FRET在生物科学中的应用
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用张建伟;陈同生【摘要】荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET 效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.%Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is the most widely used technology to study the protein - protein real - time dynamic interactions and the change of macromolecular conformation in living cells. Spectral cross - talks and acceptor - to - donor concentration ratio are the tissues harassing the quantitative measurement of FRET efficiency. Many different methods to quantitate FRET efficiency, such as FLIM - FRET, spectral FRET, acceptor photobleaching FRET and sensitized emission FRET methods, have been proposed. In this report, we introduce some quantitative FRET methods to study the mechanism of cell signal translation.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】荧光共振能量转移(FRET);FRET效率;定量检测;荧光蛋白【作者】张建伟;陈同生【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子[1-2], 从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加. 供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系[3]：FRET效率是依赖于供体与受体间的距离r和Forster距离R0的. R0由下式给出[3-4]：已知主要有2个因素影响FRET效率的定量检测：一个是光谱串扰, 包括供体荧光串扰到受体通道(发射光谱串扰)和激发供体时直接激发受体(激发光谱串扰)[7-8]. 由于有机荧光团的光物理特性, 绝大数现有的FRET供体受体对都存在光谱串扰. 在定量检测FRET效率时必须消除这些串扰, 选择2个发射光谱分离较大的供体受体对, 能够减小串扰, 但同时J()会减小. 影响FRET定量检测的另一个因素是参与FRET作用的供体与受体对所占整个荧光基团的比例[9-10]. 自由的供体与受体相互作用时, 往往不是所有的供体或受体分子都参与相互作用. 参与相互作用分子的百分数难以知晓, 因此, 各种FRET效率的定量检测方法对有自由的供受体存在时都不能完全地反映FRET效率, 只能测量表观FRET效率. 另外, 活细胞中荧光蛋白表达水平和背景噪音等其它因素也可能影响FRET效率的定量检测.绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins, GFP)是从维多利亚水母中分离出来的,受紫外或蓝光激发而发出绿色荧光[11]. 与GFP融合的蛋白在细胞中仍然能够行使正常的功能, 因此GFP成为了检测蛋白质分子间相互作用的报告分子. 近年来又发现了GFP的多种变体, 与迅速发展的荧光显微镜技术结合极大地改善了活细胞成像和FRET技术在活细胞中的应用,使得FRET技术在细胞生物学和化学方面的应用得到了质的飞跃. 基于荧光蛋白的FRET(FPs-FRET)技术已被广泛应用于活细胞实验研究中,极大促进了生物学的发展[12]. 利用基因转导技术和共聚焦荧光显微成像可以在活细胞中研究蛋白质定位、信号的传递、蛋白质分子间的相互作用和蛋白质分子的构象变化. 将荧光蛋白(FPs)接到感兴趣的蛋白质分子上, 可以对细胞进行实时动态检测, 也可视化监测细胞内蛋白质与蛋白相互作用的生理过程[13]. FPs-FRET 传感器主要可以分为3类: 分子内的FRET传感器、双分子FRET传感器和基于双分子荧光互补传感器(BiFC)[13]. FPs-FRET传感器已经成为在活细胞中实时检测钙离子浓度、pH值、各种激酶活化、蛋白质磷酸化以及蛋白质分子间相互作用等动态过程的重要技术[13-14].FRET定量检测的常用方法有寿命成像(FLIM-FRET), 光谱成像(spectral FRET), 受体光漂白(acceptor photobleaching FRET)和敏化发射测量(sensitized emission FRET)等方法, 下面介绍FRET技术在细胞信号转导机制研究中的应用.FLIM方法主要是通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命 D和 DA来确定FRET效率E[5],FLIM方法检测的结果一般作为其他FRET定量检测方法的对照标准. 要求供体通道选择性探测供体荧光, 而且FLIM系统价格昂贵, 同时也需要熟练的操作人员进行操作, 这些都限制了FLIM方法的推广应用. 事实上用时间相关单光子计数(TCSPC)进行精确地拟合时可能带来了其他的方法没有的复杂问题[10], 尤其是复杂的光物理性质增加了寿命法分析的困难[15, 17]. 为了精确地对分子的荧光寿命进行多指数拟合, 在每个像素点上需有大量的光子[18], 这将大大延长成像时间, 使得FLIM方法不适合于活细胞中的实时动态检测[19-20].每一个荧光团都有各自的激发和发射光谱, 不同于采用荧光通道获得数据的强度测量方法和寿命测量方法的是光谱法获得的分别是供体、受体和供体与受体样本的发射光谱. 通过供体和受体的光谱对供体-受体样本的光谱进行拟合得到FRET效率. THALER等人[21]提出了一种利用光谱成像的FRET效率定量测量方法. 存在FRET 时混合光谱Fcomplex包括3个部分：供体的荧光、受体的荧光和从供体转移到受体的那部分荧光：Fcomplex=d×(1-E)×Fd+a×Fa+d×E×(Φa/Φd)×k()×Fa,本研究小组最近也提出了一种基于荧光光谱拟合的FRET定量分析方法[22]. 该方法通过测量细胞内供体-受体对的荧光发射谱, 然后按照供体和受体的荧光发射谱进行拟合得到FRET效率. 该方法有效地解决光谱串扰问题, 可用于检测蛋白质之间的相互作用. 最近, LEVY等[23]提出了基于2种不同激发光条件的发射光谱测量FRET效率的方法, 该方法能够测量很小的FRET效率和参与作用的供体与受体摩尔比, 而且能够通过仔细的校准来消除自发荧光和背景光的影响.sFRET方法是测量FRET效率最为灵敏的方法, 在目前已知的方法中只有光谱法能够探测出小于5%FRET信号. sFRET方法能够有效地解决光谱串扰问题, 也能够很好地消除背景光和自发荧光的影响, 因此sFRET方法可以用于测量蛋白质分子间弱的FRET信号. 