微生物作业

高转化率酿酒酵母的研究摘要：从酵母浸粉中分离筛选出一株高产乙醇的菌株DL5168，经形态学观察、生理生化学及分子生物学鉴定，确定该菌株为酵母属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

确定菌株DL5168发酵的最适条件为：初始葡萄糖浓度180 g／L；发酵温度30℃。

在此条件下，菌株发酵的最终乙醇浓度为113．9 g／L，比对照菌株的乙醇浓度提高36％；乙醇转化率为0．64 g／g，比对照提高39％。

关键词：酿酒酵母；乙醇；筛选；鉴定1 引言乙醇具有“绿色石油”和“液体黄金”之称，与石油相比，具有可再生、污染小、可减少温室效应等优点，是一种清洁能源。

目前，乙醇的生产方法包括化学合成法和微生物发酵法L2J。

前者用石油裂解产生的乙烯与水合成乙醇，随着石油资源的目益枯竭，乙醇的这一合成方法也受到限制。

微生物发酵生产乙醇，利用可再生资源作为发酵底物，具有绿色环保的优点，因此，该方法在未来更具有发展前景。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是工业上生产乙醇的重要菌株，能发酵葡萄糖生产乙醇。

然而在发酵过程中，高浓度底物(葡萄糖)和高浓度产物(乙醇)都会抑制酿酒酵母菌的生长和乙醇生成，导致乙醇产量和转化率不高L31。

因此，对野生型酿酒酵母菌株的分离、筛选和鉴定，以期获得具有遗传性状稳定、耐受高浓度底物和产物抑制、又高产乙醇的酿酒酵母菌，是非常必要的。

本文通过筛选得到一株高产乙醇菌株，经生理生化实验和分子生物学鉴定为酵母属的酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)，对该菌株发酵条件进行了初步优化，为该菌株今后在生产乙醇方面的应用奠定良好的基础。

2实验部分2．1材料2．1．1菌株新菌株分离自酵母浸粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)。

对照菌为酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)GGMCC No．2．604，购白中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

2．1．2培养基[ 4](1)YPD种子培养液酵母浸粉l％(m／v)，蛋白胨2％，葡萄糖2％；若配制YPD种子固体培养基，则再向YPD种子培养液中加入2％琼脂粉，蒸馏水配制1 L，自然pH值，0．1 Mpa灭菌20 min。

(2)YPD发酵培养基酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖18％，蒸馏水配制1 L，pH=7．0，0．1 Mpa灭菌20min。

(3)TTC培养基下层培养基：葡萄糖3％，琼脂2％，酵母膏0．5％，蛋白胨0．5％，蒸馏水配制1 L；上层培养基：葡萄糖0．5％，琼脂2％，TTC 0．05％，蒸馏水配制1 L； 0.1 Mpa灭菌20 min。

(4)WL琼脂培养基酵母浸粉0．5％，胰蛋白胨0．5％，葡萄糖5％，琼脂2％，磷酸二氢钾0．055％，氯化钾0．0425％，氯化钙0．0125％,氯化铁0．00025％，硫酸镁0.0l25％，硫酸锰0．00025％，溴甲酚绿0．0022％。

蒸馏水配制1 L，pH=6．5，0．1 Mpa灭菌20 rain。

(5)赖氨酸培养基溶液A：硼酸0．01％，硫酸锌0．04％，钼酸铵0．002％，硫酸锰0．004％，硫酸亚铁0．025％，加水至1 L。

溶液B：葡萄糖5％，磷酸二氢钾0．2％，硫酸镁0．2％，氯化钙0.02％，氯化钠0．01％，腺嘌呤O．0002％，DL一蛋氨酸0．0001％，L一组氨酸0．0001％，DL一色氨酸 0．0001％，溶液A 1 mL，乳酸钾(50％v／V)l2 g，琼脂2％，加水至1 L，以乳酸调pH至5．0～5．5。

溶液C：L一赖氨酸1％，加水1 L。

溶液D：肌醇0．2％，泛酸钙0．02％，盐酸硫胺素0．004％，吡哆醇0．004％，对氨基苯甲酸O．002％，烟碱酸0．004％，核黄素0．004％，生物素0．00002％，叶酸0．00001％，加水1 L。

上述溶液灭菌后在45~50℃下按照B：C：D的体积比98：1：1混合，倒入培养皿中制成平板，在37℃下保温过夜备用。

(6)糖发酵基础培养基12．5％豆芽汁培养基：黄豆芽125 g加水1 L，煮沸0．5 h，过滤后补充蒸馏水至1 L，即制成12．5％豆芽汁。

按每100 mL 12．5％豆芽汁加入2％待测糖，即为糖发酵培养基。

待测糖包括葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖和可溶性淀粉。

0．1 MPa 灭菌20 min。

(7)同化碳源基础培养基硫酸铵O．5％，磷酸二氢钾0．1％，硫酸镁0．05％，酵母膏0．02％，琼脂2％，蒸馏水配制1 L，过滤后分装试管，0．1 MPa灭菌20min。

加入不同待测碳源即为同化碳源培养基，待测碳源浓度为2％(m／v)。

待测碳源有葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、肌醇、柠檬酸、可溶性淀粉。

若待测碳源为有机酸，可将其加入至同化碳源基础培养基后，用0．1 M NaOH调pH值至5．7后灭菌；其它同化碳源培养基用盐酸调pH值至5．7。

(8)同化氮源基础培养基葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．1％，硫酸镁0．05％，酵母膏0．02％，琼脂2％，蒸馏水配制1 L，过滤后分装试管，0．1 MPa灭菌20 min。

