外源基因清除”技术(Gene-Deletor)原理、特点及其潜在应用前景
基因芯片技术基础知识(概念、制备、杂交、应用及发展方向)
生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的HGP （human genome project），最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列。除了人的遗传信息以外，还有其它生物尤其是模式生物（model organism）已经或正在被大规模测序，如大肠杆菌、啤酒酵母、秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够，还必须了解其中基因是怎样组织起来的，每个基因的功能是什么，又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的，即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学）[1]，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技术[2]。 一．什么是基因芯片 生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小（1cm3）的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等）将生物分子探针（寡核苷酸片段或基因片段）以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子（如基因）相互作用，交行反应的固相表面，在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征，CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交[3]的芯片。 基因芯片的基本原理同芯片技术中杂交测序（sequencing by hybridization, SBH）。
基因操作技术
1.载体的定义？ 载体：指携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。 2.载体必须具备的3个基本条件?载体的碱基对越多越好？ （1）基本条件：1具有复制子，能在宿主细胞内自主复制，并携带重组DNA分子一同扩增；2具有单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点；3有合适的选择标记基因，用来筛选重组DNA。 （2）载体的碱基对越少越好，能够更好的控制目的基因 3.目前研究最深，使用最多的载体有？ 目前研究最深、使用最多的载体是经过改造的质粒载体和噬菌体载体。 4.按功能分，有哪些载体？克隆载体的概念？表达载体的概念？ （1）按功能分，可分为克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体、穿梭载体、多功能载体等。（2）克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质的产物。（3）表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、PBS、终止子），使目的基因能够表达的载体。 5.选择标记有哪些？插入失活、a-互补是什么意思？ （1）选择标记有插入失活和a-互补（2）插入失活:若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使基因失活，丧失其原有的表性特征。（3）a-互补：单独存在的a及w片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。 6.列举常用的质粒载体名称？ PBR322质粒、PUC载体、TA克隆载体 7.噬菌体的溶原状态是指？ 噬菌体感染大肠杆菌时，可能进入一个溶菌循环，结果导致细胞的裂解，释放出噬菌体颗粒；或者进入与宿主不同程度的稳定状态。 8.噬菌体DNA由哪三个部分组成？目的基因插入哪个部分？ （1）噬菌体DNA由左臂、中臂、右臂三部分组成。（2）目的基因插入中臂（非必须区）部分。 9.超级载体的特点？有哪些超级载体？ 1）超级载体的特点：运载量大（2)超级载体：YACs、BACs 10.表达载体与克隆载体有什么最大的区别？ 表达载体有强大的启动子和SD序列，而克隆载体没有 11.限制性内切酶 限制性内切酶：能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断的酶 12.DNA连接酶，T4连接酶 DNA连接酶：一种能够在两条DNA链之间催化5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键的酶T 4连接酶：连接黏性末端或平末端的酶 13.DNA聚合酶，Taq聚合酶 DNA聚合酶：催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）聚合成DNA的酶 Taq聚合酶：从嗜热水生菌中分离纯化出来的 14.逆转录酶 逆转录酶：又称依赖于RNA的DNA聚合酶，是分子生物学中最重要的核酸酶之一。 15.核酸酶，DNase,Rnase 核酸酶：通过切割相邻两个核糖酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子发生水解断裂的蛋白酶
简述转基因技术原理
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
基因芯片技术的应用和发展趋势
基因芯片技术的应用和发展趋势 随着基因芯片技术的日渐成熟, 在功能基因组、疾病基因组、系统生物学等领域中得到了广泛的应用, 已经发表了上万篇研究论文, 每年发表的论文呈现增长的趋势. 芯片制备技术极大地推进了生物芯片的发展, 从实验室手工或机械点制芯片到工业化原位合成制备, 从几百个点的芯片到几百万点的高密度芯片, 生物芯片从一项科学成为一项技术, 被越来越多的研究者广泛运用. 各个实验室不断产生海量的杂交数据, 相同领域的研究者需要比较不同实验平台产生的数据, 作为基于分子杂交原理的高通量技术, 芯片实验的标准化、可信度、重现性和芯片结果是否能作为定量数据等问题成为所有的芯片使用者关心的课题. 迈阿密原则和微阵列质量控制系列研究回答了这两个问题. 迈阿密原则(Minimum Information About a Micro- array Experiment, MIAME, 微阵列实验最小信息量)提出了生物芯片标准化的概念, 该原则的制定使世界各地实验室的芯片实验数据可以为所有的研究者共享. 同 时, 美国国家生物信息学中心(NCBI)和位于英国的欧洲生物信息学研究所(EBI)也建立了GEO ( https://www.360docs.net/doc/4a12708838.html,/geo/)和ArryExpress (http:// ;https://www.360docs.net/doc/4a12708838.html,/arrayexpress/)公共数据库, 接受和储存全球研究者根据迈阿密原则提交的生物芯片数据, 对某项研究感兴趣的研究人员可以下载到相关课题的芯片原始数据进行分析. 2006年美国FDA联合多个独立实验室进行了MAQC系列实验(micro array quality control, MAQC), 旨在研究目前所使用的芯片平台的质量控制. 