牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究
花生蛋白的提取工艺
碱性蛋白酶提取花生水解蛋白 摘要： 利用碱性蛋白酶从冷榨花生饼中提取花生水解蛋白。研究了温度、pH 值、加酶量、液固比、水解时间对蛋白质提取率的影响,确定最佳工艺参数为温度55 ℃、pH9.0、加酶量是0.8%、水解时间3 h、液固比7∶1, 在此条件下蛋白质提取率为81.32%。 1、材料与方法 （1）实验材料 冷榨花生饼(蛋白质48.09%, 脂肪8.74%, 粗纤维 4.71%); 碱性蛋白酶(2.4 AU/g)； 主要仪器设备： SC- A型精密恒温水槽, 868 型酸度计, 78- 1 型磁力搅拌器, UV- 2100 紫外可见光分光光度计, 酶反应器。 （2）实验方法 花生水解蛋白的提取：一定质量花生饼(粉碎过80 目筛)与蒸馏水按一定比例加入酶反应器中, 恒温搅拌一定时间, 调节pH 值至适宜, 加入一定量酶进行水解, 并维持反应液pH恒定(变化范围±0.01)。反应结束后, 沸水浴中灭酶5 min, 3000 r/min 离心20min, 收集上清液, 残渣用2 倍体积水洗涤, 合并两次离心所得上清液, 计量体积, Folin- 酚法，测定其中蛋白含量。
蛋白质提取率的计算： 花生蛋白提取率(%)=(提取的上清液蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100% 2、结果与分析 （1）温度对蛋白质提取率的影响在加酶量0.4%,pH8.0, 液固比7∶1, 水解时间 3 h 时, 考察了温度对蛋白提取率的影响, 结果如图 1 所示。 由图1 可知, 随着温度升高, 蛋白质提取率逐渐提高, 当温度达到55 ℃, 蛋白质提取率最高。当温度>55 ℃时, 随温度升高蛋白质提取率反而降低, 其原因可能是超过酶最适温度, 酶分子空间结构发生改变, 导致酶活性减弱或丧失。（2）pH 值对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了pH值对蛋白提
乳铁蛋白和牛初乳
乳铁蛋白与牛初乳 乳铁蛋白极其广阔的市场前景，吸引了多家国际原料供应商投入巨资进行大规模的商业化生产，而这其中 一、安全保障： 1、做得最好的是荷兰的DMV公司，为全球最大的乳铁蛋白供应商，欧洲绝大部 分奶粉所采用的乳铁蛋白即由其供应。 2、其所生产的乳铁蛋白纯度高达95%，是目前全球唯一一个通过美国FDA的GRAS 认证的乳铁蛋白原料，具有极高的安全性。 3、因此荷兰DMV是美国FDA大量乳铁蛋白临床试验的乳铁蛋白原料供应商。 4、我国的江苏四环生物股份有限公司与荷兰DMV合作推出了全国首款且唯一具 有国家食品药品监督管理局保健食品认证的乳铁蛋白产品 5、2011年6月1日卫生部颁布新的食品安全法规，将乳铁蛋白从食品添加剂升为营养 强化剂，强化婴幼儿营养。 6、上市制药企业生产，质量保证 四环医药： 江苏四环生物股份有限公司，是在深圳证券交易所上市的大型制药企业，注册资本10个亿，股票代码000518. 7、国家认证证书
三、保健功能（功能性）： ◆抗微生物/抗病毒活性；◆参与铁的代谢；◆消炎作用；◆抗氧化功能 1、抗微生物活性 有报道表明乳铁蛋白可以抑制多种细菌、真菌、寄生虫和病毒生长发育，具有较广谱的抗病毒性能，包括脊髓灰质炎病毒，单纯疱疹病毒，丙型肝炎病毒，艾滋病毒，人巨细胞病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒，轮状病毒及猫杯状病毒。 发生的机理有几种。乳铁蛋白具有结合铁离子的能力，而铁离子为许多微生物生长所必需，这样，乳铁蛋白可以通过结合铁离子使其周围的铁离子浓度大大降低，从而抑制了微生物的生长。 不仅如此，乳铁蛋白还可以形成抗微生物的肽，这些肽能破坏或者穿过细菌。Saito等人研究发现，牛乳铁蛋白在酸性条件下加热产生的水解物（肽）具有抗菌活性，这一活性的最佳水解度约为10%（pH2.0，在120℃加热15分钟水解）。与原乳铁蛋白相比，这些水解物没有结合铁的能力，且在富含铁的基质中也能很好地保持活性，其抗菌活性与铁的螯合无关，因此其抗菌机理不同于乳铁蛋白。进一步的假设机理则是其本身结合到细菌的细胞膜上，改变细胞的渗透性，导致细菌死亡。 可能是由于乳铁蛋白能阻止病毒与宿主细胞的结合，乳铁蛋白表现出在体外实验条件下降低各种病毒的活性。要深入了解乳铁蛋白在阻止病毒感染中的作用还需要在人体内作进一步的研究。 