碱裂解法提取dna的方法
碱裂解法提取质粒DNA
实验目的
1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法；
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料
含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。
二、设备
微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH 2O至500ml。4℃保存备用。
6. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH 2O至100ml。121高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H 2O中溶解121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；
0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H 2O中溶解186.1g Na 2EDTA-2H 2O，用10M NaOH调pH8.0(需约50ml)，补H 2O到1L。
7. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
8. 无水乙醇；
9. 70%乙醇；
10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5)，5mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。
11 灭菌双蒸水ddH 2O
四、操作步骤
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。
2. 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rmp离心10min。（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。）
7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。
注意事项
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒 一、基本概念 1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI 或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄
实验一 碱法提取质粒DNA
实验一碱法提取质粒DNA 一、目的 掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用 掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。 二、原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。用于下一步凝胶电泳鉴定。 三、仪器设备、材料与试剂 仪器设备 恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计 量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码） 玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸
中草药中生物碱的提取与分离
工艺与设备 中草药中生物碱的提取与分离 蔡艳华赵红卫钟本和 (四川大学化工学院,成都,610051) 摘要 生物碱是许多中草药的有效成分。因其具有广泛的生理功能,引起了人们的关注。本文综述了近年来不同的提取和分离方法在生物碱中的应用原理。指出了各方法的优缺点及其今后发展的方向。 关键词:中草药生物碱提取纯化 1前言 生物碱是动植物中一类具有碱性的含氮物质。它们大多是极有价值的药物。中草药含有很多种生物碱,中草药的疗效大多是由所含的生物碱而来。 近年来生物碱作为中草药中的有效成分之一成为研究的热点。提取工艺是生物碱工业化生产的首要环节,特别是其提取和分离操作[1]。传统的生物碱提取分离方法能耗、物耗大,杂质多,效率低。针对这种情况,众多学者从不同角度对中药材中生物碱的提取分离进行了优化和改进[3)22]。本文就生物碱的提取分离技术,特别是几种新兴技术进行了综述。 2生物碱的提取方法 211传统提取方法 绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取。生物碱在溶剂中的溶解符合/相似相溶0的规律。极性强的生物碱亲水性较强,易溶于极性溶剂;弱极性生物碱亲脂性较强,易溶于弱极性溶剂。游离的生物碱大多亲脂性较强,而生物碱盐一般亲水性较强。按极性强弱可将生物碱提取溶剂分为极性溶剂、半极性溶剂和非极性溶剂[2]。 21111极性溶剂 极性溶剂有水、甘油、二甲亚砜等。水是最常用的强极性溶剂。具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在,可直接以水作为提取溶剂。而弱碱性或中性生物碱则以不稳定的盐或游离的形式存在,这部分生物碱的亲水性比较弱,为增加其溶解度,可以采用酸水为提取液,使生物碱与酸生成盐而溶出。水提取物不易稳定,易染菌,此外含果胶,黏液质类成分的水提物难于过滤,影响分离操作。 21112半极性溶剂 半极性溶剂有乙醇、丙酮、丙二醇等。乙醇是最常用溶剂,游离的生物碱及盐类一般都能溶于乙醇。它可与水、甘油、丙二醇以任意比例混溶提取生物碱。有时也可采用醇酸溶液作提取剂。 21113非极性溶剂 非极性溶剂有乙醚、石油醚,氯仿、脂肪油、乙酸乙酯、液体石蜡等。以盐的形式存在于植物细胞中的生物碱采用非极性溶剂提取时,必须先使生物碱转变成游离碱后再用溶剂提取。非极性溶剂提出的总生物碱一般只含有亲脂性生物碱,不含水溶性生物碱。这种方法得到的生物碱杂质较少,易于进一步纯化。但溶剂渗入能力较弱,需反复提取。 溶剂提取法按具体操作可分为浸渍法、渗漉法、煎煮法、热回流法和连续回流法(索氏提取法)。21114浸渍法 浸渍法是将处理过的药材用适当的溶剂在常温
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是
(完整word版)质粒抽提原理
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2 M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS 溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。 不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。用25/24/1
黄连中生物碱的提取分离及检识
