)

6 流动相pH值的影响 (14)

7 前处理后样品的稳定性 (15)

8 不同类型吸烟机的影响 (15)

9 标准曲线方程和检测限 (16)

10 精密度和回收率 (16)

11 杂环胺比对实验结果 (17)

12 卷烟样品的测定结果与文献报道结果的比较 (17)

参考文献 (19)

一、前言

1.概述

杂环胺类化合物是卷烟烟气中非常重要的两类有害成分，主要是在卷烟抽吸过程中由含氮化合物和含氧化合物燃烧、裂解而产生的，在主流烟气中的释放量较低，基本在纳克级的水平，但生物活性非常强，这些物质具有致癌或致突变作用，对人体健康具有较强的危害性。HOFFMANN在2001年公布的69种有害成分清单中，就包括8种杂环胺类化合物。

近年来，社会各界对吸烟与健康的问题日益关注，随着我国政府签署了烟草框架公约（FCTC），对烟草中有害成分信息披露的要求也越来越高。因此为了更好地评价卷烟烟气的危害性，目前很有必要对以上杂环胺类化合物进行比较详细的研究，特别是在分析方法上，需要发展准确有效的分析技术对其进行定量的描述，这样才能科学评价其对卷烟危害性的影响，研究这些有害成分的形成机理，为开发烟气有害成分降低技术提供可靠的数据支撑。

杂环胺是由蛋白质、氨基酸热解产生的一类化合物，多种煎炸食品[1-6]、咖啡饮料[7]、卷烟烟气[8-13]、江河水[14]以及尿样[6,15,16]中都可以检测到这类化合物的存在。杂环胺具有强烈的致癌性和致突变性，可引起哺乳动物的基因突变、染色体畸变及姐妹染色体变换等，其中一些杂环胺类化合物的致突变活性很强，一些还被证明可以引起实验动物多种组织的肿瘤。这类化合物在环境和日常食品中普遍存在，它们造成的健康危害已成为食品安全领域关注的热点问题之一。

1939年，瑞典科学家Widmark用烤马肉提取物反复涂抹于小鼠背部皮肤，发现可以诱发小鼠乳腺肿瘤[17]，但这一重要结果在当时并未引起人们的重视。多年后，Sugimura[18]发现鱼和肉类食品经烹调后可形成具致突变性的物质，同年Nagao发现烤鱼及肉的烟气中具有致癌物质[19,20]，激发了人们对氨基酸、蛋白质热解产物的研究兴趣，从而导致了新的致癌、致突变物的发现，并将这一类物质归为杂环胺类物质。目前大量研究已证明，大部分杂环胺类物质具有致癌、致突变性，它可以导致小白鼠的肝癌、大小肠癌、口腔癌、胰腺癌以及乳腺癌等等。杂环胺进入人体后，主要是在P450细胞色素氧化酶的作用下，发生N-氧化和O-乙酰化反应生成DNA加合物后产生致突变和致癌作用[21-27]。

迄今为止，已从烹调的食品分离鉴定的具有有的致突变和/或致癌杂环胺物质已超过20种。对于烟气中的杂环胺的研究起始于1962 Poindexter and Carpenter

报道了卷烟烟气中含有哈尔满与降哈尔满（β-咔啉）[8]。上个世纪八十年代初，Yoshida 与Matsumoto[28]对烟气中杂环胺的分析检测，检测的杂环胺有AaC与MeAaC，他们分别用HPLC-荧光检测器定量分析了烤牛肉与卷烟主流烟气中AaC与MeAaC，发现对于这两种杂环胺，9g烤牛肉的杂环胺含量与23支卷烟主流烟气中的含量相类似。1998年D Hoffmann与I Hoffmann发表了一份无滤嘴香烟主流烟气中具生物活性的物质的名单，其中包括Trp-P-1、Trp-p-2等八种杂环胺类化合物[29]。表1和图1为烟气中可能存在的八种杂环胺类化合物名称、致癌等级以及结构图。

表1 卷烟烟气中的主要杂环胺类化合物

化合物名称缩写CAS号致癌性2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚AαC26148-68-5 2B 2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b] 吲哚MeAαC68006-83-7 2B 2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉IQ 76180-96-6 2A 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并4,5-b]吡啶PHIP 105650-23-5 2B

