GST常见问题解答集锦

GST融合蛋白构建、表达与纯化

GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点

3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.360docs.net/doc/3815669037.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG

模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s

MagPix简易操作说明

MagPix简易操作说明 日常维护 1.开机前检查鞘液和废液。 （*以下3-4步操作，也可以根据xPONENT软件自带的Revive after storage自动完成。） 2.进入Maintenance界面，点击Cmds&Routines 3.选择合适的加液槽分别选中Alcohol Flush和Wash。 4.在对应的加液槽中分别加入70％乙醇和去离子水，点击Run，完成清洗操作2次。 5.如果需要，调整探针高度： 进入Maintenance界面，点击Probe Heater, 自定义实验板名，分别在实验板、加液槽和Strip条上选择三个孔做为校验孔,并分别在滤膜板和磁力板中加入一块垫片，然后点击Auto Adjust Height,最后点击Save Plate保存。 （*每次更换不同型号的实验孔板时，需要重新调整探针。） 6.如果需要，对仪器进行校准。 （仪器的正常校准每月进行一次。） 7.对实验孔板进行读数分析。 （*以下8-9步操作，也可以根据xPONENT软件自带的Shutdown Routine自动完成。）8.实验结束后，加样槽中加入10％或者20％的自制漂白液清洁系统，Maintenance界面 下选择Cmds&Routines点击Sanitize。 9.在加样槽中加入去离子水，Maintenance界面下点击Wash，点击Run，清洗系统2 次。 10.退出软件，关闭系统。 注意事项 1.每次实验前进行一次Verification校验（如实验频繁，一周只需一次Verification 验 证即可） 2.每月定期进行一次Calibration校正。 3.每月进行一次全系统清洗，Maintenance界面下点击Cmds&Routines，选择 Sanitize和Wash，清洗系统3次。 4.如果在校验和校正中遇到任何问题，请随时与我们联系。技术中心电话:400-889-1988

GST融合蛋白的纯化步骤

GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液; 2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS 的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。 查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化 试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。

RTK简易操作说明

集思宝GPS（G971）操作说明 一、打开或建立项目：打开软件----新建---输入项目名称（以基站位置命名）----蓝牙连接基准站主机（点击“蓝牙”---选择基准站仪器序列号---确定---连接---关闭）-----投影参数---中央子午线A ----确定（以上为重新设置基站位置使用）--------或者直接打开已存在项目。 二、基准站设置：仪器-工作模式-基准站模式设置-启动参数（1）-数据链（3）-选项（2），确定。 1、设置启动模式---指定基站坐标，设置基站坐标，获取当前GPS 坐标（如果基站坐标保存后就不用获取当前坐标，点从点库中查找）；设置基站天线高，量取高度（实际测量仪器高），量取方式（斜高）。每次重新架设基站需要重新量取设置仪器高。 2、设置选项：差分格式分为：NOVATELX为三星数据格式，RTCM3/CMR/RTCM2/DGPS为双星数据格式，高度角建议设置：5-15之间。 3、数据链设置： a，使用电台时基站只能选择外置电台，频道与电台频道一致。b，网络：网络设置选择ENET----移动网络，名称为：CMNET，联通网络名称为：UNINET，用户名密码均为空。网络Ntrip设置：IP地址：；端口：9001；基站ID：默认为主机序列号 c，内置电台设置：基准站和流动站通道设置相同通道即可。功率：建议选择高。基站UHF接口上需要与外置天线接头连接。 4、设置完毕，点击确定即可（基准站屏幕向上箭头闪烁即设置成

功） 三、流动站设置： 1.设置流动站前，需要断开与基准站的蓝牙，然后连接上流动站蓝牙。连上之后进入仪器--流动站模式设置--设备选项和数据链参照基站中相关设置，使用电台时流动站只能选择内置电台，频道与电台频道一致，输入天线高（对中杆上直接读取，量取方式为杆高，手持杆一般设置成米和2米,其它高度不得采用），全部设置好后，在设置流动站界面点击确定即可（流动站屏幕向下箭头闪烁即设置成功）。 2.流动站设置成功后,查看手薄上是否为固定解状态,只有在固定状态才能进行测量. 3. 流动站设置成功后,在手薄为固定解状态下,将基站自动获取的坐标存储,（仪器——GPS状态——基站-基站信息-点保存基站坐标）每次在设置基站的时候只需在点库中获取. 四、坐标校正(控制点采集)： 校正- -转换参数--点击增加—请设置当前坐标系已知坐标（输入已知点坐标,也可以提前将已知点坐标输入至手薄中,选择在点库中查找），---请设置WGS84椭球原始坐标（手持杆气泡居中，点击获取当前GPS坐标）,在采点过程中手持杆用脚架对中,当采集时间达到时(一般设置30秒或60秒既可)—点确定，依次增加至少2个点，2-3个控制点的点校正，建议坐标转换方法选择“一步法”，高程拟合方法选择“自动判断”。从而求取四参数； 4个控制点以上点校正，选择经典七参数。设置好点校正选项后，点击“计算”(必须在固定解状态)可看到相应的校正参数与水平与高程精度，当水平或高程精度过大时,