黄连中生物碱的提取分离及检识 （杨翊涵中药学一班 1302010138） 【摘要】黄连为多年生草本植物,是我国传统中药,在我国中西部地区分布广泛,具有清热燥湿,泻火解毒等功效,其根、茎味极苦,苦味源于所含的多种生物碱。本文总结整理了黄连中小檗碱提取分离实验过程的步骤方法，注意事项，并且整理了黄连中生物碱的有效成分、存在形式，生物碱的溶解性规律，以及实验过程中各种提取液，添加试剂的目的、原理与效果。【关键词】黄连生物碱小檗碱提取分离检识 1.1黄连有效成分 黄连为毛茛科黄连属植物黄连（coptis chinensis Eraneh）、三角叶黄连（coptis deltoidca C．Ycheng et Hsiao）或云连（coptiteetoidesC.Y.cheng）的干燥根茎。 黄连具有清热燥湿、清心除烦，泻火解毒的功效。 黄连的有效成分主要是生物碱，已分离出的主要生物碱有小檗碱（berberine）、掌叶防己碱（palmatine）、黄连碱（jatrorrhizine）等。其中小檗碱含量最高，可达10%左右，是以盐酸盐的状态存
在于黄连中。小檗碱有很强的抗菌作用，已广泛地应用于临床，掌叶防己碱也作药用，其抗菌性能和小檗碱相似。 1.2小檗碱 小檗碱为黄色针状结晶，mp为145℃，游离的小檗碱能缓缓溶于水（1：20）及乙醇中（1：100），易溶于热水及热醇，难溶于乙醚，石油醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，其盐在水中溶解度很小，尤其是盐酸盐。盐酸盐为l：500，枸橼酸盐1：125，酸性硫酸盐1：100，硫酸盐l：30，但在热水中都比较容易溶解。 2.1实验原理 生物碱是植物中含氮的碱性有机化合物,大都有明显的生理活性,是许多中草药中的有效成分。它们是人类对植物研究得最早最多的一类有效成分,现已分离出有六千余种。这些生物碱在植物体内一般均与有机酸或无机酸结合成盐而存在,只有弱碱性生物碱往往呈游离状态,还有一些是与糖结合成苷而存在。小檗碱又名黄连素,是最先由毛莨科黄连（Coptis chinensis Fran）和芸香科黄柏(Phellodendron amurense Rup.)等植物中提出的一种黄色生物碱。黄连属植物的根茎、须根、叶中等都含有小檗碱、黄连
碱裂解法提取质粒
碱裂解法质粒提取的原理 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 溶液I的作用 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II的作用 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 溶液III的作用 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二
【珍藏版】质粒提取中的原理
1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNa se作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2．溶液II－NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH 4.8）溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是Na Ac-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而
碱裂解法提质粒原理详解
从质粒提取谈起 (2009-12-22 11:18:37) 转载 标 分类：积累小常识 签： 杂 谈 从质粒提取谈起 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生
实验六：生物碱的提取
实验六：咖 啡 因 的 提 取 【实验目的】 1、学习生物碱提取及其衍生物的制备方法； 2、学会升华操作； 【实验原理】 咖啡碱具有刺激心脏，兴奋大脑神经和利尿等作用。主要用作中枢神经兴奋药。它也是复方阿斯匹林（A. P. C ）等药物的组分之一。现代制药工业多用合成方法来制得咖啡碱。 茶叶中含有多种生物碱，其中咖啡碱（或称咖啡因,caffeine ）含量约1%-5%，丹宁酸（或称鞣酸）约占11%-12%，色素、纤维素、蛋白质等约占0.6%。咖啡因是弱碱性化合物，易溶于氯仿、水、热苯等。 咖啡碱为嘌呤的衍生物，化学名称是1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，其结构式与茶碱，可可碱类似。 嘌呤（Purine ） 咖啡因(Caffeine) 茶碱(Guanine) 可可碱(Adenine) 含结晶水的咖啡碱为白色针状结晶粉末，味苦。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等。微溶于石油醚，在100℃时失去结晶水，开始升华。120℃时升华显著，178℃以上升华加快。无水咖啡因的熔点为238℃ 从茶叶中提取咖啡因，是用适当的溶剂（氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续抽提，浓缩得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有一些其它的生物碱和杂质，可利用升华进一步提纯。咖啡因是弱碱性化合物，能与酸成盐。其水杨酸盐衍生物的熔点为138℃，可借此进一步验证其结构。 【操作过程和实验装置图】 N N NH N 12 3 67 9 CH 3 3 CH 3 N N O O N N N O O CH 3 NH N CH 3N N N CH 3 HN N O O 3
1、生物碱及其衍生物的提取与制备方法。 2、升华操作 流程 图2.8.2 常压升华装置 【实验关键和注意事项】 （1）滤纸套筒大小要合适，以既能紧贴器壁，又能方便取放为宜，其高度不得 超过虹吸管；要注意茶叶末不能掉出滤纸套筒，以免堵塞虹吸管；纸套上面折成凹形，以保证回流液均匀浸润被萃取物，也可以用塞棉花的方法代替滤纸套筒。用少量棉花轻轻阻住虹吸管口。 （2）瓶中乙醇不可蒸得太干，否则残液很粘，转移时损失较大。 （3）生石灰起吸水和中和作用，以除去部分酸性杂质。 （4）在萃取回流充分的情况下，升华操作是实验成败的关键。升华过程中，始 终都需用小火间接加热。如温度太高，会使产物发黄。注意温度计应放在合适的位置，使正确反映出升华的温度。 【主要试剂及产品物理常数】
碱裂解法提取dna的方法
碱裂解法提取质粒DNA 实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法； 2、了解制备原理及各种试剂的作用。 实验原理 碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 一、材料 含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。 二、设备 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。 三、试剂准备 1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。 1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。 4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱研究资料
本科毕业设计（论文） 中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱 研究 学院轻工化工学院 专业制药工程 年级班级2011级（3）班 学号3211001806 学生姓名练利芳 指导教师郑俊霞 2015年6 月
中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱研究 练利芳 轻 工 化 工 学 院 梁华杰 轻工化工学院
