16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16S r D N A鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
1.适用范围
本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料
3.1器材
移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：
AB3500、AB3130
3.2试剂
DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；
3.3耗材
移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；
3.4 引物
16SrDNA 名称 序列
扩增长度 第1部分 正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右 反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右 反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'
第3部分
正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右
反向引物1492R
5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'
其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1
4. 操作流程
5. 实验方法
5.1
核酸提取：
挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra
的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。 5.2
基因扩增
5.2.1 PCR 反应体系
备注：DNA 模板量通常在100 ng 以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA 模板使用量。PCR 反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却
3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
5.2.2PCR反应条件
5.2.3电泳
称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。
5.3产物纯化
5.3.1每5μLPCR产物加入2μL ExoSAP-IT试剂，混匀。
5.3.2放入PCR仪中，37℃温育15min, 80℃温育15min。
5.3.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。
5.4测序反应
5.4.1测序反应体系
5.4.2测序反应条件
5.4.3测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)
5.4.3.1每管加入27μL SAM Solution和6μL BigDye XTerminator Solution。
5.4.3.2放在Eppendorf MixMate 上2000rpm震荡30min。
5.4.3.3在离心机上以1000×g离心2min。
5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。
5.5序列比对
基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。
6.关键说明
6.1提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可
挑取一菌环菌株，置于100μL ddH2O 中，混匀，沸水热变性10min
后，离心3min分离，稀释50倍后做为PCR模板。必要时做梯度PCR
确认最佳的模板量。
6.2PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然
后置于低温冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种
冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
6.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特
异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前
500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp
无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较
为全面的16SrDNA的序列信息。具体参照附录。
PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶
易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
模板浓度过高
10ul体系100ngDNA