GST-Pull-Down原理

分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。

GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。

(完整版)电脑简单使用说明书初学电脑实用教程

认知电脑 电脑的主要设备包括: 显示器 显示器开关，用来打开显示器，通常显示器打开状态下为开关指示灯（位于显示器开关旁边或显示器后方）亮着，显示器关闭状态开关指示灯则为熄灭。 电 脑 显示器 音箱 键盘 鼠标 主机 输出设备 输入设备 显示器开关

主机开关 主机重启开关 电脑主机如上图示主要有2个开关按钮，主机开关（通常为个头较大位于上方的开关按钮）用于作为电脑主机的开关，主机重启按钮（通常为个头较小位于较下方的开关按钮）用于作为电脑出现死机故障无法正常关机或重启的开关按钮，通常也叫短路开关。 键盘 键盘，电脑的重要输入设备之一，用于信息和操作录入的重要输入设备。

鼠标也作为电脑的重要输入设备，如上图所示，通常的鼠标主要有左键，滚动滑轮键， 右键这三个功能键组成。左右键的操作方式主要有：单击，双击，按住不放拖动鼠标等操作。 左键单击的作用：选中、连接、按钮的按入（像我们通常按电视遥控器按钮一样，打开了按钮显示的对应功能）。 左键双击的作用：打开windows 桌面的功能图标对应的功能。 注：通常2次敲击左键的间隔要尽可能小点，要快，否则电脑只认为你是做了2 次左键单击事件（只是对图标进行了2次选中操作），而不认为你是做1次左键双击事件，就不能达到你想要的打开这个功能的操作。如果出现上述的点击不够快的情况，只需重复回一次正确的双击操作就可以打开对应你所点击的图标功能。 右键单击的作用：打开你所点击的地方的高级菜单（高级功能菜单中有对你所点击的地方的大部分功能操作选项，通常有打开、改名即重命名、复制、删除、属性设置等功能）。右键单击弹出高级菜单后，将光标移进高级功能菜单里面，可以看见光标所在的菜单选项背景色改变为蓝色，这时你只要左键单击一下就可以进入这项功能。 注：如果失误右键点击弹出了高级菜单，只需将光标移到空白的地方（没文字，没图标，没按钮的地方）左键单击一次就可以退出并关闭高级菜单。 右键双击的作用：通常不使用右键双击，所以在不做详细介绍。 滚动滑轮的作用：通常文档或网页显示器不能一屏显示完，所以通常有部分在下方，这时我们想看下面的内容，就要将下面的内容拖上来看，这时就要使用滚动滑轮了。 滚轮向下滑动：页面向上拖动可以看到下面的内容。 滚轮向上滑动：页面向下拖动可以看到上面的内容。 左键 右键 滚动滑轮

GST融合蛋白的纯化

GST融合蛋白的纯化 诱导和收集菌体 在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为 0.1～1.0mM。 5000rpm 5min离心收集菌体。 亲和层析柱的制备 取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。 将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。 每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。 在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。 将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。 收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。 0.45um过滤后加入亲和层析柱。 室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。 用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。 配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。 用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。 测各管洗脱液蛋白浓度。 PAGE电泳检测纯度。 亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。 如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。 如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。