2-氨基-6-甲基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d] 咪唑Glu-P-1 67730-11-4 2B 2-氨基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d] 并咪唑Glu-P-2 67730-10-3 2B 3-氨基- 1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-1 62450-06-0 2B

3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-2 72254-58-1 2B

图1 卷烟烟气中的主要杂环胺类化合物的结构图

2.卷烟主流烟气中杂环胺的前处理方法

由于烟气样品的复杂性、样品中杂环胺含量较低（大多为ng级别）并且存在大量的基质影响，导致了实际的样品分析中提取过杂环胺以后，要进一步进行分离纯化来排除样品中其它物质的干扰。

杂环胺属于有机碱，通常都是用有机溶剂或酸性水溶液来提取，再用CH2Cl2 [10,30-31]、乙酸乙酯[30,32,33]等进行液液萃取除去酸性或中性杂质，此外，除有机溶剂或酸性水溶液外，卷烟烟气还常用玻璃纤维进行捕集[28,34,35],再用有机溶剂进行洗涤。Kataoka H等[11]采用液液萃取法提取了卷烟主侧流烟气中的杂环胺，作者先用人造纤维富集烟气中的杂环胺，再用甲醇/氨（50：1）洗涤，调节洗涤液的pH值后，用CH2Cl2重新萃取，最后作者在卷烟主侧流烟气中检测到了AaC、Trp-P-1、IQ和PHIP。Sasaki T A等[10]采用液液萃取法提取了卷烟主流烟气中的杂环胺，作者先用0.1M的盐酸萃取剑桥滤片，调节pH值后，再用CH2Cl2萃取，检测到IQ和PHIP。Yukari Totsuka等人[13]用有机溶剂萃取卷烟烟气滤片后，再用蓝棉提取杂环胺，以甲醇/氨洗脱，定量分析了哈尔满与降哈尔满。

液液萃取方法是常用的分离方法，其优点是操作简单、方便，但费时、费力，因该方法需要大量不混溶的溶剂，有些是有毒、易挥发、易燃的，在样品预处理方面存在局限性，所以需要寻找更好的样品预处理方法。

近年来，固相萃取法得到了日益广泛的应用。因为它具有样品处理迅速，操作简单、方便，避免乳化现象，易于自动化操作等优点。1996年，Gross G A等[36,37]提出了固相萃取的方式来分离纯化复杂样品中的杂环胺。该方法既可以提高萃取率，又可以节省时间和费用，减少样品的用量，同时提取复杂样品中的多种杂环胺。经过近年来不断修改，几乎成为杂环胺分析测定的标准前处理方法，用来测定的样品也覆盖了许多含有杂环胺类化合物的样品，

3.卷烟主流烟气中杂环胺的分析测定方法

鉴定复杂样品中杂环胺的方法很多，液相色谱、液质联用、气相色谱、气质联用，毛细管区域电泳仪和酶联免疫吸附剂测定等方法都已经被用来定性定量分析复杂样品中的杂环胺。

3.1 气相色谱和气质联用法

气相色谱由于其简单、灵敏度高以及耗费低的优点已经被广泛的应用在杂环胺的分析测定中，但是由于大多数的杂环胺是低挥发性，并且具有一定的极性，在气相分析时对气相色谱柱和进样口有很强的吸附性，色谱峰会趋向于出现宽峰或拖尾峰，因此杂环胺在进行气相色谱分析之前要先进行衍生化。杂环胺的衍生化不仅可以减少杂环胺的极性，而且可以提高杂环胺的挥发性、灵敏度、选择性以及分离度。三氟甲基苯甲酰[38]、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、N,N-二甲基甲酰

胺二甲基缩醛等很多衍生化试剂都可以用来衍生化杂环胺[37,39-45]。因为衍生物中含有N原子，氮磷检测器常用来检测杂环胺的衍生物。Kataoka[46]等建立了一种简单快速的衍生方法，作者采用DMF-DMA衍生、GC-NPD测定了10种具有致突变性的杂环胺。该研究组[11]还采用盐酸/抗坏血酸对捕集卷烟主、侧流烟气后，用蓝棉处理，再用DMF-DMA对杂环胺衍生，以GC/NPD分析，检测到卷烟烟气中杂环胺AaC 、Trp-p-1、IQ、PHIP和MeIQ。

