2、高效液相色谱_电喷雾_离子阱质谱法快速推定硫酸奈替米星中有关物质的结构

高效液相色谱 电喷雾 离子阱质谱法快速推定硫酸奈替米星中有关物质的结构

袁耀佐1,张玫1,钱文1,谭力1,赵恂1,周晓华1,张正行2(1 江苏省食品药品检验所,南京210008;2 中国药科大学药物分析教研室,南京210009)

摘要:目的 应用高效液相色谱 电喷雾 离子阱质谱(H PLC ESI I T M S n)法及TFA fi x技术,快速鉴定硫酸奈替米星样品中有关物质的结构。方法 A g il ent SB C

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(4 6mm 150mm,3 5 m)色谱柱,水 三氟乙酸 甲醇(84115)为流动相,流速0 5mL!m i n-1;离子肼质谱仪正离子检测,柱后分流(32)进样,电喷雾离子源,离子源温度350?,雾化室压力275 8kP a,干燥气流速9L!m i n-1,采用T FA fix技术,即在柱后添加丙酸 异丙醇(2080)溶液,改善流动相中三氟乙酸对电喷雾离子化的抑制作用;对有标准品的有关物质,其结构通过与对照品的色谱质谱行为来确定;对无对照品的有关物质,主要以奈替米星和西索米星质谱行为为模板,根据它们多级质谱信息来推定。结果 硫酸奈替米星原料中检出9个有关物质,推定出其中7个物质的结构,分别为西索米星、去甲基西索米星、1 N 乙基 加洛糖胺、5 O 乙基 奈替米星、2# N 乙基 奈替米星、3? N 乙基 奈替米星、3 N 丙基 依替米星,解析了另两物质的部分结构。结论 建立的方法可以用于硫酸奈替米星原料中有关物质结构的快速推定,为奈替米星质量控制和工艺优化研究提供了可靠快速的分析手段。

关键词:硫酸奈替米星;有关物质;结构推定;高效液相色谱 电喷雾 离子阱质谱法

中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1001-2494(2010)18-1428-06

R api d Character izati o n of t he Re l a ted Substances i n N etil m ic i n Sulf ate Sa m ple by HPLC ESI I T M S n

YUAN Yao zuo1,Z HANG M e i1,Q I A N W en1,TAN L i1,Z HHAO Xun1,Z HOU X iao hua1,Z HANG Zheng x i n g2 (1 J iangsu Instit u te for D rug Control,N anjing210008,Ch i na;2 D epart m ent of Pharmaceutical A nal y sis,Chi na Phar m aceutical Uni versit y,N anjing210009,China)

ABSTRACT:O BJECT I VE T o character ize rap i d l y t he re l a ted substances i n ne til m i c i nsu lfate samp l e by a H PLC ESI I T M S n m eth

od w it h a TFA fi x techno logy M ETHODS T he m ethod was carried out usi ng an ag ilent SB C

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(4 6mm 150mm,3 5 m)co l u mn and a m obil e phase containi ng a m i x ture o fw ater,tr ifluo roacetic ac i d and m ethano l(84115)at a fl ow rate of0 5mL!m i n-1 Two fifth o f the colu mn e l uentw as sent i nto t he M S fo r peak charac teriza tion by sp litti ng mode T he i den tificati on o f related substances i n the ne til m i c i nsulfa te bulk sa m ple was perfo r m ed w ith a i on trap m ass spec trom eter,w it h an electrospray ionization(ES I)source i n the positive i on m ode,t he te m pera t ure o f ES I i on source is350?,nebulizi ng pressure i s275 8kPa,and dry gas flow is9L!m i n-1, a so l u tion co taini ng prop i onic ac i d and i sopropano l(8020)w as i nfused i nto t he eluent through a T p i ece to decrease t he M S si gnal suppressi on of tr ifluo roacetic acid R elated substanes wh i ch the i r reference substances can be obta i ned were identifi ed by co m pa ri ng the i r chrom atog raph ic andM S behav iors w ith those o f correspond i ng re f e rence substances,the o t her unknow n related substances were deduced usi ng the collision i nduced disso ciati on(C I D)spectra o f as temp l a tes RESULTS A t o ta l o f n i ne compounds were were character ized i n comm ercial sa m ples,a m ong wh i ch seven i m pur ities w ere identifi ed,t hey are si so m i c i n,de N me t hy l siso m ici n,1 N ethy lgara m i ne,5 O e t hy l netil m ic i n,2# N ethy l netil m icin,3? N ethy l netil m ici n and3 N propy l eti m icin,respecti ve l y,and t he oth er t wo com pounds w ere deduced parti a lly,too CONCLUSI ON The estab lished me t hod is su itab le for the rap i d i dentifica ti on o f re l a ted substances i n netil m ic i nsulfate sa m ples and qua lity control