参与铁的代谢 乳铁蛋白与转铁蛋白（人体中主要的铁传递蛋白）相似性暗示其可能在正常的铁代谢途径中起重要作用。近期的研究结果却显示事实并非如此。乳铁蛋白可能在感染和发炎时在人体的铁代谢中起重要作用。 2、消炎功能 如今，乳铁蛋白可直接影响发炎反应的猜想已获证实。乳铁蛋白具有结合LPS（脂多糖）的能力。LPS是一种细菌内毒素，是细菌感染引起发炎时重要的介质。乳铁蛋白与LPS的结合将阻止LPS与其受体结合，从而减少发炎细胞因子。乳铁蛋白另外一个抗发炎效应是通过与发炎部位的铁结合从而阻止有害自由基的产生。 3、抗氧化功能 由于具有结合铁离子的能力，乳铁蛋白可能具有抗氧化的功能。在组织受损产生自由基的过程中，铁作为重要的催化剂。自由基可促进多种疾病的发生和机体的老化。现在已知自由基在疾病发展和老化过程中扮演着重要的角色。自由基产生于身体受损损伤，如感染或者发炎的部位。这些部位的铁离子能加速自由基的生成。乳铁蛋白在这些部位结合铁离子起到局部抗氧化的作用。 乳铁蛋白可能是乳汁中最重要的生物活性物质，对保护机体、治疗疾病都有重要作用。
【CN109796529A】一种胶原蛋白及其提取方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257876.7 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 武汉轻工大学 地址 430023 湖北省武汉市汉口常青花园 学府南路68号 (72)发明人 徐玉玲 汪海波 何浪 李盛 张军涛 未本美 (74)专利代理机构 北京思创大成知识产权代理 有限公司 11614 代理人 高爽 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称一种胶原蛋白及其提取方法(57)摘要本发明公开了一种胶原蛋白及其提取方法。该方法包括如下步骤：1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；3)将胶原蛋白溶液透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。本发明采用冷冻研磨预处理方法，在液氮中预先冷冻含有胶原蛋白的动物组织一段时间，利用研磨仪在一定频率下研磨成粉末，该方法处理后，三螺旋结构及热变性温度并未受影响，能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，比原有不冷冻研磨的酸提法的提取率提高18％-82％，这对于胶原应用及胶原基生物材料 的应用具有重要意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109796529 A 2019.05.24 C N 109796529 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109796529 A 1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨； 2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液； 3)将胶原蛋白溶液盐析、透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。 2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，进行步骤1)之前，还包括预处理步骤： 将含有胶原蛋白的动物组织脱脂、除杂蛋白后，干燥。 3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中， 所述含有胶原蛋白的动物组织为哺乳动物皮和/或鱼类皮； 所述胶原蛋白为哺乳动物皮胶原蛋白和/或鱼皮胶原蛋白。 4.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，冷冻的时间为16～32h。 5.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为3-25min。 6.根据权利要求5所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为10-20min。 7.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的频率为10～25HZ。 8.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤2)中，酸/酶法提取胶原蛋白的步骤包括： 将研磨后的样品使用0.4～0.6mol/L乙酸浸泡并搅拌3～5d，再加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为1.5～2.5％，搅拌16～32h后得到胶原蛋白溶液。 9.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤3)中，所述透析的时间≥3d。 10.由权利要求1-9中任意一项所述的胶原蛋白提取方法得到的胶原蛋白。 2