气质联用结合了气相色谱简单耗费低的优点以及质谱高灵敏度和高选择性的优点。其中，和EI相比，负化学电离(NCI)对于含氮的化合物的选择性更好、灵敏度更高，比较适合复杂样品中痕量杂环胺的鉴定[47-49]，和气相色谱方法相同，杂环胺类化合物在色谱分析之前通常要先进行衍生化过程。

但Christopher [47]等未对杂环胺化合物进行衍生，直接进GC/MS分析。作者用滤片捕集主流烟气粒相物，用HCl超声萃取后过MCX固相萃取柱净化样品，洗脱液蒸干后用乙腈溶解后进GC/MS分析。采用外标法对哈尔满、降哈尔满、AaC和MeAaC定量分析。哈尔满与降哈尔满的检测限分别是33.1 和84.7 ng/支，AaC 和MeAaC的检测限为3.1和1.4 ng/支。两个加标水平30 and 750 ng/支的回收率都在79.9和102%之间。

Sasaki T A等[10]用滤片捕集主流烟气粒相物，用HCl萃取后调节pH值，再用CH2Cl2重新萃取，之后用七氟丁酐(HFBA )和N,N-二甲基甲酰胺对杂环胺进行两步衍生，用NCI- GC-MS（选择离子监测）分析。用此种方法检测了烟气中PHIP和IQ，浓度水平0.5 ng/支，方法的检测限为0.1～0.5 ng/支。

3.2 液相色谱和液质联用法

HPLC是一种普遍有效的分析杂环胺的方法，每一种杂环胺都有特征的紫外光谱和较高的消光系数，并且它们都是电化学可氧化的，因此这些化合物可以通过紫外、电化学和荧光法来检测。在高效液相方法中，紫外吸收检测是最普遍的方法，大多数的杂环胺在260-275nm内都可以被检测。但是样品的复杂性使得该方法的选择性不高。Gross等[50]采用窄孔色谱柱Vydac 201HS52(25cm×2.1mm I.D)检测了肉类制品中的12种杂环胺和哈尔满，使用该柱子的灵敏度比常规柱子（直径4.6mm）要高三倍，该方法已经被很多研究者采纳。荧光检测器常与紫外检测器同时应用，IQ类型的杂环胺类化合物无荧光吸收，需用紫外检测器来确认。荧光检测器与紫外检测器相比，灵敏度更高，选择性好，并且色谱图更“干净” [4]。

Shige等[34]用玻璃纤维捕集主流烟气粒相物。纤维用和甲醇和氨水超声萃取，蒸干后用20 ml CH2Cl2溶解，过反相柱Bond Elut SI column，最后用HPLC-UV 分析，检测到卷烟中的PHIP平均值含量为16.4 ng/支。

液质联用方法集中了高效液相分离程度高以及质谱选择性和灵敏度高的优点，该方法可以减少复杂样品中其他物质的干扰，而且可以解决分离过程中的费时费力问题，比较适合杂环胺类化合物的定性定量分析。由于基质的复杂性及目标化合物含量低的特点，要取得可靠的结果，分离及检测方法必须具有一定的选择性和灵敏度。当前采用液质联用分析杂环胺时广泛采用的接口技术有热喷雾(TSP) 、电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)等。LC-TSP-MS在80年代中期曾是成功的接口，该技术中进行的离子化是软离子化，碎裂程度较小，通过检测杂环胺类化合物的[M+H]+峰可以检测到复杂样品中的杂环胺类化合物，Edmonds[51-52]首次采用该方法测定了经过烹调后的肉和鱼中的杂环胺类物质，但是LC-TSP-MS所提供的结构信息有限，并且它不适合热不稳定化合物。随着技术的发展，又出现了采用LC- ESI –MS、LC- APCI –MS技术检测样品中杂环胺类物质的方法，ESI和APCI都是喷雾型的软电离技术，它们的高电离效率已成为目前最理想的LC/MS接口技术。

3.3 毛细管区域电泳(CZE)

