病毒载体的应用
病毒载体的应用
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随着病毒载体的发展，病毒载体的应用也越来越广泛，尤其在人类疾病的基因治疗中发挥着重要作用。
1.在肿瘤基因治疗中的应用
根据肿瘤的类型和分布，可采用多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。复制缺陷型和条件复制型腺病毒载体已经应用于肿瘤的生物治疗，这主要是通过病毒载体将肿瘤抑制基因、免疫激活基因或凋亡基因导入靶细胞中来实现的。例如腺病毒载体ONYX-015已经应用于多种肿瘤的治疗中，并已经用于Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因缺失的病毒载体能够在动物肿瘤模型和肿瘤组织中抑制肿瘤的生长。痘苗病毒载体可以传递很多的肿瘤特异性抗原，并诱导机体产生很强的针对该肿瘤抗原的细胞免疫。
慢病毒介导的RNA干扰、免疫基因的激活也应用于肿瘤的基因治疗中。
2.在疫苗中的应用
腺病毒载体可以迅速刺激机体产生高水平的免疫反应，故常应用于HIVH5N1等病原体疫苗的研制中。如腺病毒载体Ad5就应用于研制HIV疫苗。
美国Merck公司开发的HIV疫苗(MRK Ad5)即采用了Ad5腺病毒载体。虽然Ad5疫苗最终失败，但是为后续的HIV疫苗研制积累了宝贵的经验。现在又开发出了DNA-腺病毒联合免疫的方法，它将腺病毒载体与其他载体联合起来，以实现持久、有效的免疫保护。将外源基因插入疱疹病毒的非必需基因的位置，构建出来的疱疹病毒载体可用于疫苗的研制。HSV最早应用于构建乙肝(HBV)表面抗原的表达，并成功研制出HBV的疫苗。
3.在神经生物学中的应用
疱疹病毒是一种嗜神经性病毒，它在感染外周神经后可逆行进入中枢神经系统，并可建立无细胞毒性的隐性潜伏感染，然后高效、长期地表达外源基因，而不影响神经细胞的功能，所以可利用疱疹病毒载体将外源基因导入中枢和外周神经系统柬治疗神经紊乱和神经疾病。此外，慢病毒载体可以转染非分裂细胞并可以长期表达外源基因。慢病毒载体也被用于神经疾病病理模型的建立，以及表达神经生长因子以促进神经损伤后的修复治疗等。
在基因转移过程中，病毒载体的成员很多。本节仅仅介绍了人和其他哺乳动物中最常用的几种病毒载体及其应用。除此以外，还有其他的一些诸如噬菌体、杆状病毒和植物病毒也都被用作病毒载体，也常被用于细菌、昆虫或植物的基因转移研究中。在以后的实验技术发展过程中，病毒载体还将被广泛地应用于体内或体外的基因转移中。此外，一些病毒载体很可能会作为疫苗或药物载体用来治疗各种疾病。
病毒的毒性是指病毒对宿主的致病能力。同一种病毒不同株系的毒性也不大相同。毒性的研究对病毒性疾病发病机制的阐明有着重要的意义。病毒的定性依赖于许多变量，例如毒株、传播途径、宿主的易感性等。
1.病毒毒性的衡量标准
有很多方法可以用来衡量病毒的毒性，包括死亡或症状体征等。无症状感染的情况可以用感染比例来衡量病毒毒性。另外，疾病的潜伏期、病情的严重程度、器官受到的病理损伤程度也可作为衡量毒性的标准。人们已经针对不同病毒建立了许多实验模型来对病毒的毒性进行定量，例如计算半数致死量和蚀斑形成试验等。
2.不同致病性毒株的获得
在研究病毒毒性时，有时需要获得不同致病性特征的毒株。自然界中分离的毒株往往具有不同的致病性。另外许多实验方法也被用来获得病毒变种。人们发现，病毒在传代的过程中会发生致病性的变化。在动物体内传代时，病毒往往变得更适应特定物种的宿主，这可以用来获得不同致病性毒株。在细胞培养中进行病毒多代传代后，病毒对动物的毒性往往发生下降，这个特征被用来进行减毒病毒变种的获得，有助于进行预防性疫苗的研发。
人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定
文章编号:100025404(2004)1821639204 论著 人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定 段小军1,杨 柳1,董世武2,周 跃3,唐康来1,胡 鸢1 (第三军医大学:1西南医院骨科,2基础医学部解剖学教研室,重庆市生物力学实验室,重庆400038,3新桥医院骨科,重庆400037) 提 要:目的 构建人缺氧诱导因子21α(HIF21α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率。方法 采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF21α基因片段克隆至含IRES2EG FP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 酶切鉴定及PCR结果与HIF21α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(114×106pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力。结论 应用基因工程技术,成功构建了含人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件。 关键词:逆转录病毒;缺氧诱导因子21;基因克隆 中图法分类号:R782;R394233;R394.3 文献标识码:A Construction and identification of human hypoxia2inducible factor21αgene recombinant retrovirus DUAN X iao2jun1,Y ANGLiu1,DONG Shi2wu2,ZH OU Y ue3,T ANG K ang2lai1,H U Y uan1(1Department of Joint Surgery,S outh2 west H ospital,2Department of Anatomy,C ollege of Medicine,3Department of Orthopedics,X inqiao H ospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o construct the recombinant retrovirus of human hypoxia2inducible factor21α(HIF21α) gene and to observe its ability to in fect NIH3T3fibroblasts.Methods