该研究的12篇系列文章发表在2006年9月份的Nature Biotechnology 上, 用严格的实验分析了目前主流芯片平台数据质量, 芯片数据和定量PCR结果之间的相关性, 芯片数据均一化方法, 不同芯片平台之间的可重现性. 证明了不同芯片平台产生的数据具有可比性和可重现性, 各种芯片平台之间的系统误差远远小于人为操作和生物学样品之间本身的差异, 肯定了芯片数据的可信性, 打消了以往对芯片数据的种种猜疑, 明确了基于杂交原理的芯片同样可以作为一种定量的手段. 推动了生物芯片技术在分子生物学领域更广泛的应用. 生物信息学和统计学是在处理基因芯片产生的海量数据中必不可少的工具. 随着芯片应用的推进, 芯片数据分析的新理论和新算法不断地被开发出来, 这些方法帮助生物学家从海量的数据里面快速筛选出差异表达的基因. 一次芯片实验获得的是成千上万个基因的表达信息, 任何一种单一的分析方法都很难将所有蕴含在数据中的生物学信息全部提取出来, 从近年来生物信息学研究的趋势来看, 目前研究的重点开始转向芯片数据储存、管理、共享和深度信息挖掘, 旨在从芯片数据中获得更多的生物学解释, 而不再停留在单纯的差异表达基因筛选上。 目前基因芯片的制备向两个主要方向发展. 第一, 高密度化, 具体表现为芯片密度的增加, 目前原位合成的芯片密度已经达到了每平方厘米上千万个探针. 一张芯片上足以分析一个物种的基因组信息. 第二, 微量化, 芯片检测样品的微量化, 目前芯片检测下限已经能达到纳克级总RNA水平, 这为干细胞研究中特别是IPS干细胞对单个细胞的表达谱研究提供了可能. 另一方面, 微量化也体现芯片矩阵面积的微量化, 即在同一个芯片载体上平行的进行多个矩阵的杂交, 大大减少系统和批次可能带来的差异, 同时削减实验费用. 微阵列技术改变了生物学研究的方法, 使得微量样品快速高通量的分析成为可能, 从单个基因的研究迅速扩展到全基因组的系统生物学研究. 微阵列技术帮助生物学研究进入后基因组时代, 研究成果层出不穷。 2001年国家人类基因组南方研究中心韩泽广博士研究小组利用cDNA芯片对肝癌和正常组织中的12393个基因和EST序列进行了表达谱筛查, 其中发现了2253个基因和EST在肝癌中发生了差异表达, 并对这些差异基因的信号通路进行了分析, 发现WNT信号通路在肝癌的发生中出现了表达异常. 2002年中国科学院神经科学研究所张旭博士研究组利用表达谱芯片对大鼠外周神经损伤模型背根神经节的基因表达进行了研
基因芯片技术及其应用简介(精)
基因芯片技术及其应用简介 生物科学学院杨汝琪 摘要:随着基因芯片技术的发展,基因芯片越来越多的被人们利用,它可应用于生活中的方方面面,如:它可以应用于医学、环境科学、微生物学和农业等多个方面,基因技术的发展将有利于社会进一步的发展。 关键词:基因芯片;技术;应用 基因(gene是载有生物体遗传信息的基本单位,存在于细胞的染色体(chromosome上。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上,称之为基因芯片(又称DNA 芯片、生物芯片。在一块1 平方厘米大小的基因芯片上,根据需要可固定数以千计甚至万计的基因片段,以此形成一个密集的基因方阵,实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术,把数以万计的基因片段以显微点阵的方式排列在固体介质表面,可以实现基因检测的快速、高通量、敏感和高效率检测,将可能为临床疾病诊断和健康监测等领域,带来全新的技术并开拓广阔的市场。 1 基因芯片技术原理及其分类 1.1基因芯片的原理: 基因芯片属于生物芯片的一种"其工作原理是:经过标记的待测样本通过与芯片上特定位置的探针杂交,可根据碱基互补配对的原则确定靶序列[1],经激光共聚集显微镜扫描,以计算机系统对荧光信号进行比较和检测,并迅速得出所需的信息"基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍,可在一次试验中间平行分析成千上万个基因,是一种进行序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。 1.2基因芯片分类: 1.2.1根据其制造方法可分原位合成法和合成后点样法;
1.2.2根据所用载体材料不同分为玻璃芯片!硅芯片等; 1.2.3根据载体上所固定的种类可分为和寡核苷酸芯片两种; 1.2.4根据其用途可分测序芯片!表达谱芯片!诊断芯片等 2 基因芯片技术常规流程 2.1 芯片设计根据需要解决的问题设计拟采用的芯片,包括探针种类、点阵数目、片基种类等。 2.2 芯片制备将DNA, cDNA或寡核昔酸探针固定在片基上的过程。从本质上可分为两大类fz} ,一类是在片基上直接原位合成,有光蚀刻法、压电印刷法和分子印章多次压印法三种;另一类是将预先合成的探针固定于片基表面即合成点样法。 2.3 样品制备常规方法提取样品总RNA,质检控制。再逆转录为。DNAo 2.4 样品标记在逆转录过程中标记荧光素等。 2.5 芯片杂交标记的cDNA溶于杂交液中,与芯片杂交。 2.6 芯片扫描一用激光扫描仪扫描芯片。 2.7 图像采集和数据分析专用软件分析芯片图像,然后对数据进行归一化,最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。 2.8 验证用定量PCR或原位杂交验证芯片结果的可信性。 3基因芯片合成的主要方法 目前已有多种方法可以将基因片段(寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种: 3.1原位合成:
基因芯片技术的研究进展与前景
基因芯片技术的研究进展与前景 摘要 关键词基因芯片，遗传性疾病，基因组计划， 一、基因芯片技术的产生背景 基因芯片技术是伴随着人类基因组计划而出现的一项高新生物技术。2001年6月公布了人类基因组测序工作草图；2002年出发飙了较高精确度和经过详细注解的人类基因组研究结果；2004年10月发表了已填补基因组中许多Gap片段的更精确的人类全基因组序列，标志人类基因组计划的完成和新时代的开始。随着人类基因组计划的开展，也同时进行了模式生物基因组测序工作。动物、植物、细菌及病毒基因组等测序工作都已取得重大进展。 随着各种基因组计划的实施和完成（有的即将完成），一个庞大的基因数据库已经建成。怎样从海量的基因信息中发掘基因功能。如何研究成千上万基因在生命过程中所担负的角色；如何开发利用各种基因组的研究成果，将基因的序列与功能关联起来，认识基因在表达调控、机体分化等方面的生物学意义；解释人类遗传进化、生长发育、分化衰老等许多生命现象的奥秘；深入了解疾病的物质基础及发生、发展过程；开发基因诊断、治疗和基因工程药物并用来预防诊断和治疗人类几千种遗传性疾病……这些都将成为现代生物学面临的最大挑战。这样的背景促使人们研究和开发新的技术手段来解决后基因组时代面临的一系列关键问题。20世纪90年代初，为适应“后基因组时代”的到来，产生了一项新的技术，即以基因芯片为先导的生物芯片技术。 二、基因芯片的概念 基因芯片（又称DNA芯片、DNA微阵列）技术是基于核酸互补杂交原理研制的。该技术指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400 ）探针分子固定于支持物上后与有荧光素等发光物质标记的样品DNA或RNA分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，从而对基因表达的量及其特性进行分析。