转铁蛋白试验(长征医院)
便隐血转铁蛋白临床实验应用体会 宓庆梅上海市长征医院 粪便隐血试验是检测消化道出血的一个重要指标，检测方法选择的不同会直接影响判断消化道是否出血和出血的程度。目前，常规的检测方法有化学法（邻甲联苯胺法）和血红蛋白法（单克隆免疫法）。化学检测法中，易产生假阳性，并且敏感性偏底，对于消化道内的微量出血不易测出；血红蛋白法中，敏感性强，可以检测出很微量的出血情况，但是，消化道内大量出血反而会导致假阴性的结果。便隐血检测是美国最常使用的结肠癌和直肠癌普查初筛试验，也是目前唯一通过随机临床试验证实的，可以降低结肠癌和直肠癌所致死亡的检查，实施每年粪便隐血检测可以早期发现结肠癌和直肠癌的发生，可以降低30%的结肠癌和直肠癌患者的死亡率。本文对化学法、血红蛋白法和转铁蛋白法三种便潜血检测方法抗体法进行了比对试验。用单克隆胶体金显色技术，以试纸条一步法检测粪便中血红蛋白，有较高的敏感性和特异性。转铁蛋白单克隆抗体法试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、抗转铁蛋白单抗金标垫、玻璃纤维样品吸液层组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条转铁蛋白单抗反应线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水板，另一端端头为玻璃纤维样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和抗转铁蛋白单抗金标垫相互交叠连接，在抗转铁蛋白单抗金标垫上压有玻璃纤维样品吸液层。当人尿液、粪便中带有转铁蛋白抗原时，样品中转铁蛋白抗原可与抗转铁蛋白单克隆抗体金标探针发生特异结合而被抗转铁蛋白单克隆抗体识别，即发生双抗夹心特异结合，因而可测定尿液、粪便中的转铁蛋白含量。 1.材料和方法 1.1试剂： 1.1.1邻甲联苯胺试剂：邻甲联苯胺1g，溶于50ml冰醋酸和50ml无水乙醇的混合液中，置于4℃冰箱中，避光保存；3%过氧化氢液。 1.1.2粪便血红蛋白胶体金试剂盒（简称WH试纸条）：万华普曼生物工程有限公司提供的万华牌“消康保”试纸条。 1.1.3转铁蛋白单克隆抗体法试剂盒：万华普曼生物工程有限公司提供的万华牌“消康保”试纸条。 1.2标本来源：本院2008年1月至3月的住院患者随机132例粪便，男81例，女51例，年龄为27岁至71岁。 1.3方法：
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。
胶原蛋白的提取方法
胶原蛋白的提取方法 胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。迄今为止，胶原的提取方法主要有以下4种：酸法、碱法、盐法、酶法。在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合，以取得较好的提取效果。 1、酸法提取 酸法提取主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐键和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解。作为溶剂使用的酸，主要有盐酸或亚硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、柠檬酸和甲酸等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法，用酸法提取的胶原最大程度地保持了其三股螺旋结构。此法处理快速，所得产品的分子量是连续的，适用于医用生物材 料及原料的制备，但产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。