GST蛋白纯化步骤

制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。

1907中文说明书简易操作手册

1807．1907中文说明书简易操作手册 1：在主机安装完毕后，按住（PWR）键三秒开机，完成后，在显示VFO（430.000）的0情况下可以进行你需要的任何一项操作。 2：设置手动自动下差：在显示VFO的模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第四项菜单（ARS），轻按（MHZ SET）键进入第四项主菜单选择开关手动自动下差（ON/OFF），设置完毕后轻按（MHZ SET）键退出菜单。 3：设置差频：在显VFO模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第43项（RPT）菜单，轻按（MHZ SET）键进入此项菜单设置上下差频（-RPT，+RPT，OFF） 4：设置差频数值：在显示VFO模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第46项（SHIFL）菜单，轻按（MHZ SET）键进入此项菜单后（7.6MHZ）设置差频值，机器默认数值为7.6MHZ，旋动（DIAL）旋纽设置你需要的差频值，设置完毕后轻按（MHZ SET）键推出主菜单。 5：设置亚音编码：在显示VFO模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第49项（SQLTYP）菜单，轻按（MHZ SET）键进入此项菜单设置你需要的编码，一般选择（TONE）编码（TONE/TSQL/DCS/RVTN/OFF） 6：设置亚音数值：在显示VFO模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第52项（）菜单，轻按（MHZ SET）键进入此项菜单后（100MHZ）设置亚音，旋动（DIAL）旋纽进行设置你需要的亚音值。 7：储存频道：在显示VFO的模式下，用手咪输入你想要的频点，然后按住（MW D/MR）键，直至屏幕右下角出现数字（0），如果此数字一直在闪烁，表示此频道为空，然后旋动（DIAL）纽选择频道号码，选定后轻按（MW D/RW）键，完成频道存储。 8：频道模式与频率模式的转换：按（MW D/MR）可以进行转换。 9：发射功率调节：轻按（A/N LOW）键，发射功率分别是LOW1（5W），LOW2（10W），LOW3（25W），LOW4（50W）之间顺序转换。 10：机器复位操作：同时按住（REW）（LOW）（D/MR）键，开机，然后按（D/RW）键，机器将恢复到出厂的设置。 11：自动关机设置：在显示VFO的模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第1项（APO）菜单，轻按（MHZ SET）键进入第一项主菜单选择（30MIN，1H，3H，5H，8H）关机时间。2：屏幕亮度调节：在显示VFO的模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第16项（DIMMER）菜单，轻按（MHZ SET）键进入主菜单选择（OFF，1-10）屏幕亮度。然后轻按（MHZ SET）退出菜单。 13：键盘锁定：在显示VFO的模式下按住（MHZ SET）键三秒进入主菜单，旋动（DIAL）旋纽到第26项（LOCK）菜单，轻按（MHZ SET）键进入主菜单选择（OFF关闭，KEY仅锁手咪键盘，DIAL仅锁频道旋纽，K+D锁S手咪和频道旋纽，PTT仅锁发射，K+P锁手咪键盘和发射键，D+P锁频道选牛和发射键，ALL全部锁定）需要的选项。 14：删除频道：长按住D，频道号闪了以后旋转到需要删的频道上，按C

优质课一等奖一年级下《小池》教学设计

优质课一等奖一年级下《小池》教学设计 教学目标： 1．借助形声字构字规律、找反义词、复现等多种方式认读“池、惜、阴、睛、柔、露”这6个生字，会写“立、童”两个生字。 2．学习用看图、想象等方法读出诗句描绘的景物，读懂诗句的大概意思。 3．能借助拼音、想象画面，正确、流利、有感情地朗读、背诵古诗，在朗读和背诵中感受诗句描绘的小池初夏美景。 学情分析： 一下年级的学生已经具备一定的朗读能力和识字写字能力,会背不少古诗,在课本中也学过几首古诗。本课设计时充分考虑到学生的已有学情，继续引导学生运用形声字识记生字，书写指导时突出“立”和“立”成为偏旁时发生的字形变化，让学生观察比较——观摩范写——自主练习——观察评价，逐步培养他们的自主书写能力。在阅读方面主线突出（重点指导学生学习用“看图找景物，想象说话”的方式来学习古诗），以板块的方式展开教学，分为五大板块：读诗引入——读准读通——读懂诗意——读出画面——小结方法，最后还安排了一个背诵填空积累古诗的环节，让学生经历一个从学过走向学会，再走向会学的过程。 重点难点： 教学重点： 识字6个生字，会写“立、童”两个生字，朗读背诵古诗。 教学难点： 学习用“看、找、听、想”的方法读懂诗句。 教学过程： 活动1【活动】一、复习旧知，引入古诗。 1．看图说词语、背古诗：分为春、夏两组回忆课本中的知识。 2．出示“小池”图，引入课题。 3．读题，学习生字“池”，交流识字方法，渗透形声字特点。 4．点明作者：南宋大诗人杨万里。 活动2【活动】二、初读古诗，读准读通。