但是sFRET方法对于数据采集要求很高, 因为较小的干扰就可能对结果造成较大影响, 所以须对数据要进行严格的校正, 特别是须对背景光和自发荧光进行严格校正.光漂白方法(Pb-FRET)通过检测光漂白受体前后供体的荧光强度来获得FRET效率, 光漂白受体会导致供体的荧光强度上升. 光漂白方法分为完全光漂白方法和部分光漂白方法.供体和受体发生FRET时, 供体的荧光减少, 即供体荧光会产生淬灭, 而受体的荧光增加. 一般采用最大的受体激发光完全漂白掉受体后, 供体就不再把能量传递给受体, 导致供体的荧光增加. 通过测量完全光漂白受体前后供体的荧光强度和就可以得出FRET效率[24]：ELDER等[20]提出了一种通过检测部分受体光漂白前后供体的荧光强度和受体光漂白程度来测量FRET效率的部分受体光漂白方法,受体光漂白方法(Pb-FRET)操作简单, 在共聚焦显微镜上也很容易实现. Pb-FRET方法测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数, 只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化. 但是, 受体光漂白会对生物体造成的损伤, 不利于在单细胞中进行多次测量, 也不能在细胞中进行实时动态检测[20, 27]. 必须注意的是：受体光漂白过程中用最大的光强的受体激发光也可能漂白掉供体分子,最近发现在光漂白过程中YFP分子可以光转换成CFP分子[28].敏化发射测量(SE-FRET)方法被广泛应用于活细胞中FRET效率的动态检测[20, 27]. SE-FRET既可以在共聚焦显微镜上实现, 也可以在宽场显微镜上实现. 传统的SE-FRET方法是利用3个滤光块组的方法, 每个滤光块组都是采用一个激发带宽滤光块来选择性激发供体或受体, 并用发射滤光块来收集供体或受体发射的荧光. 可是, 受体敏化发射荧光包括直接激发受体的荧光和供体串扰到受体通道的荧光, 其串扰路径如图1.在实际的实验中, 除了测量待测FRET样本实验外, 还需增加对3个参考样本来对系统进行串扰校正：只有供体荧光团的供体对照样本, 只有受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本. 增加的供体对照样本测量供体发射串扰(图1中path2), 受体对照样本测定直接激发受体发射串扰(图1中path1), 已知FRET效率的校正样本获得给定条件下成像系统的校正因子G[27]. 也有文献报道用2个化学计量比为1∶1且FRET效率差别较大的参考样本来获得校正因子G[29].SE-FRET方法具有无损伤的特性, 成为在活细胞中最为适合于动态监测的方法[20, 26], 而且能够较好对光谱串扰和系统参数进行校正. 但是, SE-FRET方法也有其自身的限制，需要利用对照样本(至少3个)对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数, 且每次实验都要重新校正, 极大地增加了SE-FRET实验的工作量和难度, 也限制了该方法的推广应用. SE-FRET实验必须同时转染4个样本, 其中的任何一个样本没有转染成功, 都会导致实验的失败.FRET技术已经成为在活细胞中研究蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的广泛应的工具. 本研究小组近几年利用FRET技术在活细胞中研究了细胞增殖和细胞凋亡过程中的分析调控机制[30-34]. 通过构建基于GFPs的FRET质粒，利用共聚焦荧光显微镜在单个活细胞中研究各种诱导刺激条件下细胞凋亡的分子调控机理[32-36].FRET技术在生物上的重要应用是通过实时检测荧光蛋白之间FRET的效率变化来研究荧光蛋白标记蛋白质分子间的相互作用. 利用FRET技术并结合共聚焦显微成像技术，本研究小组证明了在碱性条件下诱导细胞凋亡过程中Bid被切割成tBid 并转位到线粒体上，并且证明凋亡过程中Caspase-3活化[31]. 为了在活细胞中实时研究Caspase-3的动态活化过程，筛选了稳定表达SCAT3的细胞系，在此基础上通过检测细胞凋亡期间SCAT3 FRET效率的动态变化，实现了在单个活细胞中实时检测caspase-3的动态活化过程[32].利用ECFP标记Bax蛋白和EYFP标记PUMA蛋白，本实验室利用FRET技术在活细胞中首次证明了在紫外诱导的细胞凋亡过程中PUMA可以直接促进Bax的活化和转位，并抑制Bcl-XL蛋白活化[37]. 本研究小组还证明了低功率激光辐照能够通过GSK-3β未活化的机制来抑制Bax转位的上游过程[38]，以及P53不依赖于PUMA转录因子而是通过Akt/FOXO3a介导的Bax活化和细胞凋亡[39].FRET技术已被广泛应用于活细胞中蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的动态研究. 影响FRET定量检测的因素主要有光谱串扰和供体与受体的浓度比. GFP 及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛. 本文介绍了寿命测量法、光谱法、部分受光漂白方法和敏化发射等几种常用的FRET定量检测方法，并对上述各种方法在定量检测FRET效率上进行了简单的评述.【相关文献】[1] LAKOWICZ J R. Energy Transfer: In Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Plenum Press, 1983.[2] CLEGG R. 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荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究探究中的运用资料精
荧光共振能量转移（FRET）技术在⽣物研究探究中的运⽤资料精荧光共振能量转移（FRET）技术在⽣物研究中的应⽤⾼裕锋分析化学B200425012摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在⽣物研究中的⼀些应⽤。
核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋⽩质结构和蛋⽩质相互作⽤等的研究是⽣命科学研究重要组成部分，相关⼯作⼀直备受关注，⽽FRET技术被⼴泛应⽤于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。
关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋⽩质结构，蛋⽩质相互作⽤。
⽣命科学被誉为21世纪的科学，为了揭⽰⽣命的奥妙，⼈们投⼊了⼤量的⼯作。
其中对于核酸和蛋⽩质的研究备受关注，⼤量的新技术与新⽅法被⽤于该领域的研究中。
荧光共振能量转移技术是⼀项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，⼆者相互结合，成为了⽣命科学领域的⼀个重要研究⼿段[1,2]。
本⽂简单介绍了基于FRET原理的新技术在⽣物研究中的⼀些应⽤。
⼀、FRET基本原理[3]FRET现象是Perrin在20世纪初⾸先发现的，1948年，Foster[4,5]创⽴了理论原理。
FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作⽤以⾮辐射⽅式转移能量的过程，⼜称为长距离能量转移。