The full2length human HIF21αcDNA was cloned into the retroviral vector containing internal ribos omal entry site(IRES)and enhanced green fluorescent pro2 tein(EG FP)by the method of gene engineering.Then the retroviral vector with HIF21αwas trans fected into PT67 cells using the lipofectine DOT AP and NIH3T3cells was in fected by the recombinant retrovirus.The target gene was detected by polymerase chain reaction(PCR).The titer and its in fection rate were determined using the EG FP ex2 pression with a fluorescent microscope.Re sults Restriction endonuclease and PCR analyses con firmed that the hu2 man HIF21αcDNA was success fully inserted into the retroviral vector.The titer of recombinant retrovirus with HIF21αgene was114×106pfu/ml and the retrovirus had a strong effect on NIH3T3cells.Conclusion The recombinant retrovirus containing HIF21αgene has been success fully constructed by the method of gene engineering,which lays a foundation for the application in therapeutic angiogenesis. K ey w ords:retrovirus;hypoxia2inducible factor21;gene clone 缺氧诱导因子21(hypoxia2inducible factor21,HIF21)是近年来发现的一种核转录因子,对缺氧状态下的血管生成(Angiogenesis)起核心调控作用,同时还具有调节细胞能量代谢,增强机体氧供给等作用1。HIF21是由α亚基和β亚基组成的异二聚体,属于bH LH2PAS 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270375) Supported by the National Natural Science F oundation of China(30270375) 作者简介:段小军(1972-),男,四川省渠县人,博士研究生,主治医师,主要从事组织工程学、血管生成方面的研究,发表论文11篇。电话: (023)68754000273007,E2mail:dxj9@https://www.360docs.net/doc/365731247.html, 通信作者:杨 柳,电话:(023)68765280,E2mail:jointsurgery@https://www.360docs.net/doc/365731247.html, 收稿日期:2004201215;修回日期:2004206221家族成员,其中β亚基在细胞内稳定表达,α亚基在功能调控方面起主要作用2。为此,本实验采用基因工程技术,体外构建表达人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,旨在为进一步应用HIF21促进血管生成的研究创造条件。 1 材料和方法 111 质粒和菌株 含人HIF21α质粒(215kb)pBSK hHIF1αT7由瑞士苏伊士大学G assmann教授惠赠。逆转录病毒载体pLEG FP2N1、pIRES22 EG FP购自Clontech公司。大肠杆菌DH5α菌株、病毒包装细胞PT67由创伤、烧伤与复合伤全军复合伤研究所国家重点实验室 9361 第26卷第18期2004年9月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.26,N o.18 Sep.2004
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳
中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.360docs.net/doc/365731247.html,
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素
筮四至医太堂堂亟（！里！竺些丛！！塑鲤旦里ｉ！！兰塑！；堑（！兰２丛Ｐ；』４１坚里生：鱼竺旦：！塑：塑 ?研究简报?文章编号：１０００＿２７９０（２００５）１４一封２旬１ 重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素 杨生玺１，蒋虹２（青海大学：１医学院生物教研室，２附属医院高压氧科，青海西宁８１０００１） 【摘要】目的：探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度（以ｃｆｕ表示）的影响因素．方法：用逆转录病毒载体ｐＭＮｓ—ＴＫ—Ｍ，以脂质体法转染包装细胞ＰＡ３１７细胞，挑选抗性集落（ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ—Ｍ）扩大培养后，进行ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ细胞接种密度、培养温度（３７℃，３２℃）、纯化方法等对其培养上清中重组病毒ｃｆｕ影响的比较性研究．结果：包装细胞的密度是影响ｃｆｕ的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高ｃｆｕ滴度．结论：该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据． 