摘要 目的：本实验是对莲子心药材中的化学成分进行初步分离，并对所得到的总生物碱成分进行HPLC分析，根据特征图谱来确定莲子心总生物碱的种类以及成分。相信随着科学技术的进一步发展，也会有越来越多的相关研究，能够早日实现其最大的药用价值。 方法：经过前期查阅文献从而确定本次实验方案，本实验将莲子心药材（10.5 kg）粉碎，加12倍80%乙醇，回流提取3次，每次2 h。合并提取液，浓缩至无醇味，浓缩液用1%盐酸调至pH = 3，纱布过滤；滤液加氨水调PH至9，二氯甲烷萃取，浓缩萃取液，得到暗黄色沉淀200 g，即为莲子心总生物碱部分。对莲子心总生物碱部分进行HPLC分析，探索总生物碱的HPLC分析条件，确定了最优的分析条件。在最优的分析条件下，建立了HPLC特征图谱。 结果：结合所得的特征图谱发现莲子心中所含生物碱成分远远多于文献报道的十几个化合物。这表明其中包含有大量结构未知的生物碱类化合物，需要进一步系统研究。 结论：通过此次实验所得到的实验数据，可以为莲子心总生物碱成分的探索和技术开发提供理论基础，为日后研究莲子心总生物碱的药理作用奠定基础。 关键词：莲子心，总生物碱，特征图谱。
Abstract Objective：This experiment is to preliminary separate the chemical composition of Plumula，and HPLC analysis the total alkaloids，which make sure the kind and composition of total alkaloids separate from separate. I believe that with the further development of science and technology , there will be more and more relevant research , as early as possible to achieve its maximum medicinal value. Method: After a preliminary literature review to determine this experimental program , This experiment crushed the Plumula（10.5 kg），added 12 times 80% ethanol to the powder，refluxed and extracted them three times，each time two hours.And combined the extract,concentrated it until we could’t smell the taste of alcohol, the concentrate was adjusted to pH=3 with 1% hydrochloric acid, then filtered with gauze. The filtrate was adjusted to pH=9 with ammonia, the solvent extraction with dichloromethane,concentrated the extracts, we got 200g dark yellow precipitate., which was the total alkaloids of plumula. After a HPLC analysis to the total alkaloids, explored the analytical conditions of HPLC, made sure the best of the analytical conditions of HPLC.The characteristic spectrum was bulit in the best of the analytical conditions of HPLC. Results: It was found that the kind of alkaloids in Plumula contained far more than reported in the literature through the result of characteristic spectrum.It indicated that the Plumula contains a large number of unknown structure of alkaloids. Conclusion:The experimental data obtained in this experiment may provided a theoretical basis for the exploration and technology odevelopment of Plumula total alkaloids, and lay the foundation for future study of the pharmacological effects . Keywords : Plumula, total alkaloids, the characteristic spectrum.
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I 中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I 中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2]。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法） 实验原理： 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。 提取步骤： 1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心 2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥 2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬 浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率 3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万 不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒）， 使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀 5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL 离心管中 6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。 7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小 心将上清吸至新的 1.5mL离心管中 8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新 的 1.5mL离心管中