赵苍碧等采用0.3 %的醋酸溶液在 4 ℃下从牛腱中提取胶原蛋白，得到高纯度的胶原蛋白溶液。余海等采用0.5 mol/L的醋酸溶液在4 ℃下从鼠尾肌腱胶成功提取出I型胶原蛋白。Takeshi等胶原蛋白课题组 采用0.5 mol/L的醋酸溶液从海妒鱼、鳍鱼、金枪鱼、水母等的皮中提取、分离出纯度较高的胶原蛋白，并对所提取的胶原蛋白的理化性质作了系统的研究。2、碱法提取 碱法提取胶原蛋白常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。如Holzer等采用1 %～1.5 %石灰水浸泡的方法提取胶原蛋白。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。 3、盐法提取 盐法提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。 4、酶法提取
细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究
常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究 杨鹏华,倪凤娥 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025) 摘要 [目的]研究从常乳中纯化牛乳铁蛋白的工艺条件,探讨牛乳铁蛋白的抗菌活性。[方法]选用SP sepharose HP 作为强阳离子交换介质,利用AKT A purifier 10高效液相色谱仪纯化牛乳铁蛋白。[结果]结果表明,牛乳铁蛋白在pH 值7.5、浓度0.85mol/L 的NaCl 洗脱液中可以被洗脱下来,且产品纯度为90%以上。牛乳铁蛋白浓度为5mg/m l 时对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。[结论]该研究建立了从常乳中纯化牛乳铁蛋白的方法,为大规模生产具有活性的牛乳铁蛋白奠定了基础。关键词 牛;乳铁蛋白;纯化中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)16-07351-02Pur i f ica tion and Antibacter i a l Activ ity of Bov i ne Lactoferr i n from Cows ′M ilk YANG Peng 2hua et a l (College of L ife Science,Yangtze University,J ingzhou,Hubei 404325) Abstract [Objective ]The ai m was to research the purification p r ocedures of bovine lactoferrin fr om cows πm ilk,and t o discuss the antibacte 2rial activity of bovine lactoferrin .[Method ]U sing SP sepharose HP as exchange medium of str ong cation,bovine lact oferrin was purified by u 2sing AKT A purifier 10high perf or mance liquid chr omat ograph .[Result]The results showed that bovine lact oferrin was eluted at 0.85mol/L NaCl and 7.5pH value,and the purity was over 90%.The growth of E.coli was evidently supp ressed with 5mg/m l bovine lactoferrin .[Con 2clusi on ]This study constructed the purification method of lactoferrin fr om cows ′m ilk,and p rovided bases f or large scale p roduction of active bovine lactoferrin . Key words Cow;Lactoferrin;Purification 作者简介 杨鹏华(1977-),男,河北保定人,博士,讲师,从事动物基 因工程方向研究。 