KEY W ORDS:ne til m i c i n su lfate;related substances;character i zati on;H PLC ESI I T M S n

奈替米星(netil m icin)是在西索米星(siso m icin)的1位氨基上引入一个乙基的半合成氨基糖苷类抗生素,二者抗菌谱相似,但奈替米星对氨基糖苷乙酰转移酶稳定,且耳肾毒性低于其他同类产品[1],临床应用均为其硫酸盐。美国药典32版(USP32)、英国药典2009(BP2009)、日本药局方15版(JP% &)、?中国药典(2005年版(Ch P2005)等药典中均对有关物质进行了控制[2 5]。王建等[6]曾建立

作者简介:袁耀佐,男,博士,副主任药师 研究方向:抗生素质量研究 T e:l(025)86631609 E m ai:l yu anyaozuo@yahoo co m c n

H PLC ESI I T M S n方法对硫酸奈替米星中有关物质的结构进行探讨,但在实验中未考虑流动相中三氟乙酸对有关物质离子化效率的影响,从硫酸奈替米星样品中只检出4个杂质,对其中的1个有对照品的杂质进行鉴定外,其余几个杂质均未进行结构推定,为此,笔者在文献[6]基础上,应用了TFA fix技术[7 8],即在柱后添加丙酸,显著提高了电喷雾离子化效率,从硫酸奈替米星样品中检出了9个杂质。利用)诊断碎片离子推断策略?(D iagnostic fragm ent ion based extension strategy,DFI BES)[9 10]对检出杂质结构进行推定,即通过研究奈替米星和西索米星标准品的质谱裂解规律,总结出这类物质的质谱裂解规律,再以此结构为模型,对相似物质的结构进行推定,报道如下。

1 仪器与试药

Ag ilent1100LC/M SD Trap液质联用仪(美国Ag il e nt公司)。奈替米星标准品(批号:0355 200001,572u!m g-1)、西索米星标准品(批号: 0353 200001,584u!mg-1)均由中国药品生物制品检定所提供,硫酸奈替米星原料分别由浙江震元制药有限公司(040412)和无锡市第二制药厂(20080501B、20080501C)提供;其余试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2 1 H PLC ESI I T M S n方法

色谱条件:色谱柱:A g ilent SB C18(4 6mm 150mm,3 5 m);流动相:水 三氟乙酸 甲醇(84 115);流速:0 5m L!m in-1;柱温:35?。

TFA fi x方法:在色谱柱后接一个三通阀,用泵在柱后添加一定量的丙酸(20%丙酸,80%异丙醇,流速为0 05mL!m i n-1)。

质谱条件:ES I离子源;离子源温度:350?;雾化室压力:275 8kPa;干燥气流速:9L!m i n-1;离子扫描范围:m/z100~900;正离子方式检测,分流模式进样(分流比为32),采用全扫描一级质谱(Full scan)、自动全离子扫描二级质谱(Auto MS2)、手动多级质谱(m anualMS3~4)3种方式采集奈替米星及有关物质的质谱信息。

2 2 供试品的制备

取本品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1m L中含奈替米星约2m g(供一级质谱扫描)、5m g(供二级质谱扫描)和10mg(供多级质谱扫描)的供试品溶液。

2 3 奈替米星、西索米星标准品的质谱行为研究

用去离子水分别配制0 1mg!m L-1的奈替米星、西索米星标准品,按)2 1?的条件采集二者的一级、二级质谱,在负离子模式下未检测到相应的[M-H]-离子,在正离子模式下,奈替米星和西索米星的基峰均为[M+H]+,奈替米星加氢离子二级质谱碎片离子为:m/z458,441,350,317,299,282, 233,215,191,160;西索米星加氢离子二级质谱碎片离子为:m/z430,413,322,289,271,254,205,187, 163,160。

二者裂解规律相同:A环与B环之间的糖苷键断裂是主要的裂解途径,奈替米星/西索米星的加氢离子(m/z476、m/z448)均失去A环(-126)形成子离子(m/z350、m/z322),子离子可继续脱去C环(-159)生成对应于B环的离子(m/z191/163),或脱去B环生成对应于C环的离子(m/z160);失去A环的子离子(m/z350,m/z322)可开环裂解,失去117,形成m/z233、m/z205离子,该离子可脱水,生成m/ z215/187的离子;B环与C环之间的糖苷键也会断裂,失去C环(-159),生成丰度较小m/z317、m/ z289离子;奈替米星和西索米星加氢离子脱水(-18)是另一主要裂解途径(m/z458和m/z430),该离子还会失去中性分子NH3(-17),生成离子(m/ z441,m/z413),这两种离子均会失去C环(-159),生成对应的离子。它们的裂解途径见图1。