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，只是在固相基质上古高度集成的不是半导体管，而是成千上万的网格状密集排列的基因探针，所以被称为基因芯片。 三、基因芯片技术的分类 1 根据功能分类：基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因表达图谱芯片可以将克隆的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对于来源不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，从而对这个基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或某几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系，DNA测序芯片则是基于杂交测序发展起来的。其原理是任何线状的单链DNA或RNA序列均可裂解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，如能把原序列所有这些错落重叠的寡核苷酸序列全部检测出来，就可据此重新组建出新序列。 2 根据基因芯片所用基因探针的类型不同，可分为cDNA微阵列和寡核苷酸微阵
基因诊断和治疗的医学应用
基因诊断和治疗的医学应用 郭龙飞 （保山学院资源环境学院云南保山678000） 摘要：各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一，且死亡率很高，现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是，基因治疗为众多患者提供了希望，成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果，以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。 关键词：基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述 基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及（或）功能缺陷，或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入，激活机体抗瘤免疫，增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性，这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。 目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种：①基因矫正或置换：即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因的导人，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩 目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现，但机制还不清楚，可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法，临床主要是对症治疗，如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗，呼吸困难逐渐缓解，双肺痰鸣音减少，但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。 最近，在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用，而且对细胞几乎没有毒性作用，但研究工作还处于动物实验阶段，没有正式应用于临床，该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断 近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20万人，占全部恶性肿瘤发病的2％。其发病匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80％-90％的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15％，年生存率为1％-5％。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100％，5年生存率可达70％- 100％。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径 综述基因芯片技术、蛋白芯片技术的原理及应用。 1.1 基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟和最先实现商品化的产品。基因芯片是基于核酸探针互补杂交技术原理而研制的。所谓核酸探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。基因芯片，又称DNA芯片，DNA微阵列（DNAmicroar ray），和我们日常所说的计算机芯片非常相似，只不过高度集成的不是半导体管，而是成千上万的网格状密集排列的基因探针，通过已知碱基顺序的DNA片段，来结合碱基互补序列的单链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识别异常基因或其产物等。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的基因芯片和检测细胞基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片技术主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。 目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固相基质如玻璃片或硅片，然后使DNA片段或蛋白质分子按特定顺序排列在片基上。目前已有将近40万种不同的DNA分子放在1平方厘米的高密度基因芯片，并且正在制备包含上百万个DNA探针的人类基因芯片。生物样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片进行反应。要将样品进行特定的生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记，以提高检测的灵敏度。第三步是生物分子与芯片进行反应。芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。基因芯片技术的最后一步就是芯片信号检测和分析。目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。 自从1992年Affymetrix公司首次合成第一块基因芯片诞生以来，在之后的十几年里该技术以其高通量、平行性、多样化、微型化、自动化的显著特点被广泛应用到了各个领域，展现出了巨大的发展前景。 