产⽣FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有⼀定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具⼀定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作⽤的条件。
图1 产⽣FRET条件⽰意图FRET 的效率⽤E 表⽰，E ⽤式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表⽰某⼀给定给体与受60660R E R R=+ （1） 240D DA R const n J κφ?= （2）体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。
R 0可由式（2）计算：其中κ2 是⽅向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋⽩的量⼦效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。
fret反应原理
fret反应原理FRET（荧光共振能量转移）反应原理引言：FRET（荧光共振能量转移）是一种通过非辐射能量传递的现象，常被应用于生物学和化学领域。
本文将介绍FRET的反应原理，解释其在研究中的应用，并探讨其优缺点。
一、FRET的基本原理FRET是一种通过非辐射能量传递的现象，它发生在两个近距离的荧光染料分子之间。
在FRET中，一个荧光染料分子被激发到激发态后，能量会通过共振能量转移的方式传递给另一个接受体分子，使其进入激发态。
这个过程中，激发态的荧光染料分子会发射出荧光，并且接受体分子会吸收能量而不发出荧光。
二、FRET的应用领域1. 生物学研究FRET在生物学研究中有着广泛的应用。
通过将FRET染料标记在蛋白质或核酸分子上，可以实现对其在细胞中的定位、交互作用和结构变化的研究。
例如，通过将FRET染料标记在蛋白质的不同结构域上，研究人员可以观察到蛋白质的构象变化以及其与其他分子的相互作用。
2. 化学分析FRET在化学分析中也得到了广泛的应用。
通过将FRET染料标记在化合物上，可以实现对其浓度、环境pH值以及其他分子的检测。
例如，FRET技术可以用于药物传递系统的研究，通过观察荧光信号的变化，可以了解药物在体内的释放情况和靶向性。
三、FRET的优缺点1. 优点FRET技术具有高灵敏度和高分辨率的特点。
它可以在分子水平上研究生物分子的相互作用，并能够提供定量的信息。
此外，FRET还可以通过选择合适的染料对来实现多通道检测，扩展其应用范围。
2. 缺点FRET技术在实际应用中存在一些限制。
首先，FRET的效率受到染料间距离的限制，只有当染料之间的距离在几纳米范围内时，能量转移才会发生。
此外，FRET还受到染料的相对取向、光照强度和环境因素的影响。
这些因素可能导致FRET信号的误差和不稳定性。
结论：FRET作为一种通过非辐射能量传递的现象，已经广泛应用于生物学和化学领域。
它在生物学研究中实现了对生物分子的高分辨率观察和定量分析，同时在化学分析中也发挥了重要作用。
tef真菌基因
TEF (Transcription elongation factor) 是一种参与转录过程中的基因调控的蛋白质，它在真菌中广泛存在。
TEF蛋白负责促进RNA聚合酶在转录过程中的顺畅推进，在转录的早期和中期起到重要作用。
在真菌基因组中，TEF基因家族往往由多个成员组成，每个成员在不同的生物学过程中具有特定的功能。
TEF基因的序列和结构在不同的真菌物种间可能存在差异，但其保守性较高。
这些基因可以通过基因组测序和研究来进行识别和分析。
研究表明，TEF基因在真菌的生长、发育、适应性和致病性等方面发挥重要作用。
例如，TEF 基因在菌丝扩展、孢子产生和萌发等生命周期的各个阶段都参与调控。
此外，TEF基因也与真菌对环境压力的响应以及与宿主的相互作用等相关联。
对于某个具体的真菌种类或应用场景，需要根据该真菌基因组的特点，进行更具体的研究和分析，以确定其中的TEF基因并研究其功能和调控机制。
这种研究有助于进一步理解真菌的生物学特性和相关疾病的发生机制，为防治真菌相关疾病提供一定的理论依据。
FRET在生物科学中的应用
FRET在生物科学中的应用作者：文富来源：北大单分子与纳米生物学实验室时间：2007-12-4荧光共振能量转移（FRET）(Fluorescence / F?rster resonance energy transfer)是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用以及其它一些方面的研究中得到广泛应用。
当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态1-3。
光能可被生色团在10-15秒吸收而在10-9秒再发射出来。
然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级发荧光，这后一种现象称为荧光共振能量转移（FRET）。
FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。
当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。
荧光素在激发态的寿命是10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。
如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。
FRET 发生的基本条件是：①、供体和受体的距离必须达到一定的数量级（20-100à）②、受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠。
（见图1）③、供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。
F?rster依据供体与受体的相对距离和偶极子的方向关系解释了FRET发生的原理。
能量转移的效率是有一些参数决定的1-3，下面方程给出了能量转移的产效：E=R60/（R6+R60R 是供体与受体在生物条件下的距离R0是每对供受体之间的一个常数，代表能量转移的效率为50％时的距离。
R0称为 F?rster 临界距离，由下列公式计算：κ2表示偶极子方向因子（围从0-4；当供体和受体的排列是随机时κ2=2/3）QY D表示在没有受体时供体的量子产量n表示折射系数J(λ)表示光谱重叠积分J(λ）其中：= 受体淬灭系数 = 总荧光强度中供体荧光强度部分图 1：FRET光谱重叠积分示意图能量转移发生在供体受体距离在0.5-10nM之间。
荧光共振能量转移(FRET)技术在生物研究探究中的运用资料精
荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用高裕锋分析化学B200425012摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。
核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。
关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。
生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。