【关键词】逆转录病毒载体；包装细胞；病毒滴度 【中图号】Ｒ３９４【文献标识码】ＢＧ４１８的ＤＭＥＭ培养液继续培养３ｄ，然后更换含８００ｍ∥Ｌ的Ｇ４１８的培养液，培养约１４ｄ，细胞克隆基本形成．分别以０．５，０．７，０．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，于相同温度及相同培养时间条件下制备含重组逆转录的包装细胞上清，并于相同的条件下测定它们的ｃｆｕ滴度．取最高ｃｆｕ的包装细胞系集落，以相同的密度接种细胞，分别在３７℃及３２℃的条件下培养细胞，并于２４ｈ及４８ｈ分别收集细胞上清测定病毒ｃｆｕ滴度． ２结果采用脂质体法，将逆转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ导入ＰＡ３１７细胞，命名为ＰＡ３１７／ＴＫ．根据ＨｓＶ．ＴＫ基因设计的引物ＰｃＲ扩增产物大小为４０４ｂｐ．经ＰｃＲ扩增，载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞均出现阳性条带，而ＰＡ３１７细胞未出现相应条带（图１）．分别以０．５，Ｏ．７，Ｏ．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，２４ｈ收集上清测定ｃｆｕ，结果随细胞密度上升而上升．在ＰＡ３１７／ＴＫ包装细胞密度相同条件下降低温度需延长培养时间，我们在３２ｃｃ条件下培养４８ｈ获得了４．０×１０７ｃｆ∥Ｌ的病毒滴度． ０引言在目前众多的基因治疗临床试验方案中，逆转录病 毒载体仍是被广泛应用的载体之一．作为目的基因转运过程 中的逆转录病毒载体和包装细胞，其本身的分子生物学特性４０４ｂｐ已被广泛研究，但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录 病毒的生物、物理学特性的研究却较少．为此，我们对产生重 组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转 录病毒集落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｍｉｎｇｕｎｉｔ，ｃｆｕ）影响因素进行 了比较性研究． １材料和方法 １．１材料含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的小鼠白血病源性逆转录病毒表达载体ｐＭＮＳ—ＴＫ，ＰＡ３１７包装细胞及小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３ｒ１３培养于含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中．ＤＭＥＭ，ＲＰＭｌｌ６４０培养基等均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，胎牛血清为四季青公司产品．逆转录病毒载体、细胞株ＰＡ３１７，ＮＩＨ３１ｒ３由东南大学医学院遗传中心惠赠． １．２方法按常规方法扩增、抽提、纯化质粒ＤＮＡ片段、回收ＨｓＶ—ＴＫ片段．在Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ的作用下，定向克隆入逆转录病毒载体ｐＭＮｓＭ中ｓｖ４０启动子下游的多克隆位点．重组质粒转化ＪＭｌ０９菌后经克隆筛选、鉴定获重组质粒ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ．以脂质体法将上述重组质粒ＤＮＡ转染至逆病毒包装细胞ＰＡ３１７．以含４００ｍ∥ＬＧ４１８的ＤＭＥＭ选择培养基选择培养１４ｄ，获Ｇ４１８抗性克隆ＰＡ３１７／ＴＫ细胞ＮＩＨ３ｒ１３细胞为靶细胞在Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下测定、计算病毒滴度．病毒滴度（ｃｆｈ／Ｌ）＝细胞克隆平均数×病毒液稀释倍数×１０３．将收集到的病毒上清液分别作１０～，１０～，１０，１０。倍稀释．分别吸取１．５ｍＬ稀释的病毒液（８ｍｇ／Ｌ聚凝胺）加入ＮＩＨ３耶细胞培养瓶内，使病毒吸附２．５ｈ后，补加等量含３００ｍｇ／Ｌ 收稿日期：２００５旬２旬７；修回日期：２００５＿０３一ｌｌ 基金项目：国家自然科学基金（３００７０２２９） 通讯作者：杨生玺（１９６３一），男（汉族），青海省西宁市人．学士，副教授，青海大学医学院生物教研室副主任．Ｔｅｌ．（０９７１）６１４３６３１Ｅｍａｉｌ．ｙａｎ百ｉａｎ９６３＠１２６．ｃｏｍ ｌ：ＧＩＮ仅ＴＫ；２：ＰＡ３１７／ＴＫ；３：Ｍａｒｋｅｒ． 图１载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞出现的阳性条带 ３讨论将外源基因转入靶细胞是基因治疗的基础和关键步骤，其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败，而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一．结果提示在建立稳定产生重组腻转录病毒的包装细胞时，抗性集落数量的挑选应尽可能多一些并需传代培养观察病毒滴度的变化．制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时，细胞密度及培养温度是影响病毒滴度的重要因素，细胞密度与细胞生长状态有关，过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利，均不能使病毒滴度达到最佳化．用聚凝胺处理细胞，可提高对逆转录病毒的敏感性’１Ｊ．张惠中等心。报道在细胞培养皿中接种１．２×１０６个包装细胞可获最佳的效果．采用降低培养温度的方法，在工业化培养罐中可以提高细胞病毒滴度．把病毒上清液进行超速离心，透析纯化，浓缩处理，有可能将病毒滴度提高到较高水平，从而满足今后以逆转录病毒载体进行的临床基因治疗的需要． 【参考文献】 ［１］陈道桢，张丽珊，鲁晓萱，等．胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究［Ｊ］．实用癌症杂志，２００３；１８（２）：１２２—１２５． ［２］张惠中，范清宇，杨安钢．产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素［Ｊ］．第四军医大学学报，２００ｌ皿（４）：３１３—３１５． 编辑潘伯荣 万方数据
腺病毒中文操作手册
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT