细胞色素P450分子生物学研究

细胞色素P450分子生物学研究进展

饶勇曾振灵

（广东省兽药研制与安全性评价重点实验室，华南农业大学兽医药理研究室，广州，510640）

细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP)是人、哺乳动物及一些昆虫体内参与各类药物、毒物及其它外来化合物代谢含血色素的酶系，具单加氧氧化特性，是微粒体混合功能氧化酶系的末端氧化酶，起着与底物结合以及从NADPH传递电子到NADPH- cytochrome P450还原酶的重要作用[1, 2]。随着分子生物学技术的发展，80年代以来，CYP新基因不断被克隆，其结构与表达调控，转基因细胞系以及单克隆抗体等研究进展迅速。

1 CYP基因的分离与鉴定

细胞色素P450是一个由结构和功能相关的基因超家族（superfamily）编码的同工酶所组成的超家族酶系，由多个基因家族（family）组成，每个基因家族又包含若干个基因亚族（subfamily）。根据Nebert的分类命名系统，CYP基因全序列同源部分<36%为家族标准，40%-65%为亚族界限，>97%则可以认为是等位变异基因[3，4]。现在已经发现，人类P450有16个基因家族31个亚家族[5]，哺乳动物有12个家族22个亚家族[6]，昆虫也已发现8个家族20个亚家族[7]。已在原核生物、植物及动物体内至少发现300余种P450同工酶[8]。

1985年Jaiswal等[9]第一次获得CYP1A1的cDNA克隆，经二恶英诱导，测定了人的CYP1A1完全的DNA和氨基酸顺序。Feyereisen等[10]获得第一个昆虫P450基因，被命名为CYP6A1。CYP6A1具有1629个核苷酸，其开放阅读框架为1530 bp，编码509个氨基酸的P450蛋白（Mr=56 738）。其氨基酸序列与哺乳动物CYP3家族只有27%的同源部分，表明昆虫存在一个独立的P450基因家族。Yamano等[11]利用大鼠2B1cDNA为探针从人肝脏的λgt11文库中克隆出了h2B1 cDNA。H2B1蛋白质含491个氨基酸残基，分子量56286，与鼠2B1蛋白有76%氨基酸序列相同，具有7-乙氧香豆素脱乙基活性。同时还克隆了h2B2cDNA 和h2B3cDNA。h2B2cDNA与h2B1cDNA 相比，在5'-端外显子4有一个明显的改变：缺失了29 bp而同时插入了44 bp的非同源DNA，此改变常发生在外显子3和4的结合处。h2B3cDNA和h2B1cDNA相比，其核苷酸和氨基酸的同源性分别为95%和93%。用体细胞杂交迹印方法确定人的CYP2B基因位于19号染色体上。1990年Yamano等[12]还克隆了CYP2A3，CYP2A3v，CYP2A4的cDNA，测序结果为在CYP2A3和CYP2A3v 间只有1个氨基酸不同，Leu160→His,是由于T488→A而引起的，另外两处核苷酸的变化是G60→A，G1645→C，属于无意义突变，说明CYP2A3v为CYP2A3的等位基因变化型。CYP2A4与CYP2A3和CYP2SA3v相比，氨基酸序列有94%相同。1990年Matsunaga等[13]测定了CYP2A1和CYP2A2，CYP2A1基因全长12835 bp，CYP2A2较CYP2A1长10 kbp，除位于第２号位长1.5 kbp和位于第５号位长12 kbp的内含子未测序外，CYP2A2 基因的序列都被测出。CYP2A1和CYP2A2都含有９个外显子，有93%的核苷酸序列相同。转录起点为CYP2A1上游的4544 bp及CYP2A2上游的5 529 bp处，两者都含典型的TATA箱但没有CCAAT箱。

在国内，董海涛等[14]采用RT-PCR技术特异性地扩增CYP1A1cDNA，为1.5 kbp大小，将此片段克隆至质粒pGEM-3Z并进行部分序列分析。结果显示克隆片段包含CYP1A1 DNA 5’端和3’端部分编码区及完整的编码区。吴健敏等[15]测得CYP2B6的3’端190 bp序列，与Yamano等[11]报道的序列相同。1995年Wang等[16]根据已知昆虫P450和哺乳动物CYP3在血红素结合位点附近的一段保守氨基酸序列设计探针，筛选棉铃虫(Heliothis zea)cDNA文库，获得了CYP6B2 cDNA。其编码504个氨基酸残基的P450

蛋白，与CYP6B1有51%的同源序列。1999年王达等[17]以抗肝肾微粒体I型抗原KLM-1抗血清为免疫探针，筛选构建了λgt11噬菌体，克隆出人肝的cDNA文库，测定了CYP2B6cDNA全序列，CYP2B6含有1195个碱基。严乐勤等[5]应用RT-PCR技术和DNA重组技术从人肝组织中克隆CYP2A6cDNA片段至克隆载体pBluscriptSK(M13-)中，并确证为CYP2A6cDNA片段。

2 CYP基因的应用研究

2.1 转CYP基因细胞系的建立

在进行体外实验检测外来化合物的致突变性和致癌性时，由于测试细胞如细菌、哺乳动物细胞CHL、V79等的CYP基因表达极低或缺乏，则必须添加肝微粒体酶制剂以达活化目的[30] 。目前最常用的活化系统是从多氯联苯诱导大鼠肝制得的富含细胞色素P450同工酶的S9组分。但这种相对粗糙的动物肝脏微粒体酶提取液成分复杂，提取过程较为复杂，影响酶液作用的因素多，表现在实际应用时作用结果的不稳定，而且动物酶催化的结果和人代谢过程存在客观的物种差异，因此，建立以人组织为材料的试验系统，是新药开发以及化合物毒性研究等领域的发展需要。