毛细管区域电泳是一种新的高分辨率分析技术，它兼有高压电泳的高速、高分辨率及高效液相色谱法的高效率等优点，与高效液相方法相比，毛细管区域电泳可以达到较高的分离效率，并且需要的有机溶剂少，样品用量小，杂环胺的毛细管区域电泳法近几年来才被发展起来。1995年Wu等[53]首次采用该方法成功的分离了Trp-P-1、Trp-p-2、AaC、MeAaC、IQ、MeIQ等30种杂环胺，该方法的检测限为0.05-1.3ng/μl。

3.4 酶联接免疫吸附剂测定法(ELISA)

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的技术，该技术具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度高和分析成本低的优点，现已被应用在测定具有致癌性的杂环胺类物质中。1988年Vanderlaan等[54]就采用该方法分析了复杂样品中的IQ、MeIQ和PHIP等。

3.5 小结

尽管卷烟烟气中杂环胺类化合物已经有了一些研究报道，但由于杂环胺在卷烟烟气中的释放量很低，烟气复杂基质对其分离和分析有着非常严重的干扰，因此给它的分离检测带来了困难。气相色谱分析通常需要进行衍生化，稳定性较差，并且由于烟气基质的干扰经常会产生错误的分析结果。HPLC-UV是同时测定多种杂环胺最有效的办法，但是它的灵敏度不高。HPLC-ED和HPLC-FLD虽然选择性和灵敏度比较好，但是只能选择性的检测几种杂环胺。CZE技术采用光电二极管阵列检测器可以达到比较高的分离效率，但是它的灵敏度不高。ELISA法需要先产生抗体才能分析杂环胺类化合物。

由于以上分析方法的原因，目前卷烟烟气杂环胺的研究经常有一些相互矛盾的报道，不同研究人员在卷烟烟气中检出的杂环胺种类和释放量有比较大的差异。Moldoveanu等采用液液萃取法提取了卷烟主流烟气中的杂环胺，衍生后采用气相色谱-质谱-化学源负离子模式检测，检测到IQ和PHIP [10]。Kataoka等将兰棉吸附和液液萃取相结合的方法处理卷烟主侧流烟气中的杂环胺，衍生后采用气相色谱-氮磷检测器，检测到AaC、Trp-p-1、IQ和PHIP [11]。Moldoveanu等人采用固相萃取方法对卷烟主流烟气进行处理，并采用气相色谱-质谱分析了非极性的杂环胺化合物：哈尔满，降哈尔满，AaC和MeAaC [47]。上述方法都存在前处理复杂、检测灵敏度较低或并不具普适性等缺点，因此改进现有前处理方法并建立一种对所有杂化胺类化合物都适用且较为简单的、选择性好、检测灵敏度高的分析方法，具有重要意义。

二、卷烟主流烟气中主要杂环胺类的分析

1 仪器与试剂

API4000质谱仪（美国应用生物系统公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Cerulean SM450 直线式吸烟机（Cerulean，Ltd.）；Borgwalt-KC RM20H 20孔道转盘式吸烟机（Borgwaldt KC，Inc.）；旋转蒸发仪R-210（瑞士步琪有限公司）；Milli-Q50超纯水仪（美国MILLIPORE公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；pH计(上海雷磁仪器公司)；CP2245电子天平（感量0.0001g，德国Sartorius公司）。

2-amino-9H -pyrido[2,3-b] indole(AαC, CAS:26148-68-5); 2-amino-3-methyl- 9H- pyrido [2,3-b] indole (MeAαC, CAS: 68006-83-7), 3-amino-1,4- dimethyl-5H-

pyrido[4,3-b] indole (Trp-p-1, CAS:62450-06-0), 3-amino-1-methyl-5H- pyrido[4,3-b] indole (Trp-p-2, CAS:72254-58-1)和2-amino- 3,4,7,8-tetramethylimidazo[4,5-f] quinoxaline (4,7,8 -TriMeIQx, CAS: 95896-78-9)标准品购自Sigma公司。

除特别要求以外，均应使用液相色谱纯级试剂，水为GB/T 6682规定的一级水，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、氨水（分析纯）、盐酸（分析纯）；

Oasis? MCX固相萃取柱（150mg，6mL, Waters公司）；0.45μm有机相针式过滤器（上海安谱）。

2卷烟主流烟气中主要杂环胺类化合物的收集和前处理

将卷烟样品放置于（22±1）℃，相对湿度为（60±2）%的环境中平衡48h，然后选其平均重量在±0.02g范围和平均吸阻在±49Pa/支范围内的烟支作为测试烟支。按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持续时间2s。