其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。
荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。
本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。
一、FRET基本原理[3]FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。
FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。
产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。
图1 产生FRET条件示意图FRET 的效率用E 表示，E 用式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表示某一给定给体与受60660R E R R=+ （1） 240D DA R const n J κφ−=⋅⋅⋅⋅ （2）体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。
R 0可由式（2）计算：其中κ2 是方向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。
蛋白检测篇9-FRET_修正版
编号：1-9主题：荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)概述：荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间的相互作用。
蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。
FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。
目的：1.活细胞内检测蛋白激酶活性；2.细胞凋亡的研究；3.受体激活效应在细胞膜上的横向扩散；4.膜蛋白的定位修饰；5.细胞膜受体之间相互作用；6.细胞内分子之间相互作用。
原理：荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
单分子fret测量
单分子fret测量单分子FRET测量是一种用于研究分子间相互作用的技术，它通过测量荧光共振能量转移（FRET）来揭示分子的结构和功能。
本文将介绍单分子FRET测量的原理、方法和应用。
一、单分子FRET测量原理荧光共振能量转移是一种非辐射能量传递过程，它发生在两个共振荧光染料之间。
在单分子FRET测量中，通常选择一个受体分子和一个给体分子，它们之间通过一个称为“桥链”的染料分子连接。
当给体分子被激发后发出荧光，如果受体分子与给体分子靠近并在适当的距离范围内，那么一部分给体分子的能量将通过FRET转移到受体分子上，导致受体分子发出荧光。
通过测量受体分子的荧光强度，我们可以推断出受体和给体分子之间的距离。
二、单分子FRET测量方法单分子FRET测量主要有两种方法：时间分辨FRET（TR-FRET）和频率分辨FRET（FR-FRET）。
1. 时间分辨FRET时间分辨FRET利用分子的荧光寿命差异来测量FRET效应。
给体分子和受体分子在受到光激发后，会分别发出荧光信号。
通过测量这两个信号的时间延迟，可以确定它们之间的FRET效应。
时间分辨FRET具有高分辨率和高灵敏度的优点，但需要复杂的实验装置和数据处理。
2. 频率分辨FRET频率分辨FRET利用分子的荧光发射光谱来测量FRET效应。
给体分子和受体分子发出的荧光信号具有不同的发射波长。
通过测量这两个发射波长的比值，可以确定它们之间的FRET效应。
频率分辨FRET相对简单易行，但分辨率较低。
三、单分子FRET测量应用单分子FRET测量在生物物理学和生物化学研究中有广泛的应用。
1. 蛋白质结构研究单分子FRET可以用于研究蛋白质的结构和构象变化。
通过将荧光染料标记在蛋白质的不同部位，可以测量蛋白质分子内部的距离和构象变化。
这对于揭示蛋白质的折叠过程、构象变化和功能机制非常重要。
2. DNA和RNA的结构和动力学研究单分子FRET可以用于研究DNA和RNA的结构和动力学。
FRET暨活细胞显微成像系统
荧光共振能量转移(FRET)影像系统Olympus（北京）销售服务有限公司上海分公司PDF created with pdfFactory Pro trial version 荧光共振能量转移(FRET)影像系统一、研究目的随着生命科学研究的不断深入, 光学显微镜使我们理解了细胞结构和有关功能。
但是分子 生物学研究已经显示了分子事件，例如信号传导和基因翻译，需要蛋白质的装配成特殊的大 分子复合体等。
对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质间相互作用的研究变得尤 为重要。
传统的生物物理或生物化学方法例如亲和色谱法或免疫沉淀反应法和近来的酵母双杂 交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法等，都需要破碎细胞或对细胞造成损伤，无 法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。
而基于强度的影像技术FRET方法，使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了，荧光 共振能量转移( FRET)是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。
根 据所基于的荧光显微镜配置不同而有不同的应用侧重，可在多细胞，单细胞，细胞膜，细胞 器等不同层次对生物大分子间的相互作用距离，动力学特性等进行研究。
二、FRET的原理和实现方法FRET的原理和发生的基本条件：1. 2. 3. 4. 发色团之间的距离在10A到100A 。
供体D的荧光光谱和受体A的吸收光谱足够多的重叠。
供体D的量子产率和受体A的吸收系数足够大。
D和A的跃迁偶极矩有最佳的相对取向，或者两者之一有一定的快速旋转的自由度。
FRET的实现方法：1) 稳态方法（基于供体、受体的三通道计算校准） 供体荧光的减弱－主要的方法 受体荧光的增强 激发光谱和吸收光谱的比较 2) 3) 光漂白方法 （Pb-FRET） 时间分辨方法（TR-FRET） 供体荧光的衰减 受体荧光的增长PDF created with pdfFactory Pro trial version FRET 特点：1) 动态实验，采集速度快 / 高速Shutter、高速CCD 2) 3) 4) 维持活细胞活性－CO2培养箱、恒温培养箱、恒温板 尽量减少光毒性，减少光照时间 保证长时间观察奥林巴斯 FRET 系统组成：1、显微镜 2、光源、高速荧光激发光切换控制和电动光闸 3、电动 XY 载物台 4、环境控制 5、高灵敏度冷 CCD 6、多种部件同时工作的控制软件 7、图像分屏器——DualView三、Olympus FRET系统详细技术参数一）显微镜：Optics 光学性能Ø 光学系统（Optical System）: 奥林巴斯 2005 年最新推出的 UIS2 无限 远光学系统（UIS2 Infinity optical system） （UIS2 光学系统具有的高光 透过率和全光谱范围的色差校正，及高信噪比的特点，非常适合荧光 方面的研究，可以说是目前最先进的光学系统之一） 光路设计: V型光路把反射时的光线损失减少到最小程度，保证最大光 通过量System Flexibility系统适应性Ø Ø Ø 光口: 双层多光口设计（奥林巴斯首创）保证了输入/输出灵活性，提 供 6 条射入/射出光路，最多可同时接 4 路采集原像的图像获取系统。