自1987年开始已有学者将CYP基因导入微生物或体外建株细胞中表达。1990年美国NCI的Crispi[18,19]小组将CYP1A1和CYP1A2基因成功地转入淋巴样干细胞株AHH-1，并获得很高表达，还研究了转基因细胞株对黄曲霉毒素B1等致突变/致癌物的代谢作用。

1995年以来，浙江医科大学病理生理教研室及医学分子生物学实验室的余应年等已克隆了人类CYP1A1[20]，CYP2B6[21]，CYP2C9，CYP3C4[22]，CYP2D6，CYP2E1，CYP2A6[5]，将这些基因部分转入人羊膜FL 细胞、中国仓鼠CHL、V97细胞中，先后建立了FL-1A1、CHL1A1、V97-1A1[20]、FL2B6、CHL2B6、V972B6[21]、CHL3A4[22]、CHL2C9[23]以及CHL2A6[5]。这些转基因细胞株可能成为药物代谢研究及毒理学研究的有力的工具。

2.2 CYP基因与昆虫抗性的关系

在昆虫中的研究发现，已知在昆虫P450基因家族中，CYP6族常与对杀虫剂抗性密切相关。其中研究得较为深入的是CYP6A1，CYP6A2和CYP6D1。

Carino等[24]和Anderson等[25]证明了家蝇Rutgers品系CYP6A1的高表达与环二烯类（如爱氏剂，氯丹）杀虫剂抗性密切相关。Waters等[26]和Dunkov等[27]研究表明黑腹果蝇91-R抗性品系，CYP6A2促进有机磷杀虫剂的解毒代谢，提示昆虫抗药性与CYP2A6超表达有关。Liu等1996年[28]和1997年[29]比较了家蝇7个品系的抗性水平和CYP6D1mRNA及蛋白质水平之间的关系，结果表明，抗拟除虫菊酯品系LPR的抗性水平与CYP6D1的过量表达被染色体Ⅱ上的一个不完全隐性遗传反式作用因子和染色体I上的一个近完全显性遗传顺式作用所控制，调控发生在转录水平。CYP6D1相关抗性的多基因性质和染色体I上的显性抗性因子的存在提示该类抗性能迅速发展。除了CYP6家族外，还有研究表明CYP4，CYP9和CYP28家族的一些成员亦可能与抗药性有关[7]。

2.3 CYP在化合物代谢中的应用

1988年Deluca等[31]应用一种香豆素类似物7-乙氯基-4-三氟甲基香豆素(7-ethoxy-4-trifluoromethylcuomarin，EFC)检测CYP催化的O-去乙基反应。该方法通过直接检测带荧光的产物来确定反应的情况，为一种直接、高效、敏感的检测方法。1992年Pearce 等[32]通过对香豆素、双香豆素和睾酮的氧化作用，研究了肝微粒体CYP2A酶的种属及个体差异性。1999年Nadin等[33]在研究CYP催化全反视黄酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)的4-羟化反应发现，在人肝脏中，CYP2C8是参与A TRA 羟化反应的主要酶，3A亚家族较少参与。CYP2C8和CYP3A4表达的个体差异性会影响A TRA的药物代谢动力学及药物间的相互作用。2000年Watanabe等[34]研究了单剂量(80 mg/kg) 与多剂量(20 mg/kg, 4 d) 注射苯巴比妥(phenobarbital) 对CYP2B1/2

在肝小叶内表达的影响，结果表明，重复给药更有利于诱导CYP的表达。

Kreth等[35]研究了人P450酶对在西方社会广泛滥用的中枢兴奋剂苯丙胺类药物N-甲基-3，4-甲烯二氧苯丙胺（N-methyl-3, 4-methylenedioxyamphetamine,MDMA,俗名“Ecstasy”），N-乙基-3，4-甲烯二氧苯丙胺（N-ethyl-3,4-methylenedioxyamphetamine, MDE,俗名“Eve”），3，4-甲烯二氧苯丙胺（N-ethyl-3,4-methylenedioxyamphetamine, MDA）的氧化代谢，结果表明，CYP2B6有很高的脱甲基酶活性，同时，其它一些P450同工酶也具有代谢甲烯二氧苯丙胺类的能力，尤其对缺乏功能性CYP2D6的个体特别重要。

Huang等[36]研究了人肝微粒体CYP3A4和CYP2B6对环磷酰胺(cyclophophamide,CPA)和异环磷酰胺(ifosfamide,IFA)的N-脱氯乙基作用和4-羟化作用，结果为CYP3A4对CPA和IFA均表现出很高的N-脱氯乙基作用，而CYP2B6仅对IFA表现出高的N-脱氯乙基及较弱的4-羟化作用。

Miksys等[37]研究了雄性大鼠灌胃0.1，0.3，1.0 mg/kg尼古丁共7天后CYP2B1mRNA及蛋白质的变化，结果为在脑和肝中1.0 mg/kg组其CYP2B1mRNA和蛋白质分别较对照组高出5.8和7.6倍。此结果说明尼古丁在脑中通过转录调控CYP 水平而加强自身代谢，从而产生中枢性耐受现象。

以上是一些应用分子生物学方法对CYP的诱导及对一些化合物代谢的研究。在国内，浙江医科大学余应年小组建立了一系列转CYP基因哺乳动物细胞株，是对体外检测潜致癌物或致突变物生物活化极有价值的探索。

总之，随着分子生物学方法的不断完善和发展，在P450的研究必将被更多学者所重视。尤其在P450的生物多态性、个体差异性、基因表达调控机制、结构与功能关系等方面进行更加深入的研究。

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