收稿日期 2009204220 牛乳铁蛋白(Bovine Lact oferrin,b LF )是一种多功能蛋白质,在牛初乳和干乳期乳腺分泌物中含量较丰富[1] ,而在常乳中含量较少。它具有广泛的抗病毒[2] 、抗细菌感染作 用 [3] ,能有效增强免疫细胞增殖,提高机体免疫力[4] 。故对 牛乳铁蛋白的研究一直以来都是人们关注的焦点。由于初乳中含量丰富,所以目前牛乳铁蛋白均来自于初乳,但是由于初乳的来源有限,在一定程度上限制了牛乳铁蛋白的大规模生产,导致牛乳铁蛋白的价格不菲。该研究尝试应用强阳离子交换色谱法从常乳中纯化牛乳铁蛋白,为其工业化生产奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料、仪器、试剂 牛乳采自普通奶牛的常乳。 色谱柱H i L oad 16/10SP sephar ose HP colu mn,美国GE Healthcare 公司;高效液相色谱仪AKT A purifier 10,美国GE Healthcare 公司;DYY -Ⅲ2稳压电泳仪,北京六一仪器厂; 超滤管,M illi pore 公司;Freez one 6冷冻干燥机,美国Labconco 公司。 大肠杆菌为长江大学生命科学学院实验室保存,肉汤琼脂培养基购自青岛海博生物公司,其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 牛乳清制备。将乳样于4℃、4500r/m in 离心15m in,将下层液体吸出转移到另一个离心管。将脱脂乳用浓 度1mol/L 盐酸调节pH 值,使其pH 值在3.8～4.6,将调好 pH 值的乳样于4℃、12000r/m in 离心20m in,取出,将上清 转移到另一个离心管。用浓度1mol/L 氢氧化钠调pH 值为 7.5,将调好pH 值的奶样于4℃、12000r/m in 离心30m in, 将上清收集到一个烧杯中,准备上样。 1.2.2 牛乳铁蛋白纯化工艺的建立。乳清通过注射器上 样,进入上样环。色谱柱预先用浓度0.4mol/L NaCl 、浓度 20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5的平衡液平衡5个柱体积。 然后用浓度0.4～1.0mol/L NaCl 、浓度20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5洗脱液线性洗脱15个体积,浓度1.0mol/L NaCl 、浓度20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5洗脱液继 续洗脱5个体积,流速设为3m l/m in 。收集分离到的各个峰值蛋白,每10m l 收集一管,合并同一峰值的洗脱液,洗脱液经5K D 的超滤管5000r/m in 离心10m in,双蒸水恢复原体积,再5000r/m in,离心10m in,即得纯化除盐的b LF 。纯化得到b LF 浓缩液,-55℃冷冻24h,取出立即放入Freez one 6冻干机中冻干至粉末状,取出4℃保存。 1.2.3 S DS 2P AGE 检测纯化效果。配制浓度15%S DS 2P AGE, 取10μl 纯化液加入10μl 蛋白上样缓冲液,100℃水浴5min,取出电泳。浓缩胶电压设置50V,分离胶电压设置90V,电泳结束后用考马斯亮蓝染色,结果用凝胶成像仪拍照。 1.2.4 抗菌活性分析。在试管中把大肠杆菌用肉汤琼脂培 养基稀释浓度为2×104 个/m l,分别添加终浓度为0.5、2.0、 5.0mg/m l 的b LF,37℃、180r/m in 摇床培养。分别在1、2、4h 测定菌液的OD 600。同时设一不加b LF 的空白对照组。每 组设3个重复,试验重复3次。 2 结果与分析 2.1 牛乳铁蛋白的纯化工艺 高质量乳清的获得采用了pH 值法,调pH 值至酪蛋白等电点,通过离心得到了几乎不 含酪蛋白的乳清(图1W )。这对于其后的阳离子交换色谱来说至关重要。因为酪蛋白是乳蛋白中的主要蛋白,酪蛋白的去除有利于提高乳铁蛋白的纯化效率。阳离子交换色谱采用了SP sephar ose HP 介质,洗脱液为含浓度20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5的浓度0.4～1.0mol/L NaCl 的线性洗脱。 在流速为3m l/m in 的条件下,在NaCl 浓度0.85mol/L 时纯化得到了一个明显的蛋白峰,见图2C,经电泳检测证明为 b LF,灰度扫描表明得到的b LF 纯度为91.3%(图1C )。在C 峰前出现了一个不明显的蛋白峰,分别收集到2个收集管中 A 和B,但是经电泳检测未见到明显条带(见图1A 、 B )。 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2009,37(16):7351-7352责任编辑 张彩丽 责任校对 王业政