加入不同待测氮源即为同化氮源培养基，待测氮源浓度为0．5％。

待测氮源包括硝酸钠、硫酸铵、亚硝酸钠、L一赖氨酸。

2．2仪器设备HZQ—F160型全温振荡培养箱(中国科学院武汉科学仪器厂)，7GC一14B气相色谱仪(日本岛津公司)，721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2.3实验方法2.3.1酵母菌的分离取0．05 g酵母浸粉加入到已灭菌的9 mLYPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，增菌，再转入酒精浓度为10％(w／v)的YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，再转入酒精浓度为18％(w／v)的YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养72 h，镜检，有无活菌存在，若有则取1 mL，接入YPD种子固体培养基中，30℃培养2。

3 d，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2．3次，经镜检为纯种后分别转入YPD种子固体培养基上，4℃保存。

2.3.2酵母菌筛选(1)TTC琼脂培养基初筛酿酒酵母菌 [5]将上述YPD种子固体培养基上的酵母菌活化，然后接入YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，涂布于TTC上层培养基上，30℃培养48 h，直至菌落出现，肉眼可见。

然后倒入融化的TTC上层培养基，在30℃培养3 h使无色的TTC上层培养基被活细胞内的脱氢酶还原，变成红色。

挑取菌落颜色最深的菌株用于进一步复筛。

(2)wL琼脂培养基复筛酿酒酵母菌L61将初筛得到的菌株在YPD种子培养液中活化培养24 h，然后涂布于WL琼脂培养基上，30℃培养5 d，观察菌落形态。

2.3.3赖氨酸培养基属内鉴定将分离菌株和对照菌GGMCC No．2．604分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，按照l％接种量接种于5 mL无菌生理盐水中进行饥饿处理，7 d后接种至赖氨酸培养基中，30℃静置培养15 d，观察培养基上菌落生长情况。

2.3.4菌株形态观察(1)细胞形态观察取在YPD种子固体培养基上保存的新分离菌株和对照菌GGMCC No．2．604，分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，分别观察其形态及繁殖方式，并分别测量其菌体大小。

(2)群体形态观察新分离菌株和对照菌株培养于YPD种子固体培养基上，30℃下静置培养15 d，观察巨大菌落形态。

2.3.5生理生化鉴定(1)糖发酵鉴定取洁净的试管，分别加入4 mL含2％待测糖的糖发酵培养基，并于每支试管内放入一倒置的小套管，高压灭菌备用。

酵母菌培养液按1％接种量分别接种于各组含糖试管中，置30℃培养箱内静置培养，观察小套管内有无气泡产生和气泡产生的快慢，从而判断菌株对该种糖类的发酵能力。

(2)碳源同化鉴定菌种接种于YPD种子培养液中，30。

C、170 rpm培养24 h，发酵液经无菌生理盐水稀释后，涂布于同化碳源培养基上。

30℃静置培养5 d后，观察菌落生长情况，阴性对照为不含碳源的基础培养基。

(3)氮源同化鉴定菌株接种于YPD}0P子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，发酵液经无菌生理盐水稀释后，分别涂布于同化氮源培养基上。

30℃静置培养5 d后，观察菌落生长情况，阴性对照中不加相应的氮源。

2.3.6 26S rDNA D1／D2区域基因序列分析新分离菌株分子测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。

测序结果查询GenBank数据库，使用Blast在线软件进行相似性分析。

2.3.7发酵条件优化(1)发酵温度优化将筛选菌株划线至YPD；~子固体培养基上，30℃静置培养24 h，挑一环菌至YPD}~h子培养液中，30℃，170 rpm培养至对数生长期，按10％(v／v)接种量接入YPD发酵培养基中，170 rpm，培养24 h，培养温度分别为30℃，40℃。

(2)发酵底物浓度优化将菌株划线至YPD种子固体培养基上，30℃静置培养24 h，挑一环菌至YPD种子培养液中，30℃，170 rpm培养至对数生长期，按10％(v／v)接种量接入YPD发酵培养基中，170 rpm，培养24 h，培养温度30℃，YPD发酵培养基中葡萄糖浓度分别为100 L、180 g／L和300 g／L。

2.3.8优化条件下摇瓶发酵培养至对数生长期的菌液，按10％(v／v)接种量接入YPD发酵培养基中，30℃，170 rpm，培养24 h。

2.4分析方法菌体密度测定：比色法测定菌液OD值，即721分光光度计在600 nm处吸光度值。

葡萄糖含量测定：利用3，5一二硝基水杨酸比色法乙醇含量测定：采用气相GC．14B型气相色谱仪内标法测定。

玻璃管填充柱，色谱柱2 m×①5 mm，填料为Chromsorb 101，检测器为FID，柱温170。

C，汽化室的温度为200。

C，检测器的温度为220。

C，载气为N2，流速40 mL／min，进样量 1 gL。

采用无水乙醇和正丁醇做标准曲线，依据标准曲线计算样品中乙醇浓度。

所有数据是三次实验的平均值。

3结果与讨论3．1筛选实验结果3．1．1 TTC琼脂培养基初筛酿酒酵母菌株筛选菌株在TTC琼脂平板上生长2d的菌落，菌落颜色如图1显示。

菌株编号为DL1～11号。

通过观察可以看出，菌落DL9颜色(红色)最深，说明该菌生产乙醇的能力较强。

文献报道，TTC可以被酿酒酵母细胞内的脱氢酶还原，变成红色。

脱氢酶活性与红色的深度成正比，而脱氢酶活性又与菌株生产乙醇的能力密切相关[8-10]。

因此，菌株DL9被用于进一步复筛。