1．自由读诗，对照生字条边读边圈生字，读准生字读音。 2．指名4人分行读，随机正音，预设重点为第二行（阴、晴、柔） 3．集中识字：池晴露惜 （1）结合“池”的学习，自由认读并猜测这些字分别和什么有关。 （2）指名交流。由“晴”带出一组字（清、情、睛、蜻），同桌合作说一说它们分别和什么有关。 （3）由“露”带出识字3中的一组生字（雾、霜、霞、雪）它们都带着“雨字头”，都和“雨水”有关。 （4）小结：形声字特点。 4．再读诗，同桌一人一行读，读正确。 5．同桌展示，随机指导读出停顿、节奏。 自由练读——齐读。 活动3【活动】三、再读古诗，读懂诗意。 1．读着读着，你的眼前出现了什么景物呢？ 2．学生边读边动笔找划景物。 3．预设学习第三四行： （1）学生交流：小荷、蜻蜓读词语。 （2）随机理解诗意：露在这里表示露出；立又是怎么样的呢？动作或看图理解。 师：小蜻蜓，小蜻蜓，你立在小荷上干什么呢？随机朗读诗句，读出喜爱、期待。 4．预设学习第一二行（同桌合作学习）。 （1）同桌合作一：读读诗句，看看插图，找找景物。 （2）同桌合作展示交流。 （3）同桌合作二：认读信封里的词语，把词语贴到图上合适的位置。 （4）同桌上台展示，随机理解“泉眼”——泉水的出口，泉水流出来的地方。 （5）同桌合作三：讨论能听到什么？想到什么？ （6）交流中理解:

分子机制-蛋白检测-GST-pulldown

主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：

KUKA简单操作说明书

KUKA简单操作说明书 一、KUKA控制面板介绍 1、示教背面 在示教盒的背面有三个白色和一个绿色的按钮。三个白色按钮是使能开关（伺服上电），用在T1和T2模式下。不按或者按死此开关，伺服下电，机器人不能动作；按在中间档时，伺服上电，机器人可以运动。绿色按钮是启动按钮。 Space Mouse为空间鼠标又称6D鼠标。 2、示教盒正面 急停按钮： 这个按钮用于紧急情况时停止机器人。一旦这个按钮被按下，机器人的伺服电下，机器人立即停止。 需要运动机器人时，首先要解除急停状态，旋转此按钮可以抬起它并解除急停状态，然后按功能键“确认（Ackn.）”，确认掉急停的报警信息才能运动机器人。 伺服上电： 这个按钮给机器人伺服上电。此按钮必须在没有急停报警、安全门关闭、机器人处于自动模式（本地自动、外部自动）的情况下才有用。 伺服下电： 这个按钮给机器人伺服上电。

模式选择开关： T1模式：手动运行机器人或机器人程序。在手动运行机器人或机器人程序时，最大速度都为250mm/s。 T2模式：手动运行机器人或机器人程序。在手动运行机器人时，最大速度为250mm/s。在手动运行机器人程序时，最大速度为程序中设定的速度。 本地自动：通过示教盒上的启动按钮可以使程序自动运行。 外部自动：必须通过外部给启动信号才能自动执行程序。 退出键： 可以退出状态窗口、菜单等。 窗口转换键： 可以在程序窗口、状态窗口、信息窗口之间进行焦点转换。当某窗口背景呈蓝色时，表示此窗口被选中，可以对这个窗口进行操作，屏幕下方的功能菜单也相应改变。 暂停键： 暂停正在运行的程序。按“向前运行”或“向后运行”重新启动程序。 向前运行键： 向前运行程序。在T1和T2模式，抬起此键程序停止运行，机器人停止。 向后运行键： 向后运行程序。仅在T1和T2模式时有用。 回车键： 确认输入或确认指令示教完成。 箭头键： 移动光标。 菜单键： 用菜单键打开相应菜单，通过箭头键选择子菜单，回车键使选中的菜单被应用。用退出键退出打开的菜单。 状态键： 选择机器人的操作状态。

GST融合蛋白纯化方法

GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7重复步骤6 两次； 8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 92000 g，3 min离心，收集上清； 10重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条 Thrombin cleavage (using thrombin produced by Amersham) 1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose * Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volume Add thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pellet Gently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 h Centrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube. 2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein. Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted. Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h. Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.