1）在医学上的应用： 基因芯片技术及其应用 李家兴1001080728 园艺107 基因芯片( gene chip, DNA chip, DNA microarray 又被称为DNA芯片、DNA微阵列和生物芯片, 是指以大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针, 按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、载玻片或塑料片上, 一个指甲盖大小的芯片上排列的探针可以多达上万个[1- 3]。在使用时,先将所研究的样品标记, 然后与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交,再用激光共聚焦显微镜等设备对芯片进行扫描, 配合计算机软件系统检测杂交信号的强弱, 从而高效且大规模地获得相关的生物信息。此项技术将大量的核酸分子同时固定在载体上, 一次可检测分析大量的DNA和RNA, 解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等的缺点[4]。此外, 通过设计不同的探针阵列( array , 利用杂交谱重建DNA序列, 还可实现杂交测序( sequencing by hybridization,SBH [5]。目前, 该技术在基因表达研究、基因组研究、序列分析及基因诊断等领域已显示出重要的理论和应用价值[6]。 1 基因芯片技术的产生和发展 21 世纪将是生命科学的世纪, 基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术, 它将像计算机一样成为21 世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石[7,8]。基因芯片技术的产生与发展与人类基因组计划(Human Genome Project, HGP 的研究密不可分[9]。人类基因组的大量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码, 基因的功能研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下, 以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了, 它被誉为是20 世纪90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。基因芯片技术充分结合灵活运用了寡核苷酸合成、固相合成、PCR 技术、探针标记、分子杂交、大规模集成电路制造技术、荧光显微检测、生物传感器及计算机控制和图像处理等多种技术, 体现了生物技术与其他学科相结合的巨大潜力。基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论, Southern 印迹可以看作是生物芯片的雏形; 其后, 人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描 基因诊断的概念 一、基本概念： 1．人类的绝大多数疾病都与基因有关，基因变异引起疾病两种类型： ①内源基因变异：由于先天遗传和后天内外环境因素的影响，人类的基因结构及表达的各个环节都可发生异常，从而导致疾病。分基因结构突变和表达异常。 ②外源基因的入侵：各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖引起各种疾病。基因改变引起各种表型改变，从而引起疾病，从基因水平探测分析病因和疾病的发病机制，并采用针对性的手段矫正疾病是近年基础和临床的方向。 ２．基因诊断：利用现代生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 二、基因诊断的特点： 1．以基因做检查材料和检查目标针对性强； 2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强； 3．分子杂交和PCR具有放大效应，故有较大的灵敏度； 4．适用性强，诊断范围广。 基因诊断的常用技术 一、核酸分子杂交： 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。 （一）核酸分子杂交的基本过程： ①DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。 ②制备探针； ③杂交； ④检测。 1．DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。 2．基因探针的概念： ①基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。 ②探针的来源： DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针（cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。 ③探针的制备： 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠杆菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。 为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。 寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。 ④探针的标记： 基因芯片技术及其应用摘要： DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。 关键词 DNA芯片制备检测应用 随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组测序得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。DNA芯片的出现是科学发展的必然产物。本文就DNA芯片的制备及其在医学领域的应用予以阐述。 1 基因芯片的制备及检测技术[1-4] 1.1 基因芯片的制备方法 1.1.1 原位合成法其中最具代表的是原位光刻合成法。该法是利用分子生物学、微电光刻技术及计算机技术等直接在基片上合成所需的DNA探针。除原位光刻合成法外，原位合成法还包括原位喷印合成和分子印章在片合成法。 1.1.2 直接点样法该法是将制备好的DNA（cDNA）片段直接点在芯片上。近来有人提出用电定位捕获法和选择性沉淀法制备芯片。 1.1.3 电定位捕获法是将生物素标记的探针在电场的作用下快速地固定在含有链霉素亲和素的琼脂糖凝胶膜上。由于生物素与链霉素亲和素的强亲合力，使得探针的固定更加容易和牢固。在电场的作用下，靶基因能快速地在杂交部位积聚，大大缩短了杂交时间，提高了杂交的效率，且改变电场电极的方向可以除去未杂交或低效率杂交的靶基因。 1.1.4 选择性沉淀法该技术是用金属纳米粒标记探针的方法来制备微阵列，靶基因在芯片上与探针杂交后发生选择性沉淀，通过检测沉淀物的电化学值等来获取相应的生物信息。 