荧光探针的研究及应用
荧光探针的研究及应用随着科技的不断发展，荧光探针逐渐成为生命科学研究领域中不可缺少的重要工具。
荧光探针是一种能够发射出荧光信号的分子，在分子生物学、生物医学和化学生物学等领域中有着广泛的应用。
它们可以被用来研究细胞内的分子相互作用、识别生物分子、分析细胞功能，并可以在体内用作活体成像和药物筛选的工具。
本文将简要介绍荧光探针的基本原理、常见的荧光探针类型和其在生物学研究中的应用。
一、荧光探针的基本原理荧光探针的基本原理是荧光共振能量转移（FRET），其通过将荧光分子与生物分子（生物样品）耦合，使两者之间发生相互作用，从而产生能量转移。
FRET 能量转移是从能量接受者的激发态到另一个分子的荧光染料的发射态的一种非辐射性能量转移。
在FRET中，激发荧光染料的光子会被共振耦合到另一个染料的激发态，从而使其发出荧光光子。
这样，在激发荧光染料的时候，可以用荧光染料的荧光光子来检测另一个染料的存在和位置。
荧光探针对于荧光光子的发射特征和其它的生化参数是很敏感的，所以它们可以被用来探测各种细胞和分子。
二、常见的荧光探针类型1. 荧光染料：荧光染料是最常见的荧光探针类型之一，它们有着广泛的应用，可以被用来标记蛋白质、核酸等生物分子。
常见的荧光染料包括荧光素、草铵膦、偶氮染料等。
2. 荧光蛋白：荧光蛋白是一种具有自发荧光性质的蛋白质，其最早源自于水母Aequorea victoria。
荧光蛋白可以用来跟踪胞内或胞外的重要过程，如蛋白质、核酸合成、信号传递等。
3. 量子点：量子点是一种半导体纳米粒子，具有窄的发射光谱、强的光稳定性和较大的荧光量子产率。
这些特点使得量子点成为新一代高亮度及高灵敏度的荧光探针。
三、荧光探针在生物学研究中的应用荧光探针广泛地应用于细胞内信息传递、化学生物学、生物传感、药物筛选和临床诊断等方面。
以下为举几个常见的案例：1. 细胞内信息传递：荧光探针可被用于研究细胞内信号转导、磷酸化和蛋白质相互作用等过程。
荧光共振能量转移 相互作用 酶标仪
荧光共振能量转移 (FRET) 相互作用是一种重要的生物化学现象，它在许多生物学研究领域中都有着重要的应用。
而酶标仪是一种常用的实验仪器，用于检测和测量各种生物分子的浓度和活性。
本文将从荧光共振能量转移的基本原理、在生物学研究中的应用、以及酶标仪的工作原理和应用等方面进行介绍。
一、荧光共振能量转移的基本原理1. 荧光共振能量转移是指一个荧光分子的激发态能量通过非辐射能量转移的过程，被另一个非激发态的荧光分子吸收的现象。
在此过程中，有一个荧光分子的激发态能量转移到另一个荧光分子，从而导致后者产生荧光。
这种荧光共振能量转移的现象通常用于研究蛋白质、核酸和其他生物大分子的构象变化、相互作用、以及测定它们之间的距离等。
二、荧光共振能量转移在生物学研究中的应用2. 荧光共振能量转移在生物学研究中有着广泛的应用，例如用于研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与小分子的相互作用，以及在细胞内的功能和信号传导等方面的研究中。
荧光共振能量转移技术的发展，促进了生物学研究对分子相互作用、细胞信号传导以及疾病机制等方面的深入了解。
三、酶标仪的工作原理和应用3. 酶标仪是一种用于检测生物分子浓度和活性的仪器，它基于酶标记技术，利用酶和底物之间的特异性反应来测定样品中生物分子的浓度。
酶标仪通过光电检测技术，将样品中的荧光、吸光度等信号转换成可视化的数据，从而实现对生物分子的定量分析。
四、荧光共振能量转移与酶标仪的结合应用4. 荧光共振能量转移技术与酶标仪的结合应用，拓展了酶标记技术在生物学研究中的应用范围。
利用荧光共振能量转移技术可以实现对生物分子的高灵敏度、高通量的检测分析，结合酶标仪的定量测量功能，可以实现对生物分子浓度和活性的精准测定，极大地促进了生物学研究的深入发展。
五、结语在生物学研究领域中，荧光共振能量转移技术和酶标仪的结合应用，为科研工作者提供了强大的工具，促进了对生物分子相互作用、疾病机制和细胞信号传导等方面的深入研究。
荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展
荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展一、本文概述荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种在分子尺度上测量距离和相互作用的强大技术，广泛应用于生命科学领域。
FRET依赖于两个荧光分子间的非辐射能量转移，当两个荧光分子足够接近时，一个荧光分子（称为供体）可以通过偶极-偶极相互作用将其激发态能量转移给另一个荧光分子（称为受体）。
由于能量转移效率与供体和受体之间的距离紧密相关，因此，FRET可以被用作一种灵敏的分子尺度的距离探测器。
本文将对荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及其研究进展进行全面的探讨，旨在展现这一技术在生物学、医学等领域中的重要作用和潜在价值。
二、FRET技术的基本原理荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射性的能量转移过程，它发生在两个荧光分子之间，其中一个分子（称为供体）在激发状态下，能够将能量转移给另一个邻近的且激发态能量较低的荧光分子（称为受体）。
这一过程的发生需要供体和受体之间的距离足够近，通常在10纳米以内。
当供体被光激发后，它的电子会从基态跃迁到激发态，如果这个激发态的能量高于受体的基态与激发态之间的能量差，那么供体就可以通过偶极-偶极相互作用将能量传递给受体，使其从基态跃迁到激发态。
受体随后会以发射荧光的形式释放能量，返回到基态。
FRET技术的关键参数包括能量转移效率、供体与受体之间的距离以及供体和受体的相对光谱重叠程度。
能量转移效率通常与供体和受体之间的距离的六次方成反比，这意味着当两者之间的距离稍有增加时，能量转移效率会迅速下降。
因此，FRET对距离的变化非常敏感，使得它成为一种强大的工具，能够用于研究分子间的相互作用、蛋白质构象变化以及生物分子间的动态过程。
FRET技术还可以通过比较供体和受体的荧光信号强度来定量测量分子间的距离，从而揭示生物分子间的相互作用机制。
例如，在蛋白质相互作用的研究中，可以通过将供体和受体分别标记在两个不同的蛋白质上，观察它们之间的FRET信号变化来推断蛋白质之间的结合和解离过程。
fret质粒
fret质粒
FRET（Forster共振能量转移）质粒是一种用于研究生物学分子相互作用的质粒，它通过共振能量转移的原理，实现对目标分子的实时、定量检测。
FRET质粒通常包含两个荧光蛋白，一个是供体蛋白，另一个是受体蛋白。
供体蛋白在特定波长下发光，当与受体蛋白靠近时，供体蛋白的光能转移到受体蛋白，使其发光。
通过检测受体蛋白的发光强度，可以推测供体蛋白与受体蛋白之间的距离和相互作用强度。
FRET质粒在生物学研究中的应用主要包括：
1. 研究分子间的距离：通过测量供体和受体荧光信号的强度，可以计算出它们之间的距离。
这种方法被称为“FRET距离测量法”。
2. 研究分子间的相互作用：当分子间的距离发生变化时，FRET效率也会发生变化。
