石蜡切片法

2. 取材

取材时，最好用徒手切片等方法，检查一下材料的内部结构是否适合需要，不理想时，再重新取材。

要点：

（1）在符合观察要求的情况下，材料越小越好，体积尺寸一般不超过0.5cm。

（2）进行科研用的，材料样本数量要符合统计学的需要，并留有充分的余地。

（3）有特殊需要的材料，如茎尖纵切要看腋芽等结构的，要将材料作好标记——两侧削扁，切片时才有方向性。

（4）材料取下后要设法保持材料的新鲜。材料取好后要立即固定。

3. 固定（FAA者可免）

FAA固定液的配置：（50-70%乙醇90ml+冰醋酸5ml+37-40%甲醛（即福尔马林）5ml），常温下至少24hr或更长（视材料厚薄、大小而定）。固定后一般的材料都可以在此液中于冰箱长期保存。

要点：①固定液的体积为材料体积的20-50倍；②固定液开始浸泡时，要对材料抽气，

5. 脱水

材料完成“冲洗”后，将材料上多余的水尽量除去，然后进入第一级脱水剂中。脱水剂的浓度分为6-7级，从低到高逐级进行，每级脱水约2小时。材料小和嫩的脱水时间可以缩短，材料大和硬（木质化程度高的）脱水的时间可以长一些，需要多总结经验。脱水过程长，尤其是在高浓度脱水剂中的时间长，材料会变脆，不利于切片，见下表。

注意：用FAA固定的材料，因不经“冲洗”，可以直接从2级脱水剂开始脱水。

注意：脱水剂用量不少于材料体积的5倍。叔丁醇脱水所要求的温度，以叔丁醇不凝固

材料进入无水的脱水剂中后，若脱水剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到

7. 浸蜡（透蜡）

材料从叔丁醇脱水后进入装有适量融化的叔丁醇（恒温箱最好从36-40度缓慢升到56-60℃，透蜡的效果才好）的蜡管中，在蜡管中逐渐多次加入碎蜡（熔点48-50℃），直至

与叔丁醇等体积为止（每次加蜡后都将透明剂瓶盖上，以免透明剂过渡蒸发），然后在56-60℃温箱中4-8小时或过夜。此时必须盖紧蜡管塞，以免叔丁醇蒸发。浸蜡用石蜡的熔点应该低于包埋用石蜡的熔点、逐渐增加石蜡的浓度、逐渐增加透蜡的温度，才能使石蜡易于慢慢透入材料。

然后，打开瓶塞让透明剂蒸发干净。之后，将材料移入装有溶化石蜡（熔点56-58℃）的小杯中（换容器的目的是便于下一步操作）（仍然在58-60度温箱中），2-4小时后换纯蜡一次，再2-4小时后（60℃恒温），即可包埋（时间长短与材料大小等因素有关）。换蜡时可以在水浴加温情况下进行，以免蜡凝固。

说明：浸蜡（透蜡）的作用——用融化的石蜡代替材料中的透明剂。最重要的是使融化的石蜡完全浸入到细胞的每个部分，并使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，这样切片时材料才不会切坏。这是最重要的一步，如果透蜡不彻底，材料中有空洞，切片时会使材料切坏。

浸蜡要从低温至高温，从低浓度到高浓度，使石蜡慢慢渗入组织内，将透明剂替代出来。操之过急，则石蜡浸入不彻底，影响切片。

注意：材料（如石蜡）、用具和操作，都必须无灰尘。温箱的温度过高，会使材料变脆。操作要特别小心，不要把材料弄碎。切记要回收废蜡，并标明日期、蜡的熔点等内容。

8. 包埋

事先用牛皮纸或较硬、光滑的纸折好小纸盒若干（不能用有蜡光的纸，气泡太多，牛皮纸最好）。包埋时，不同的材料必须放在不同的纸盒中，每个纸盒通常装三个材料。纸盒的体积约为1×1×6cm。

将小杯中融化的纯石蜡连同材料约3个乘热倒入小纸盒中，迅速用热的解剖针、镊子在材料周围轻轻搅动，以消除气泡等。小杯中的蜡不够时，再加熔化好的同种蜡液。视底部稍有凝固，将材料定位（注意材料纵、横切的不同放置要求，以及材料之间的距离），然后将纸盒快速、平稳轻放水面冷却，待面蜡发白，迅速将蜡盒沉入水中（最好在水中加入冰块、或冰铁块等）。约12小时后（要加速可放入冰箱冷藏室），蜡充分凝固就可以修蜡块。小纸盒上必须记录好材料的名称、切片的内容、日期等。