胶原蛋白的提取
胶原蛋白的提取 实验原料：猪皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸馏水。 实验器材：搅拌机，低温离心机，控温磁力搅拌器，电子天平，透析设备，PH试纸，烧杯，玻璃棒，小刀，研钵。 实验需配药品：A:氯仿/乙醇（2:1）约需400ml， B:0.5mol/L乙酸约3000ml， C:6mol/L NaOH溶液约40ml, D:质量分数0.1％、0.01％的乙酸（透析用）， E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液约需200ml。 实验步骤： 1,猪皮的前处理： （1）称取猪皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切； （2）将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次； （3）将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，E）充分洗涤（2h）以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取胶原蛋白： （1）进行前处理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），搅拌并维持在4℃，提取48h； （2）高速冷冻离心机离心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L （NaCl2.2mol）搅拌过夜； （3）低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml 冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。 3,胶原蛋白提纯: （1）在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存；（2）离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液两次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液； （3）将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白样品，备用。
牛血清白蛋白的分离提纯工艺
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
各大品牌牛初乳的对比
各大品牌牛初乳的对比 生命阳光、邦阳、培芝、纽乐、爱宝氏、亨氏、乳珍、优瑞斯、蕊盛蕊、新澳康邦阳：免疫1+2、金装邦阳、纯粉。——48小时内分娩的乳汁 生命阳光：免疫1+1（0-1岁、1-3岁）、安孕哺、纯粉——48小时分娩的乳汁培芝：纯粉、金装初乳奶粉、初乳片、百立乐金装牛初乳复合粉、百立乐纯牛初乳1段45克、3段30克——48小时内分娩的乳汁 纽乐：牛初乳粉300g——最初4次挤出的乳汁 爱宝氏：金装纯牛初乳粉的——72小时分娩的乳汁 亨氏：金装纯牛初乳粉——48小时内分娩的乳汁 乳珍：颗粒针对幼儿3岁后的宝宝更加适合，3岁前的宝宝不利于吞咽和吸收，打开胶囊服用，容易浪费。、 优瑞斯：纯粉、牛初乳粉（分0-1岁、1-6岁）、牛初乳片——48小时内分娩的乳汁 蕊盛蕊：普装、金装、顶级装——72小时内分娩的乳汁 新澳康：牛初乳粉（300、500g）、纯粉（30、60g）、牛初乳澳大利亚进口，12小时分娩的乳汁 Symbiotics：牛初乳粉、胶囊、片美国