因此，可以通过观察FRET效率的变化来研究分子间的相互作用，如蛋白质与蛋白质、核酸与核酸等。
3. 细胞内分子定位：将FRET质粒引入目标细胞，通过观察荧光信号的分布，可以确定目标分子在细胞内的位置。
4. 基因表达调控研究：将FRET质粒与目标基因的表达调控区域结合，可以实时监测基因表达水平的变化。
5. 药物筛选：利用FRET质粒筛选药物作用靶点，通过观察药物作用后FRET信号的变化，判断药物是否能与靶点结合以及结合效果。
总之，FRET质粒作为一种研究工具，在生物学领域具有广泛的应用价值。
通过使用FRET 质粒，科学家可以更深入地了解分子间的相互作用，为生物科学研究和药物开发提供重要信息。
荧光共振能量转移技术的应用
荧光共振能量转移技术的应用荧光共振能量转移技术，又称FRET技术（Förster Resonance Energy Transfer），是一种在生物医学领域广泛应用的技术，它利用分子间能量的传递来研究蛋白质、细胞及其各种生物分子的结构和功能。
FRET技术的应用涵盖了生物医学研究的许多领域，如药物发现、疾病诊断、蛋白质交互作用研究等，因此，FRET技术被认为是生物医学领域的重要技术之一。
FRET技术的基本原理是利用发射光与吸收光之间的相互作用来传递能量。
FRET现象的发生需要两个荧光分子，一个是受体分子（也称接受者），另一个是供体分子（也称激发物）。
当供体分子被激发时，它的激发态能量可以传递给受体分子，导致受体分子发生荧光发射。
这种荧光发射的能量是低于供体分子的能量的，这表明能量已经被传递给了受体分子。
FRET技术通过测量物质之间荧光发射的变化来确定分子间的距离和相互作用。
FRET技术在药物发现中的应用日益突出。
药物发现是一项复杂的过程，需要了解药物分子和靶分子之间的相互作用。
使用FRET技术可以探测药物分子和靶分子之间的相互作用，并且可以通过荧光发射能量的变化来确定药物分子的结构和功能。
FRET技术的应用可以加速药物发现的速度和效率，并且可以减少在药物发现中的试错次数。
除了在药物发现中的应用外，FRET技术还在生物医学领域的疾病诊断中发挥着重要的作用。
例如，FRET技术可以用于患者体内对某些分子的检测。
例如，FRET技术可以检测已经被标记的癌细胞，特别是早期癌症病人的癌细胞，通过治疗后观察癌细胞的减少情况，可以评估治疗效果。
这种方法可以大大减少对病人的伤害，并且提高癌症诊断的准确性。
FRET技术还在研究蛋白质和细胞的交互作用中发挥着重要作用。
蛋白质和细胞间的相互作用是生命活动中的重要过程，研究这些过程有助于揭示生命活动的机理并且进一步发现治疗疾病的方法。
FRET技术通过测量荧光信号来研究蛋白质和细胞的交互作用。
fret荧光共振能量转移原理
fret荧光共振能量转移原理FRET (Förster Resonance Energy Transfer)荧光共振能量转移原理一、引言FRET (Förster Resonance Energy Transfer)荧光共振能量转移原理是一种重要的生物物理学现象，通过这一原理，我们可以揭示分子间的距离、结构和相互作用等信息。
本文将对FRET原理进行详细介绍，并探讨其在生物科学中的应用。
二、FRET原理的基本概念FRET是指一种非辐射能量传递过程，它基于荧光染料之间的相互作用。
在FRET过程中，一个荧光染料（受体）吸收另一个荧光染料（供体）发出的光子能量，从而激发自身发出荧光。
FRET效应的强弱与供体和受体之间的距离、取向以及相互作用强度有关。
三、FRET原理的物理机制FRET原理的基础是两个荧光染料之间的相互作用。
当供体与受体之间的距离在几纳米到十几纳米范围内时，FRET效应将发生。
在这种情况下，供体吸收的光子能量将以非辐射的形式传递给受体，使其发出荧光。
FRET原理的物理机制可以通过以下步骤来解释：1. 供体吸收光子能量，跃迁到激发态。
2. 激发态的供体通过非辐射的机制将能量转移给受体。
3. 受体接收到能量后，跃迁到激发态并发出荧光。
四、FRET原理的应用FRET原理在生物科学中有广泛的应用，以下是几个典型的应用领域：1. 蛋白质相互作用研究：通过标记荧光染料在蛋白质上，可以实时监测蛋白质之间的相互作用，揭示其结构和功能。
2. 细胞信号传导研究：通过标记荧光染料在细胞内，可以研究细胞信号传导的动态过程，如钙离子浓度的变化等。
3. DNA杂交研究：通过标记荧光染料在DNA上，可以研究DNA杂交的过程，如DNA的复制、转录和修复等。
4. 药物筛选与评价：通过标记荧光染料在药物分子上，可以研究药物与靶分子之间的相互作用，评价药物的活性和选择性。
五、结论FRET荧光共振能量转移原理是一种重要的生物物理学现象，它可以揭示分子间的距离、结构和相互作用等信息。
荧光共振能量转移技术及其在生物分析中的应用研究
荧光共振能量转移技术及其在生物分析中的应用研究随着生物分析技术的不断发展，荧光共振能量转移技术成为了其中的一项重要技术手段。
本文将从荧光共振能量转移技术的基础原理介绍、技术优势、应用案例及未来发展趋势等方面展开分析。
一、荧光共振能量转移技术的基础原理介绍荧光共振能量转移技术（FRET）可以简单地理解为一种通过特殊光源激发两种荧光染料相互之间的能量传递过程。
这两种荧光染料中处于高能级的Donor（给体）染料受到激励后可以将其能量传递给处于低能级的Acceptor（受体）染料，使得Acceptor染料也被激发并发出荧光。
这种过程需要在两种染料非常靠近的距离内才能发生，这就要求荧光染料的选取具有一定的空间位阻或分子锁定能力。
因此，FRET技术被广泛应用于生物分析领域，例如DNA杂交、蛋白质相互作用、细胞内信号转导等研究中。
二、荧光共振能量转移技术的优势与传统的生物分析技术相比，FRET技术具有超高的分子检测灵敏度和高空间分辨率。
其核心原理是通过特定的发射波长和波长范围激发Donor染料，然后在Acceptor范围内探测反射回的光子。
这种技术可以用于研究不同分子之间的相互作用，如蛋白质相互作用、细胞内动力学等。
同时，FRET技术还非常适用于高通量检测和分析，这正好满足了现代生命科学领域的需求！三、荧光共振能量转移技术的应用案例应用FRET技术可以研究生物分子的结构、特性和相互关系，为现代生物学研究和化学生物学研究提供了一项有力工具。
FRET技术在生物学和医学领域已经得到了非常广泛的应用，例如肿瘤细胞诊断、抗药性分析、药物筛选等。
为了更好的展示其优势，我们将从三个应用案例来阐述：分子识别、蛋白质相互作用和钙离子探测。
3.1 分子识别分子识别是生物研究的重要目标之一，而FRET技术可以提供非常高效的分子识别方法。
具体为：Donor和Acceptor标记分别标识待测分子的两个不同的侧链基团，当分子存在时，这些基团会靠近，使得Donor和Acceptor分子之间的距离缩短，FRET信号就会相应增强。
光生物学中的单分子荧光技术
光生物学中的单分子荧光技术是一项用于分析单个蛋白质分子的技术，被广泛用于生物分子的研究中。
它的原理是使用荧光染料标记生物分子，然后通过显微镜观察单个分子在不同时间和空间的位置和行为，以了解它们的功能和结构。
单分子荧光技术的主要优势在于它可以在不破坏生物分子结构的情况下观察单分子反应动力学和活性。
同时，单分子荧光技术可以提供分子内部信息，如相互作用、构象变化等。
因此，它被广泛应用于蛋白质分子的结构、功能和相互作用机制的研究中。
单分子荧光技术通常分为三类：单分子荧光显微术、单分子荧光共振能量转移（FRET）和单分子光学转移（PALM）。
单分子荧光显微术是最早被开发的一种单分子荧光技术，它通过将荧光染料直接标记在生物分子上，并与样品进行激光聚焦，在极大的抑制背景荧光下，可以实现对单个蛋白质分子的可视化。