已经包埋好的材料如果暂时不能切片，可在包埋状态下长期保存。

注意：下一步修蜡块时通常每个小蜡块中只能有一个材料，特殊需要时可以有2个或更多个材料，这主要由包埋时材料和材料之间的距离来决定。包埋材料时就要充分考虑到这一点。否则，修蜡块时就难以弥补。

要点：

①迅速冷却能使蜡的结晶颗粒细小，有利于切片。冷却过慢，石蜡一旦形成结晶就无法切片

②冬天切片用熔点较低的蜡（如54℃），夏天切片用溶点较高的蜡（如58-60℃）。但低熔点的蜡易展平，高熔点的蜡不易展平。

③较硬的材料用熔点较高的蜡包埋。包埋的蜡过软，切片时蜡片易后翻或卷曲，难以展平；包埋的蜡过硬，蜡片易被切碎。

9. 修蜡块和粘蜡块

将包有材料的蜡块的横截面修为矩形，底座可稍大（梯形状），每边包材料一般不少于

2-3mm，较小的材料边要留得更厚，使蜡块有较大面积，能牢固地粘在小木块上。

注意：蜡边过少，切片易碎。而且，展片时由于蜡边少，没有足够的拉力把皱褶的材料展平，这样的制片质量不高或不能用。

要点：

①蜡块不能有裂纹和孔隙；

②材料要尽量位于蜡块中央；

③修出的蜡块的几何形状要标准，粘蜡块时要粘得周正，才能切出理想的蜡带。

10. 切片

事前将切片刀磨好，磨刀时要注意刀安置在磨刀机上的方向每次都要保持一样。

使用旋转切片机，切片厚6-12（16）微米（厚度视材料和需要而定，顺、反时针都可以）。

要点：安装切片刀的角度基本为5-8度，过大、过小都无法切片。

影响切片质量的因素：

（1）蜡片卷曲：刀不锋利、角度不正确、切片太薄或太厚、材料硬、石蜡太软或太硬、蜡块中的材料不在中央。

（2）材料与蜡片分离：包埋时石蜡温度与材料温度不一致。

（3）蜡片破碎不成蜡带而吸附于切片刀上：材料过脆与刀口摩擦产生静电。

（4）髓部发达的茎段，在浸蜡时，蜡很难浸到中央髓部，因而髓部疏松，导致切片时髓部被切坏，成空心状态。这种情况，可以重点切材料两端的部位，该部位浸蜡的程度比材料中部好！！！

（5）蜡片不成蜡带：有时是因为刀切蜡块的一面的劈面不成平面（系磨刀不善造成），这时，可以将刀片的两面交换后再切。

11. 展片和粘片

明胶粘贴剂配制：

溶液甲：明胶（粉状）1g + 100ml(36℃)蒸馏水（明胶溶化后）+石炭酸（结晶）2g + 甘油15ml(溶化)，最后用滤纸过滤。

溶液乙：甲醛4ml+100ml 蒸馏水（即4%的福尔马林）

将很少的溶液甲（约一小滴）涂抹在载玻片上（事先将洗干净的载玻片用干净的绸缎擦干，以免起毛。涂抹时手一定要干净，否则会使胶不粘，导致今后材料脱片），待溶液甲基本干后，加大滴溶液乙，再放蜡带(借助于毛笔)，使其浮起，展片台展片(35-45℃)。以蜡不溶化，充分展开没有皱折为宜。展片不平时，可将温度调到50℃(55℃)左右，甲醛液多加一点，短时内迅速展平，以免蜡熔化。

注意：如果蜡熔化，将使后续的脱蜡难以进行。（2004年10月的一组，因为大意，展片时的温度高达80度以上，蜡全融化了，继续做下去的结果，片子似乎还是正常的）然后干燥24小时(30℃温箱中或风干)，进入脱蜡阶段。

要点：

①溶液甲不能多，而且要待其基本干透后再放溶液乙；

②粘片时蜡带的背面(光亮面)自然朝下，才能粘得牢固。

12. 脱蜡、复水、染色和透明

这是一系列不能分开的连续过程。将材料已经干燥了的载玻片装于载玻片架上，以架为单位进行以下操作（一个载玻片架可以装载玻片20或30片）。

注：①0.5-1g番红+100ml 50%乙醇；

②0.5g固绿+50ml丁香油（A液），1ml A液+乙醇25ml+二甲苯25ml][固绿的另一配法：0.5g固绿+50ml丁香油+50ml纯酒精]