邦阳免疫1+2牛初乳：在补充免疫球蛋白IgG的基础上，特别添加了调节肠道的益生菌和脑部营养素DHA、牛磺酸及乳钙等维生素、矿物质。牛初乳本身是高热量高蛋白的食物，不容易消化，易引起上火，而益生菌可以改善此情况，帮助各大营养素的更好吸收和利用，避免上火便秘的情况发生。胎儿期和婴幼儿期是大脑发育和视网膜发育的关键期，所以特别添加了DHA，促进脑细胞和视网膜的发育，提高智力和视力，提高学习能力，思维能力，提高记忆力。其中还添加了乳钙，促进骨骼和牙齿的发育，乳钙是婴幼儿最好的钙来源，吸收率高达92%，不刺激肠胃，不上火便秘，作为日常的补充，可以无需额外补充钙剂。 生命阳光免疫1+1：添加了益生菌成分，帮助消化吸收，且不含脑部营养素DHA 和牛磺酸。蛋白质含量相对较高，宝宝的肠胃系统和肾脏发育还不成熟完善，容易造成消化的负担。 邦阳免疫1+2是建立在免疫1+1的基础上研发而成的，特别添加了脑部营养素DHA和牛磺酸，促进婴幼儿脑组织和智力发育，提高神经传导和视觉机能，改善
胶原蛋白提取
毕业论文外文资料翻译 学院：生物科学与工程学院 专业：生物工程 姓名：李秀莉 学号：120302214 外文出处：Food Chemistry 190(2016) 186-193 附件： 1.外文资料翻译译文；2.外文原文。
附件1：外文资料翻译译文 响应面优化蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白提取工艺关键词： 蛋壳膜、响应面优化法、胃蛋白酶溶性胶原蛋白 摘要： 本文利用响应面优化法（RSM）确定了自变量对蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）提取产率的影响。采用中心复合设计（CCD）的实验设计和结果分析方法，选取最有可能的条件范围进行了优化实验：NaOH浓度（X1：0.4-1.2mol/L）,碱处理时间（X2：6-30h），酶浓度（X3：15-75U/mg）以及水解时间（X4：12-60h）。实验数据用适当的统计学方法通过多元线性回归分析得到一个二阶多项式方程，分析表明最佳提取条件为：NaOH浓度为0.76mol/L，碱处理时间为18h，酶浓度为50U/mg，水解时间为43.42h。在最佳提取条件下的提取率实验值是30.049%，这与预测值30.054%高度一致。 1.前言 胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，大约占一个动物总蛋白的30%（Muyonga, Cole, & Duodo, 2004)。胶原蛋白的分子结构由三个多肽α-链扭曲在一起形成的一个三股螺旋体。在所有胶原蛋白的“胶原域”都发现了(Gly-X-Y)n重复。X和Y的位置往往分别被脯氨酸和羟脯氨酸占用（Gelse, Poschl, & Aigener, 2003）。目前，至少已有27中胶原蛋白类型已确定，其氨基酸序列、分子结构和功能明显不同（Canty & Kadler, 2005; Cheng, Hsu, Chang, Lin, & Sakata, 2009）。胶原蛋白已被广泛用作医药、化妆品、生物医学和食品行业的材料（Cheng et al.,2009）。一般来说，工业应用的胶原蛋白的主要来源是牛与猪的皮肤和骨头。然而，阮病毒疾病的爆发，如海绵脑病（BSE），传染性海绵脑病（TSE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，导致一些消费者对从这些动物体提取的胶原蛋白和胶原蛋白产品的担忧。此外，以猪为原料提取胶原蛋白不能被犹太人和穆斯林接收（Liu, Liang, Regenstein, & Zhou, 2012; Regenstein & Zhou, 2007）。因此，全球对胶原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生动物。但是，关于胶原蛋白提取的其他来源的信息是有限的。 蛋壳作为副产品大约占了一个鸡蛋总重量（60g）的10%（Nys, Bain, & Immerseel, 2011）。据估计每年在伊朗蛋制品工业都产生100000吨的蛋壳。蛋壳膜存在于白色液体和固体蛋壳内表面之间。胶原蛋白占蛋壳膜总蛋白含量的10%（MacNeil, 2006）。在蛋
转铁蛋白的简介