对于直线式吸烟机，用直径44mm的剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集5支卷烟的总粒相物，取收集10支卷烟的总粒相物的2张滤片置于100mL锥形瓶中，准确加入50mL甲醇/5%盐酸（v/v=20/80）溶液；对于转盘式吸烟机，用直径92mm的剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集20支卷烟的总粒相物，取收集20支卷烟的总粒相物的1张滤片置于250mL锥形瓶中，准确加入100mL甲醇/5%盐酸（v/v=20/80）溶液。超声萃取30分钟后，用移液管准确移取25mL萃取液，上样到已用10mL甲醇和10mL甲醇/5%盐酸（v/v=20/80）溶液活化后的MCX固相萃取柱（150mg，6mL）上，令萃取液靠重力自然留下，保持流速在1-1.5mL/min左右。然后依次用10ml 水、10ml甲醇、10ml甲醇/氨水/水溶液（v/v/v=25/5/70）洗涤，最后用10ml 5％氨水甲醇溶液(v/v)进行洗脱，洗脱液加入50μL内标标准溶液，混匀过滤后进LC-MS/MS分析。

3 液相色谱和质谱条件

3.1液相色谱条件：

HPLC-MS/MS分析所用分析柱为Agilent SB C18 （100mm×4.6mmi.d., 1.8μm），柱温：30 ℃；流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B为甲酸/2mM 甲酸铵缓冲溶液（pH= 4.5），梯度洗脱条件如表2所示，进样体积10μL。

表2 梯度洗脱条件

3.2

a)离子源：电喷雾电离源（ESI）;

b)扫描方式：正离子扫描;

c)检测方式：多反应监测MRM；

d)电喷雾电压：5500V；

e)气帘气压力: 0.124Mpa；

f)辅助气1压力: 0.379 Mpa；

g)辅助气2压力: 0.345Mpa；

h)离子源温度: 600.00℃

i)各化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间以及碰撞能量（CE）参见表3

1- Trp-p-2、2- Trp-p-1、3- AαC 、4- Me AαC

图2 主流烟气中主要杂环胺在标准溶液和样品中的MRM 色谱图

4. 标准溶液的配制 4.1 标准储备母液

取适量A αC 、MeA αC 、Trp-p-1和 Trp-p-2标准品用甲醇分别配制成100μg/mL 储备母液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期为6个月。 4.2 一级混合标准储备液

分别吸取A αC 、 MeA αC 、 Trp-p-1和 Trp-p-2标准储备母液10mL ，2mL 、1mL 和1mL 至100mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期为6个月。 4.3 二级混合标准储备液

吸取一级混合标准储备液10mL 至50mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。 4.4 内标储备溶液

取4,7,8-TriMeIQx 标准品用甲醇配制成100μg/mL 储备液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期为6个月。 4.5 内标标准溶液

移取内标储备溶液1mL 至100mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰

箱中避光保存，有效期为3个月。

4.6 标准工作溶液

分别移取适量标准储备溶液和内标标准溶液于容量瓶中，95%甲醇水溶液定容。即配制成如表4所示的6级标准工作溶液。

5.

待测目标物选择1个母离子，2个或2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的相对保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分特征离子的相对丰度与浓度临近的标准工作溶液中对应的特征离子的相对丰度进行比较，当相对丰度>50%时，允许偏差±20%，当相对丰度在20-50%时，允许偏差±25%，当相对丰度在10-20%时，允许偏差±30%，当相对丰度<10%时，允许偏差±50%。配制标准工作溶液分析进样，绘制标准工作曲线，相关系数R2应不小于0.99，内标法定量。

主流烟气中杂环胺类化合物的释放量由式（1）计算得出，结果以纳克每支表示：

n L

A m ?