可以用亮绿代替固绿：

配方1 亮绿0.2g + 95％酒精100ml，染20－30分钟

配方2 亮绿1g + 丁香油100ml，染1分钟（丁香油价格昂贵）

配方3 亮绿1g + 丁香油15ml ＋纯酒精25ml，染1分钟

2004.10月（生计02班）年用改良的配方3（亮绿1g + 丁香油100ml ＋纯酒精300ml，染4－8分钟）效果还可以。

要点：

①在这一过程中，必须时时知道材料位于载玻片的哪一面！

②如番红染色过深，应在染缸中加1-2滴浓盐酸，分色或入酸性酒精中分色（醋酸1ml+70%酒精100ml）；也可在50%酒精中腿色至合适。如材料木质化程度太低，番红难以染色，要延长染色时间。

③如果固绿染色过深，可延长在1/2二甲苯+1/2乙醇中的时间，腿色至合适，或者用橘红G丁香油饱和液复染，进行分色。

13. 封片

从固绿出来，经二甲苯脱水和透明后，就可以用树胶封片。

将洗干净的盖玻片用干净的绸缎擦干，以免起毛。

在桌子上垫上干净的白纸（最好是滤纸）

将载玻片从二甲苯中取出，务必使有材料的一面朝上。

（待二甲苯基本挥发时）迅速在材料上加适量封固剂，封固剂最好正正地滴在材料上（不能使二甲苯干很久后才封片）。如封固剂有气泡，可迅速（！）将载玻片在酒精灯火焰上过几次，除去气泡。

用镊子持住盖片，初学者使盖片一端先与封固剂接触，然后缓缓抽去镊子，让盖片缓缓下降即可，这样便于操作，但是往往胶不均匀，即盖玻片下的胶一端厚、一端薄，甚至漏胶，影响观察。最好的方法是，用镊子持住盖片，并用手在载玻片两侧挡住盖玻片，注意将盖玻片的中央对准材料及胶滴，然后使盖玻片水平地慢慢下降，这样胶的厚薄就均匀一致，有利于观察。

要点：

①二甲苯极易挥发，载玻片从二甲苯中取出后要迅速滴胶，以免材料干燥、开裂或吸收

空气中的水分而报废；

②注意胶的浓度，太浓时，用适量二甲苯稀释；

③胶的数量以刚好不溢出盖玻片为宜（约半滴或一小滴）。

④封片后，材料最好要位于盖玻片的中央，不要偏离太多，不便于观察，而且干固后材料容易漏胶。

14. 清洗和贴标签

待制片干固后（约需20天），用毛笔和二甲苯清洗载玻片上多余的封片剂；在载玻片的右侧，贴上标签，注明切片的内容、切片的编号及日期等。如制片不干固前贴标签，容易碰着盖玻片而移位，使载玻片上的材料变形而报废。

1 取材与固定

工具：

离心管：清洗后的1.5mL离心管多个，将离心管底剪去，在离心管盖做好样品标记大的塑料瓶：可考虑广口瓶、塑料试剂瓶、蓝盖液相瓶，用来装FAA固定液及样品小的矿泉水瓶330mL：用来装固定液，材料浸泡前赶走气泡用

镊子、小刀、刀片、凿子、手套、保鲜膜、标签纸、笔、相机

试剂：

FAA固定液：

50%乙醇或90%乙醇90mL

冰醋酸5mL

福尔马林（甲醛）5mL

番红染料配制

2 脱水透明

叔丁醇

无水乙醇

3 浸蜡

石蜡（熔点48-50℃）及石蜡（熔点56-58℃）

小广口瓶

4 包埋

纸盒

解剖针、镊子

5 修整蜡块

小木块、打火机、小刀

6 切片

磨刀机

7 展片、粘片

粘合剂：

新鲜蛋白50mL

甘油50mL

石炭酸1g

用玻璃棒搅匀，用消毒棉或纱布过滤后即可。

盖玻片、载玻片

8 脱蜡、复水、染色、透明

95%乙醇（100mL）：95mL乙醇+5mL蒸馏水

85%乙醇（100mL）：85mL乙醇+15mL蒸馏水70%乙醇（100mL）：70mL乙醇+30mL蒸馏水50%乙醇（100mL）：50mL乙醇+50mL蒸馏水纯乙醇

二甲苯

9 封片

镊子、加拿大树胶

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