《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这 些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体 基因操作原理 《基因操作原理》课程教学大纲 课程编码：13019课程名称：基因操作原理 课程英文名 称： Princeples of Gene Manipulation 先修课程：生物化学、遗传 学、分子生物学 等 适用专业：生物技术生物科学 总学时：56 讲课学时 56 实验学时 0 实习学时 0 总学分：3.5 一、课程性质、地位和任务 “基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。 二、课程基本要求 能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。 本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。 三、教学内容及安排 绪论：基因操作的理论基础（2学时） 本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念 0.1基因的概念 0.1.1 什么是基因 0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性 0.1.3 基因的重叠与可变性 （这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考） 第一章 编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include: 1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame) 2.保证转录所必须的调控序列(S-D) 3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer) 4.内含子(intron) Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。 两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。 Development of gene engineering： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程 第二章 目的基因的获得（DNA的准备） 1.从基因组直接获得 2.RT-PCR 方法获得 3.人工合成法 DNA抽提的基本原理 ?1 获得细胞，裂解细胞 三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。 2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离） 3 纯化（去除RNA） ?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。 3 纯化（去除蛋白） ?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。 PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右 基因芯片技术及其应用 摘要 进入21世纪以来，生命科学发展日益迅速，基因芯片作为生命科学研究的一种新的技术平台日益受到人们的关注，并已经广泛应用于生命科学研究、医学研究、食品卫生领域以及其它相关的各个学科领域。随着技术的不断完善，基因芯片必将在越来越多的领域里面发挥作用。本文阐述了基因芯片的基本概念及技术流程，简述了其在不同领域的应用，并对其发展前景作了展望。 关键词：基因芯片技术流程应用展望 Gene Chip Technology and its Application Shu Mian （College of Horticulture, South China Agricultural University Guangzhou 510642, China） Abstract: Life science has developed rapidly since the 21th century, gene chip, as a new technical platform in the reaseach of Life science, has got increasingly attention, and has been used widely in life science research、medical research、food hygiene field and other related disciplines. With the continuous improvement of the technology, gene chip will be helpful in more fields. This article expounds the basic concepts and technological process of gene chip, gives an introduction of its application in different fields, and a prospection of its development prospect. Key words: gene chip technological process application prospection 基因芯片（gene chip），又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是生物芯片的一种类型，它是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。作为一项基于基因 第一章 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。 第二章 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer ：同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners ：同尾酶。来源不同、识别序列不同，?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences ：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity 星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme 切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase 测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶，切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。 12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP 为A 或G，此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。综述基因芯片技术、蛋白芯片技术的原理及应用。
基因芯片技术及其应用(精)
基因诊断常用技术与应用
基因芯片技术及其应用
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