生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)知识讲解

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)

生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存

鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。

1.1血液样本处理注意事项

1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。

1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。

1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未

采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意：

①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空；

②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封；

③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫；

④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液；

⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水；

⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入；

⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量；

⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入；

⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数；

1.1.4. 正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。

1.1.5. 多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。

1.1.6需要冻存的全血按要求分装到统一规格的无菌冻存管中，加入DMSO混合均匀后将冻存管放入4℃冰箱中半小时，再放入-20℃冷冻冰箱中，至少4小时候后，才能转移到-80℃或更低温条件下储存。

1.1.7抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去除杂质再进行检测。

1.2尿液、粪便样本处理注意事项

1.2.1尿液主要是水、尿素、盐类及少量小分子蛋白，是理想的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。

样本留取过程中应避免混有血、脓或阴道分泌物、粪便等可引起“假性蛋白尿”的成分。检测非蛋白类待测物时，可根据试剂盒需求进行蛋白沉降操作（离心/化学沉淀）。

用于一些血液病的样本应注意在留尿前勿对动物进行酒精涂抹、吸入，注射巴比妥类、磺胺类、利眠宁、眠尔通、苯妥英钠等药物，样本应避光保存。

1.2.2粪便样本应尽量使用新鲜样本，采集后立即送检。若样本久置，则会因pH及消化酶等因素而使粪便中生物成分分解破坏。

样本中不可混有尿液，更不可采取浸泡于尿液中的粪便样本。

样本中不可混入垫料、污水等，减少微生物和颗粒造成的影响。

粪便样本不应用卫生纸包裹、手指抓取，应使用棉签，干净的镊子等夹取，直接装入蜡纸盒或EP管并密封，以防水分丢失。

1.3 骨髓样本处理及注意事项

骨髓样本一般通过脊柱穿刺、股骨采取。采集的骨髓液收集于无菌肝素抗凝管内，取材环境应保持洁净（至少为SPF环境）。

若骨髓标本含有红细胞，在冷冻前应先将其离心去除。骨髓标本采集后应尽快根据冻存程序并储存在-80℃环境下。

1.4 胃肠液样本处理及注意事项

取材前应禁食12小时，在空腹状态下取材。取出胃肠组织时，应夹闭贲门和幽门，及肠道切口两端，避免肠液胃液流失/混入血液。需要灌洗肠胃时应注意灌洗液体积、回收率。肺泡灌洗液样本同上处理。

1.5 脏器样本处理及注意事项

取材后应迅速将脏器称重，以免水分蒸发造成差异，特别是肾上腺等小器官的称重。脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官，更要新鲜称重，防止器官干燥失水而重量减轻。空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。

1.6组织匀浆样本处理及注意事项

匀浆介质的制备一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化钠溶液或直接用0.86%的生理盐水作为匀浆介质。ELISA检测的匀浆介质可使用PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol的PBS。酶活性类检测则必须使用生理盐水。

剪取组织块后应在4℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入适合的匀浆管中。

按重量(g):体积(ml)比例（1g/ml=100%）加入匀浆介质（pH7.4， 0.01mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠溶液）或者0.86%的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪尽快剪碎组织块后匀浆：包括手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎。

手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液；机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间；超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎处理。根据各型号仪器操作规程操作。

匀浆制作完成后可使用镜检观察：取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否破碎，根据结果可延长匀浆时间。

匀浆液测定前用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定。

匀浆的保存：动物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。非必须冻存的样本应于制作当天进行测定，如放置时间过长相关酶活会有所下降，部分指标4℃可存放3～5天（如SOD要存放2～3天，MDA可存放3～5，总蛋白测定可存5～7天等）。