制版简单操作说明

慈星纺机 制版操作说明书 制作：刘彪 2006-12-19

慈星纺机科技有限公司 一. 键盘操作： 如果要熟练.快捷的进行电脑制图，就要求能灵活的运用键盘，对键盘的每一个键和功能键要熟记于心。 键盘一些特殊功能键的使用： Esc--exit退出 F1—F8-八个动作命令块（8个BLOCK） F9-------缩小画板区域 F10-----放大画板区域 F12-----填充，填满区域内的颜色 Prtsc----修改颜色 Scroll---选取颜色 Pause---清除颜色 Insert---单项选择功能 Delete—单项删除功能 Home---目录起始点位置 End------目录末点位置 Ctrl+Page up—向前翻页 Ctrl+Page down—向后翻页 →↑←↓----光标移动功能 小数字键盘 Numlock-----把选定的动作命令的选项锁定，即不显其它无标签的命令，任意修改，不影响其他命令。（起到保护作用） ”/”----转换小键盘箭头状态。一种是Norm状态，另一种是是Vect,可以用8个数字来表示8个不同方向，Ins（0）是慢速移动，即一针一针的移动，Del是写入，Enter是快移，十针十针的移动。“+”是转移放大区的光标显示方式，“口”.“+”状态。 “*”切换显示窗口方式。Ctrl键加鼠标的左手键，横竖不改变方向快速画线。鼠标左手键=写入状态，右手键=移动画板位置。

菜单功能键 按菜单的红色字母拉出菜单 FILE

Load---输入文件。按回车，在Directory 目录下读取磁盘Disk 或硬盘Arch 中的文件，后光标移到Load file 按回车就可 **注意：要想程序带圈数表CRC ，Start course 必须是开始行：0000 Save----保护文件。起始行Start course ，末点行End coerse,分别是花纹的前行和后行。在Directory 下选择保存于磁盘或硬盘下 New----新建一个文件。Machine type 机型：Needle 针数。Initialize:进入，Listing:机型表

GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.360docs.net/doc/3815669037.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴　爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州　510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海　200031) 摘　要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株、质粒　人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2　生化试剂和分子生物学试剂　引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2　方法1.2.1　目的基因的扩增及纯化　根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2　pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建　将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3　重组质粒的筛选和鉴定　将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3

海湾GST9000简单操作说明.doc

海湾 GST-9000 用户使用说明 1.1常规键盘操作 1.1.1键盘按键的分类 控制器键盘示意图如图1-1、 1-2 所示。 浏览火警信息查询窗口切换火警确认 选 中消音警报器火警传输复位 消音 / 启动直接控制 图1-1 1 2 ABC 3 DEF 确认系统设置用户设置 4 GHI 5 JKL 6 MNO 取消图形/ 文本自检 7 PQRS 8 TUV 9 WXYZ 空格 启动/ 停动 屏蔽/ 取消屏蔽 * 0 # + = 图1-2 按照控制器各按键的功能来划分，可以分为信息查询类按键、特殊功能类按键、设置功能 类按键、字符键和操作键。 信息查询类按键：指用户查询各类信息时，用来进行显示信息切换的按键，属于用户 经常操作的按键，包括：“浏览火警” 、“信息查询” 、“窗口切换” 、“图形/文本”。 特殊功能类按键：指用户操作控制器时，完成相应的命令，改变系统状态的按键，包 括：“火警确认” 、“消音”、“警报器消音 / 启动”、“火警传输直接控制” 、“复 位”、“自检”、“启动 / 停动”、“屏蔽 / 取消屏蔽”。 设置功能类按键：指用户需要设置控制器的参数、调试及改变控制器设置时使用的按 键，包括：“系统设置”、“用户设置” 。 操作键：指用户进行各种操作时均可能用到的按键，包括：、、或 、选 中“确认”、“取消”。 、 本控制器除具有本机键盘外，还可配接标准键盘，并具有触摸屏操作功能，可利用外接键 盘及触摸屏进行数据输入或菜单选择等操作。 1.2信息查询 按下“信息查询”液晶屏将显示图1-3 所示界面。

图1-3 1.2.1历史记录查询 选择“ 1、历史记录查询”可对运行记录、火警记录和操作记录进行查询。如图1-4 所示。 图1-4 运行记录查询 进入“ 1、运行记录查询” ，可检查运行记录信息，如图1-5 所示。运行记录包括所有的报 警信息，发出的命令和进行的设置。每条信息包括序号、信息类型、信息发生的时间、二次码、 设备类型及注释信息。本控制器可查询系统最新发生的3200 条记录。