具体地，当分子被激发时，荧光染料会发出荧光光子，并被显微镜探测到。
单分子荧光显微术通常可以观察到分子的扩散、运动和环境变化等细节，从而解决了集群研究方法无法解决的问题。
但由于单分子荧光显微术会给生物分子造成辐射性损伤，从而影响其自然状态，因此，需要谨慎对待，并确定使用该技术是否能够达到所要求的生物学分辨率和时间分辨率要求。
单分子荧光共振能量转移（FRET）是一种通过测量荧光染料之间相互作用的能量转移来分析分子相互作用的技术。
这种技术通常用于测量蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用等。
具体地，荧光染料之间的能量转移会发生荧光强度衰减，而该衰减的程度可以分析标记分子的距离和互相作用的改变。
单分子荧光技术结合了FRET的特点，可以在生物单分子水平上分析分子间的互作用，从而解决了传统的测定受体/配体，药物-受体，酶-底物，核酸-蛋白等的相互作用方法存在的高度的空间平均值可能掩盖了从分子水平和局部环境变化信息的问题。
单分子光学转移（PALM）则是一种使用单分子荧光技术实现光学成像的方法。
与传统的显微镜成像不同，PALM通过从不同的角度和方向对样品进行多次拍摄和分解，从而获得样品的高分辨率图像。
荧光共振能量转移（FRET）
什么是荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术？荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。
蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。
FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。
一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①供、受体的激发光要分得足够开；②供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
fret技术原理 -回复
fret技术原理-回复FRET (Foerster Resonance Energy Transfer)技术原理引言：FRET（Foerster Resonance Energy Transfer）是一种常用的光物理学和生物技术中的方法，用于研究分子间的相互作用和能量传递。
FRET技术利用分子间的蛋白质-蛋白质或蛋白质-荧光染料间的相互作用，通过荧光共振能量转移从一个荧光蛋白或荧光标记激发到另一个标记，从而实现间接测定分子的位置、接触、结合和动力学等信息，已广泛应用于生物医学研究中。
第一部分：FRET的原理和基本概念（400字）FRET的原理是通过分子间的电偶极作用来传递能量。
当两个荧光染料处于特定的距离范围内时，能量从一个染料（供体）通过非辐射转移到另一个染料（受体）。
供体的能态被激发至受体的能态，并发射出荧光。
此过程涉及到在不同电子能级间的共振能量转移，通常以弗例传导形式进行。
FRET的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，但受到供体和受体的相对位置、受体的荧光量子产率和量子产率的荧光发射率等因素的影响。
第二部分：FRET的关键组分（600字）FRET实验中关键的组分是供体和受体，这两个组分通常由蛋白质或染料充当。
供体是第一个荧光标记，它可以被激发并转移能量给受体。
通常使用的供体包括绿色荧光蛋白（GFP）或染料（如吡啶染料）等。
受体是第二个荧光标记，它在接受到能量后会发出荧光信号。
通常使用的受体包括红色荧光蛋白（RFP）或染料（如吡啶染料）等。
供体和受体之间的选择需要注意它们之间的共振能量转移效率以及荧光光谱重叠的程度。
衡量两个标记的适用性是通过计算FRET效率或FRET比的数值。
第三部分：FRET的应用（600字）FRET技术在生物科学研究中有广泛的应用。
首先，FRET可用于研究蛋白质的解离和结合过程。
通过标记所需的蛋白质或分子，可以通过测量FRET 信号来获得两者之间的距离变化情况，以研究它们之间的结合机制。
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FRET在生物科学中的应用作者：文富来源：北大单分子与纳米生物学实验室时间：2007-12-4荧光共振能量转移（FRET）(Fluorescence / Förster resonance energy transfer)是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用以及其它一些方面的研究中得到广泛应用。
当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态1-3。
光能可被生色团在10-15秒吸收而在10-9秒再发射出来。
然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级发荧光，这后一种现象称为荧光共振能量转移（FRET）。
FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。
当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。
荧光素在激发态的寿命是10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。
如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。
FRET 发生的基本条件是：①、供体和受体的距离必须达到一定的数量级（20-100À）②、受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠。
（见图1）③、供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。
Förster依据供体与受体的相对距离和偶极子的方向关系解释了FRET发生的原理。
能量转移的效率是有一些参数决定的1-3，下面方程给出了能量转移的产效：E=R60/（R6+R60R 是供体与受体在生物条件下的距离R0是每对供受体之间的一个常数，代表能量转移的效率为50％时的距离。
R0称为Förster 临界距离，由下列公式计算：κ2表示偶极子方向因子（围从0-4；当供体和受体的排列是随机时κ2=2/3）QY D表示在没有受体时供体的量子产量n表示折射系数J(λ)表示光谱重叠积分J(λ)其中：= 受体淬灭系数= 总荧光强度中供体荧光强度部分图1：FRET光谱重叠积分示意图能量转移发生在供体受体距离在0.5-10nM之间。
供受体分子之间存在电荷-电荷库仑力作用，激发态的供体对于受体的作用是偶极子-偶极子的电动力学空间作用。
如果条件具备：供受体的激发谱、吸收谱相互重叠，供体的量子产量和受体的吸收系数适当、方向合适就极有可能发生能量转移。
能量转移的速率和供受体的距离有函授关系（与距离达到六次方的倒数成比例）能量转移后供体回到基态、光子发射可能性减少，供体的激发态寿命减短，受体可因受激发而发出光子，尽管起初是由供体激发的，我们检测到的荧光光谱却是由受体发出的。
我们可以从能量转移的速率和效率得到许多信息：可以知道供受体的距离很近（约0.5-10nM），得到距离的数量，有时能得到它们的方位关系。