=（1）式中：m ---- 每支卷烟主流烟气杂环胺类化合物的释放量，单位为纳克每支(ng/cig)。

A ---- 溶液中杂环胺类化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。

L ---- 溶液的体积，单位为毫升（mL）

n ---- 烟支数量，单位为支。

三、讨论

1 超声萃取溶剂选择

杂环胺的碱性较弱，所以采用强酸水溶液和甲醇的混溶液进行提取，本实验

中以5%的盐酸溶液混合不同比例的甲醇，按体积比将甲醇的比例分别设为0、10、20和50。如图3所示，但5%的盐酸与甲醇的比例超过80/20时，萃取结果基本不变。同时由于甲醇比例越高，萃取出的干扰成分就越多，因此确定萃取的溶液为甲醇/5%盐酸溶液(v/v=20/80)。

1- 5%盐酸溶液、2- 甲醇/5%盐酸溶液(v/v=10/90)、

3- 甲醇/5%盐酸溶液(v/v=20/80)、4- 甲醇/5%盐酸溶液(v/v=50/50)

图3 萃取溶剂中甲醇比例的影响

2 不同萃取方式的影响

本实验中比较了两种提取方式对烟气中杂环胺类化合物测定的影响。一种超声萃取，一般来说，超生萃取的优势是耗时较短，萃取效率较高，缺点是超声时间如果较长，温度会上升，有机溶剂的挥发的可能性增大，另外萃取的干扰成分也较多。另一种是震荡萃取，震荡萃取时发热较少，但要较长时间的萃取，才能萃取完全。图4显示了超声萃取30分钟和震荡萃取60分钟的比较结果，由图中可见对于烟气中杂环胺类化合物，超声萃取的效率高于震荡萃取。故采用超声萃取方式来提取目标物。

图4 不同萃取方式的影响

3 不同超声萃取时间的影响

本实验中选择了超声15min ，30min ，45min 和60min 四个条件来确定超声萃取的时间。由图5可见，在超声30min 后，目标物的含量基本不变，为节约时间和防止引入更多的干扰成分，我们选择30min 为萃取时间。

图5 不同超声萃取时间的影响

4 固相萃取过程中待测目标物的保留情况

本实验所采用的Waters Oasis MCX 固相萃取小柱属混合型阳离子交换固相萃取柱，对碱性化合物具有高的选择性和灵敏度，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，具有双重保留模式：离子交换和反相，适合与复杂基质中目标物的除杂和纯化。为考察固相萃取过程中目标物的保留情况，分别收集固相萃取各个步骤的溶液，进液质分析，考察保留情况。图6显示了整个固相萃取过程，实验中分别收集上样、淋洗和洗脱等步骤的流出液。如图所示，待测的4种杂环胺在上样和净化过程中几乎都保留在固相萃取小柱上，只有极微量（<0.02%）的流失，在固相萃取过程中目标物与杂质达到较好的分离；同时由于内标在固相萃取过程中发生了部分流失，所以选择将目标物洗脱后再加内标，由图7可见，目标物在萃取过程中几乎全部转移到洗脱后的溶液中，从而保证了定量的准确性。

活化

上样

净化

图6 固相萃取净化过程

1- 上样、2- 水淋洗3- 甲醇淋洗、4- 氨水甲醇淋洗液淋洗5- 5%氨水甲醇溶液洗脱

图7 固相萃取过程中待测目标物的分布

5 待测目标物洗脱体积的确定

增大洗脱体积能够保证把目标物尽可能全部洗脱出来，但目标物的浓度也会随着体积增大而降低，而减小洗脱体积可能产生洗脱不完全的风险，因而选择适宜的洗脱体积时需二者兼顾。实验中分别收集0-5mL、5-10mL、10-15mL、15-20mL 和20-25mL洗脱液进行测定。如图8所示，当采用10mL洗脱液洗脱时，已有99.5%以上的待测目标物被洗脱，因此选择10mL洗脱液进行洗脱。

1- 5mL、2- 10mL、3- 15mL、4- 20mL、5- 25mL

图8 洗脱液洗脱体积的影响

6 流动相pH值的影响

本实验中液相色谱分析采用的是水-乙腈体系，水相为甲酸/甲酸铵缓冲溶液。为研究缓冲溶液pH对色谱峰响应的影响，分别配制了pH值为3.5、4、4.5、5的缓冲溶液。如图9所示，当缓冲溶液pH值为4.5时，色谱峰的整体响应最高。