转铁蛋白的简介 万华普曼自主研制开发的万华牌消康保?便隐血检测试纸（胶体金法），成为早期筛查消化道肿瘤的最好方法。特别是最新推出的万华牌转铁蛋白检测试纸，进一步满足了临床检验对于检测结果的准确性、拓展检测样本范围等方面的需求，能更准确的检测出全消化道出血，并且不受饮食和药物的干扰，具有更好的特异性和灵敏度。上海、北京等多个城市的多家三甲医院临床试用结果表明，该产品不仅能够显著提高上消化道出血的检出率，还可检测呕吐物、胃液和其它体液标本中的隐性出血。对于检验人员和临床医生更全面的诊断消化道出血具有重要的提示作用，开创了全消化道肿瘤过筛检验的新纪元。 转铁蛋白检测试纸（胶体金法） 1．检测原理 转铁蛋白主要存在于血浆当中，在健康人的消化道中几乎不存在。因此只要在粪便、呕吐物或其它体液中检测到转铁蛋白，即说明存在消化道出血。本产品利用免疫学方法，特异性地检测样品中的人转铁蛋白（TRF），敏感度高，结合血红蛋白免疫法检测，对全消化道出血者阳性检出率有显著的提高。 2．适用范围 ⑴.作为血红蛋白法的补充检测手段，能够起到优势互补作用，排除假阴性的干扰，提高全消化道，特别是上消化道出血的阳性检出率。 ⑵.可作为黑便鉴别诊断的常规检测方法。 ⑶.可检测呕吐物、胃液中的出血，检测样本更广泛。 3. 临床意义： ⑴.上消化道大量出血。(常见的病因有消化性溃疡、急性胃粘膜损害、食管胃底静脉曲张 和胃癌等。) ⑵.上消化道少量出血。（常见于急性糜烂性胃炎、上消化道肿瘤、消化道溃疡等） ⑶.下消化道出血。（常见于肠道恶性肿瘤、息肉及炎症性病变引起的最为常见） ⑷.消化道出血性疾病的早期发现和诊断。 ⑸.呕吐物的检查。 ⑹.提高大肠癌检出率，40岁以上健康人群早期大肠癌的筛查。 ⑺.筛查胃肠道恶性肿瘤的主要方法。（主要包括胃癌和结、直肠癌） ⑻.消化道肿瘤高危人群定期体检； 备注：胃肠道出血时，粪便中出现大量转铁蛋白，其稳定性高于血红蛋白，粪便转铁蛋白检
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
乳铁蛋白
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白 新西兰NBL天然营养食品有限公司，与新西兰设备最先进、技术和科研最完备的新西兰GMP大药厂、新西兰恒天然集团Fonterra Co-operative Group建立了紧密的合作关系，我们对产品进行层层把关，严格按照GMP国际的生产管理标准生产，从而确保我们为广大消费者提供100%新西兰高品质的营养健康产品。 乳铁蛋白（Lactoferrin-LF）：来源主要是从乳清中提取。是一种具有高生物活性的免疫蛋白。 作用：1参与铁代谢，促进铁吸收 2 抗微生物功能3抗病毒作用4免疫调节和抗感染5抗肿瘤6抗氧化作用7作为细胞生长因子8婴儿配方粉9安全食品10奶制品11健康补充剂12功能性食品饮料13防腐剂14口腔维护（口香糖、牙膏15化妆品16食品成分 保健方面： 乳铁蛋白的保健功能包括： 1、抗微生物／抗病毒活性； 2、参与铁代谢； 3、消炎作用； 4、抗氧化功能； 5、抗辐射。 医药方面： 1、作为抗生素，治疗各种感染性疾病； 2、作为抗病毒剂，用于病毒性感染的防治； 3、抗真菌及抗寄生虫药； 4、作为免疫调节剂，应用于自身免疫性疾病、免疫低下或免疫耐受及肿瘤治疗的辅助用药； 5、作为抗肿瘤辅助药物，用于多种肿瘤的治疗； 6、作为补铁剂，用于贫血疾病的防治； 7、作为骨细胞生长因子； 8、其他医学应用：乳铁蛋白在医学方面的应用非常广泛，可用于各 种感染、高血压、冠心病、肿瘤及一些与应激性有关的疾病的预 防和治疗。 ?化妆品中的运用：最新研究发现，乳铁蛋白对青少年的青春痘、粉刺等问题有改善效果。另外，乳铁蛋白还可作为一种抗氧化剂，用于美容保健方面。 ?首先，利用乳铁蛋白的抗微生物活性，作为化妆品的天然防腐剂，抑制有害微生物生长，同时也增强使用者对微生物的抗感染力； ?其次，利用乳铁蛋白具有的抗氧化功能，用于增强化妆品的抗衰老功效。 1孕产妇：孕产妇补充乳铁蛋白，可以提高其抵抗力，有效预防或治疗孕期、哺乳期的细菌、病毒性感染；同时，促进铁吸收，预防孕产妇贫血。 2非母乳喂养、混合喂养的婴幼儿 乳铁蛋白是母乳中的核心免疫蛋白，能帮助婴幼儿抵抗细菌、病毒等有害微生物，预防病毒引起的呼吸道感染及腹泻等婴儿常见疾病；同时还可以促进婴儿的生长发育和增强造血功能，为婴儿构筑起健康成长的第一道防线，“吃母乳的宝宝少生病”正是这个道理。 3缺铁性贫血者 乳铁蛋白能高效促进铁吸收，临床试验证明，铁与乳铁蛋白结合后吸收率是单纯补铁的4倍。缺铁性贫血者在补铁时配合摄入乳铁蛋白，可达到减少铁制剂摄入量，增强补铁效果的作用，同时，由于乳铁蛋白的摄入，还可以明显缓解铁对肠道的刺激。 4免疫力低下者 体弱多病者大多抵抗力低下，乳铁蛋白能够帮助他们激发、建立、修复、完善免疫系统，增强抗病能力 在普通奶粉奶中乳铁蛋白含量很少，只要在一些进口高档奶粉和新兴品牌中才添加乳铁蛋白，一般添加量只有30-50mg/100g，只有极少数的进口高端奶粉添加量达到100毫克。 如果一个宝宝每天吃100克奶粉（大约600ml奶液），按添加量最大的奶粉计，也仅仅摄入了100mg