一般地每一对供受体可被分别考虑，每对都由于其特殊的距离和方位和光谱特征而表现出其能量转移的可能性，这就使我们能直接掌握分子的结构、空间构象变化和结合反应。
如果我们观察的是一个分子集合，我们得到的是对应于相关参数分配的光谱信息。
这种光谱参数分配能提供分子构象分配情况信息。
能量转移是一个时间依赖过程，我们能够得到的有关发生在能量转移和荧光衰减时间数量级、分子运动和分子转动的动力学信息，这个数量级可以是皮秒到毫秒数量级。
这是一个非常广的时间区段，可以灵活地选择生色团。
在所有荧光技术中，FRET的独特性就在于此。
在多数情况下，供体与受体染料是不同的，FRET的可以通过对供体的荧光淬灭和受体的敏化荧光的产生来检测。
当供体和受体是相同的染料时，可通过荧光的去极化来检测。
因为R0是受环境影响的，在实际中具体的实验条件下它的值是可变化的。
不产生荧光的受体比如dabcyl和QSY染料的优势在于能够减少可能由受体本身直接产生的荧光背景的干扰。
对于相互作用的分子之间的FRET分析往往受到供受体荧光素各组分之间的相互影响并影响FRET的效率。
比如：如果所有的供体都与一个受体结合了，供体荧光寿命就随两者距离的改变而呈一次幂变化。
但在一种混合状态，有不同的供受体距离或有未结合的供体得到的是荧光寿命衰减的多次幂变化，未发生作用的分子对FRET的效率产生影响。
高的FRET 效率和低的相互作用分子浓度可导致一个错误推论认为在供体受体之间有小的或没有相互作用。
如果蛋白相互作用的细胞定位空间大小超出了显微成像的分辨率，那么我们获得的是一种平均值，也会导致对生物效应的错误解释16。
多光子显微技术尤其是双光子技术比共聚焦显微镜更有优势。
使用近红外激发光引起探针荧光素的非线性吸收，因而激发光在聚焦镜平面的强度被限制在一个小的剂量围，荧光淬灭和光对样品的损伤大大减少，对于光敏感的样品的观察也成为可能。
用FLIM(fluorescence lifetime imaging microscopy)是一种较新的检测FRET的方法2。
FLIM技术有两种：时间域(time-domain)和频率域(frequency-domain)。
①、时间域是短的脉冲光激发样品，荧光信号强度作为时间的函数。
最新的TCSPC(time–correlated-single-proton-counting )技术与多光子激发系统的结合使得分辨率达到在组织和细胞飞升（femto-litre）的水平。
TCSPC的原理：样品被脉冲的激光重复激发，而每次脉冲激发的能量远不能引起一个光子发射。
光子检测器能启动定时器，并在下一次脉冲到来时停止计时此过程反复重复，就得到了荧光衰减的直方图。
TCSPC被认为比较费时间，但TCSPC以其近乎理想的计数效率和低的激发光剂量（减少荧光淬灭和毒性作用）以及高的时间分辨率而优于现有的其他方法。
在计数速度为1MHZ时，获得10000个光子花20毫秒，一个128*128像素的图象在3分钟完成，这样得到的信躁比要比那些靠牺牲分辨率来提高速度或为了缩短时间而牺牲信躁比要更优越。
②、频率域原理：样品被强度调制的激发光激发，激发光的频率和样品荧光寿命的倒数成比例。
这时荧光的发射频率与调制的频率一致，时间变化和解调也与激发光一致，可用来计算荧光寿命。
这种技术被广泛应用在远场和共聚焦显微技术上。
生物科学的一个巨大挑战就是决定组成生物结构的分子或超分子的空间距离和分布，许多的生物现象是发生在相互作用分子的界面上，能够告诉我们有关分子相互作用的技术对我们非常重要。
一旦相互分离的的目标空间排列被明确、距离和相互的方向明确了，我们就更能确信地提出生物结构是如何发挥作用的设想并证实它。
对于空间关系的了解也使我们能更好地解释动态现象，知道了一部分结构的空间位置帮助我们进一步提出一些分子间相互作用的具体的问题。
FRET被广泛应用的原因是它提供了分子间的距离、方向（定位）和动力学特征的信息，更好地回答有关分子距离数量级的问题。
FRET的应用：⑴、可用于研究蛋白质以及蛋白复合体的结构和空间构象与布局Xing J用FRET研究了肌凝蛋白亚结构（A S1）部的运动情况5。
他们把DABMI连接于CYS374上，作为受体荧光素，再用两种不同的荧光素IAEDANS和MIANS先后标于SH1和SH2上。
在紧态的AS1中，当用MIANS作为供体荧光素时，SH1和SH2两个位点的距离大致相等（45À），而加入ADP和Vi(orthovanadate)后，CYS374和SH1的距离缩短了7-8A，而SH2与CYS374的距离未见变化。
当以AEDANS作为能量供体荧光素时得到类似的结果。
结论为MgADP和Vi导致了SH1向肌动蛋白的位点运动而SH2对于S1相对饱和的激动位点不敏感而不发生相对运动。
Yin Luo4等人用FRET结合几何分析手段研究了兔子骨骼肌肌钙蛋白的四级结构和IN1-INC 二聚体（TN1）上的突变CYS133相对于INC 上九个突变CYS的定位情况，分别就钙离子存在和不存在两种情况进行比较，用（1，5-IAEDANS）作为荧光供体，DAB-MAL或DDP-MAL为荧光受体通过FRET测量CLYS133和每个INC上的突变CYS残基的距离，再用数学方法处理INC晶体结构数据和FRET测量值，得到各CYC残基在IN中的定位。
该结果对于揭示IN1在IN复合体中的定位以及IN的功能有很大的提示作用。
Erickson JW6等用FRET确定在转导蛋白上鸟苷酸结合位点（α-T）的赖氨酸残基与CGMP 磷酸二脂酶γ亚基（γ-PDE）构象敏感位点的半胱氨酸残基（68残基）的位置关系。
半胱氨酸残基（68残基）在γ-PDE的位点对于有活性或失活的α-T的结合敏感而引起构象改变。
这一点被实验所证实：将α-T-GDP复合体加入被对环境敏感的探针（MIANS）标记的γ-PDE 亚基能引起MIANS荧光的增强，而氟化铝使α-T-GDP激活后再结合到γ-PDE时会导致MIANS荧光的淬灭。
氟化铝引起的MIANS-γ-PDE的荧光变化的时间和α-T的部荧光的变化相一致，而这一时间也对应于α-T活性空间构象变化的时间。
这些结果提示活化状态的α-T亚结构导致了临近的γ-PDE的半胱氨酸残基（68残基）结合位点的空间结构的变化。
Christoph Biskup14等用confocal和streak照相机观察了钠离子通道亚单位之间的关系。
钠离子通道在可兴奋组织可形成动作电位，它由一个孔状的α 亚基和β亚基组成α亚基能单独发挥功能。
人心肌的钠离子通道β1亚基仅仅对α亚基有轻微影响，它帮助提高峰电位的强度以及加速从失活状态恢复。
峰电位的强度的增加提示β1亚基导致了质膜上通道的密度增加，可以猜想α亚基在向质膜转运的过程是在早期已经和β1亚基结合。
为了证实这个猜想，他们用了能提高FRET效率的方法：固定模式的激光、共聚焦显微镜和streak照相机。
两个亚单位分别用兰色和黄色荧光蛋白标记，在人的胎肾细胞（HEK293）表达。
质网膜的通道亚基之间的FRET表明两亚单位在到达质膜之前就已经结合了。
该方法能同时测量供体和受体的荧光的衰减并提供了测量FRET效率的有效方法。
⑵、研究蛋白质的折叠蛋白质折叠是一个非常繁杂的过程，因为它涉及到大量的途径来将无数去折叠构象连接成为唯一的天然构象。
在用实验方法来探索各个途径所占比例的漫长过程中，FRET已经能够测量自由状态的单分子蛋白折叠的表面自由能特征，这些数据在分子集合是难以得到的。
受体/配体相互作用。
Benjamin Schuler15等将一个绿色供体染料和一个红色受体染料连接在冷休克蛋白（CspTm）（来源于超嗜温细菌Thermotoga maritime）的氨基和羧基端的半胱氨酸残基上。