图9 流动相pH值的影响

7 前处理后样品的稳定性

为考察样品的稳定性，将前处理后的样品密闭于2mL色谱小瓶中，4℃冷藏保存，分别在前处理当天和第3、5、7天进样。如图10所示，4种杂环胺在三日内稳定性良好。

图10 前处理后样品的稳定性

8 不同类型吸烟机的影响

目前行业内常用的吸烟机有转盘式和直线式两种，实验比较了两种类型吸烟机对测定结果的影响。对于直线式吸烟机，抽吸10支卷烟，两张44mm剑桥滤片捕集，50mL5%盐酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上样25mL；对于转盘式吸烟机，抽吸20支卷烟，一张92mm剑桥滤片捕集，100mL5%盐酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上样25mL。如图11所示，转盘式和直线式吸烟机测定结果相对偏差小于5%，无显著差异。

图11 不同类型吸烟机的影响

9 标准曲线方程和检测限

如表5所示，本实验中Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四种杂环胺线性良好，通过计算10次最低浓度标准溶液测定结果的标准偏差，得到检出限分别为0.09、0.08、0.56、0.12ng/cig。

表5 四种杂环胺的标准曲线方程和定量检出限

10

由表6可见Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四种杂环胺的日内精密度结果分别为7.45%、6.37%、7.93%和7.10%，日间精密度结果分别为8.88%、7.33%、

7.73%和9.31%。回收率分别在85.1~107.7%、83.2~95.6%、89.6~110.7%和81.0~100.4%之间。

表6 四种杂环胺的精密度和回收率

11

本项目开展了比对实验，选择了参比（烤烟型）卷烟、参比（混合型）卷烟、白沙、红塔山、中南海5个牌号的卷烟进行分析。郑州烟草研究院、云南红塔集团、河南中烟工业公司、广东中烟工业公司、湖北中烟工业公司和国家烟草质量监督检验中心等6家实验室参与了比对实验。每个牌号卷烟各家实验室均测定5次，表中列出了6家实验室的测定结果。由表7结果可见，6家实验室的RSD 除一个为12.12%外，均小于10%，说明各家实验室结果较为接近，再现性好。

表7 杂环胺比对实验结果

本项目测定了20个牌号的国内外卷烟，测定结果见表8。由表中结果可见Trp-p-2的含量为0.39~3.25ng/cig、Trp-p-1的含量为0.61~2.44ng/cig、AαC的含量为9.01~41.40ng/cig、MeAαC的含量为0.70~3.53ng/cig。文献[55-56]中报道了卷烟主流烟气中杂环胺的含量范围：Trp-p-2的含量为0.82~1.1ng/cig、Trp-p-1的含量为0.29~0.48ng/cig、AαC的含量为25~260ng/cig、MeAαC的含量为2~37ng/cig，两者结果进行比较，本实验样品Trp-p-2和Trp-p-1的含量范围与文献比较接近，AαC和MeAαC的含量因所测试样品的差异而处于含量范围的低端。

表8 卷烟主流烟气中四种杂环胺的测定结果（n g/cig）编号卷烟类型Trp-p-2 Trp-p-1 AαC MeAαC

1# 国外混合型 2.58 2.27 32.60 3.36

2# 国外混合型 1.99 1.94 23.60 2.54

3# 国外混合型 1.95 1.96 23.79 2.39

4# 国外混合型 2.10 1.91 25.64 2.32

5# 国外混合型 3.25 2.44 41.40 3.53

6# 国外混合型 1.50 1.42 20.80 2.07

7# 国外混合型0.39 0.61 9.01 0.78

8# 国内混合型 1.47 1.47 18.87 1.73

9# 国内混合型 1.62 1.78 18.90 1.97

10# 国内混合型 1.56 1.46 17.72 1.65

11# 国内烤烟型 1.23 1.16 12.64 1.41

12# 国内烤烟型 1.25 0.98 14.31 1.54 13# 国内烤烟型 1.16 1.04 9.01 1.07 14# 国内烤烟型 1.68 1.22 14.57 1.37 15# 国内烤烟型 1.42 1.34 14.32 1.42 16# 国内烤烟型 1.33 1.15 10.75 1.21 17# 国内烤烟型 1.16 1.35 11.06 1.22 18# 国内烤烟型 1.83 1.73 31.40 2.63 19# 国内烤烟型 1.97 1.74 33.30 3.37 20# 国内烤烟型0.66 0.75 9.33 0.70