2 4 硫酸奈替米星样品中有关物质结构的推定

批号040412的奈替米星LC ESI I T M S在正离子模式下的全离子扫描色谱图(TI C)见图2,为表达方便,按出峰的先后顺序命名各色谱峰,有关物质的编号与色谱峰号对应,即1号峰为物质1,2号峰为物质2,以此类推。

物质1的[M+H]+为m/z350,二级质谱为:m/ z233、215、191、160,其裂解模式与奈替米星中m/ z350([B+C+H]+)的三级质谱一致,由此可以推断,物质1为奈替米星的B+C环结构,为奈替米星的主要降解产物1 N 乙基 加洛糖胺(1 N ethy l g ara m ine)。

物质2的[M+H]+为m/z434,二级质谱为:m/ z416、399、308、271、254、205、163、146,其中m/z416、399、308、146均比西索米星中的对应离子少14,即少一个亚甲基,提示物质2比西索米星少一个甲基, m/z271、254、205为西索米星A+B环的特征离子、m/z163为西索米星的B环离子,表明物质2具有西

图1 奈替米星与西索米星的二级质谱裂解途径

Fig 1 Su mma ry o f the frag m entati on pa t hways of t he pro t onated netil m ic i n (R =C 2H 5)and si so m i c i n (R =H

)

图2 典型的硫酸奈替米星LC M S 总离子流色谱图Fig 2 T ypical T IC chrom atogra m o f the siso m icin sa m ple by LC /M S

索米星的A +B 环结构,由此推定物质2中缺失的亚甲基位置在C 环上,m /z 146等碎片离子均可印证推测合理,多级质谱数据也未能确定该亚甲基缺失的具体位置,其可能结构为3?或4?位脱甲基西索米星。

3号色谱峰的[M +H ]+

为m /z 448,二级质谱裂m /z 为:m /z 430,413,322,289,271,254,205,187,163,160,与西索米星加氢离子的二级质谱一致,其色谱保留时间也与西索米星一致,可见物质3为西索米星。

物质4、物质7和物质8的[M +H ]+

均为m /z 504,比奈替米星加氢离子([M +H ]+

m /z 476)多28(相当于一个乙基的质量数),推测为奈替米星的乙基化合成副产物。

物质4的二级质谱为:m /z 504、486、387、378、345、310、261、219、160,碎片离子m /z 160为奈替米星的C 环离子,m /z 219比奈替米星中B 环离子m /

z 191多28,推测物质4中增加的乙基在B 环上,m /z 345、378、261等碎片离子分别比奈替米星的m /z 317、350、233的碎片离子多28也旁证该推测的合理性,为明确该乙基在B 环上具体位置,采用手动多级质谱模式:m /z 504+219+M S 3

,得到三级碎片离子为m /z 202,比m /z 219小17,即B 环上有自由的氨基存在,合成工艺可知,奈替米星B 环上的1位氨基为优先乙基化氨基,因此物质4B 环上自由氨基应在3位上,另一乙基化位置应为5位羟基上,由此推定杂质3的结构为5 O 乙基奈替米星。

物质5的[M +H ]+

为m /z 603,二级质谱为:585、567、350、218、191、173;碎片离子m /z 350为奈替米星B +C 环的特征离子,m /z 191为奈替米星B 环离子,提示该化合物中有B +C 环结构,为进一步

确定结构,实验中对m /z 585进行三级质谱扫描,得m /z 567、469、459、350、300、282、236、218、191、174,其中m /z 459比m /z 585少126,提示物质5中有奈替米星中的A 环结构,m /z 603比m /z 476多127的信息提示,物质5中另有一类似A 环的结构,但其中的某个氨基可能为羟基所替代。三级质谱中出现了在奈替米星、西索米星及其他杂质的质谱中均未出现的碎片离子m /z 236、218,提示该碎片离子为结构推定的关键离子,采集碎片离子m /z 236的四级质谱,得碎片离子m /z 128,125,112。根据上述一系列的质谱信息,经过结构尝试分析,最后得到物质5可能的结构见图3,用该结构解析二级、三级和四级质谱,各碎片离子均得到合理解释,提示该推测合理,该结构为首次发现,有待于用其他方法对其进一步的确认。

物质6的[M +H ]+

为m /z 520,二级质谱离子为:392、361、275、233、215、160;m /z 160对应奈替米星C 环离子,m /z 392、275、233比奈替米星B +C 环及其衍生出的离子m /z 350、233、191均大42,表明物质6与奈替米星有相同的裂解方式,但在B 环上增加丙基或丙基的同分异构体,

离子m /z 215(比m /z 233小18)提示其B 环上有游离的羟基,丙基可能在其B 环的3 氮位置,由m /z 361比奈替米星中A +B 离子m /z 317多44推测物质6的A 环比奈替米星的A 环多2,提示其A 环与依替米星一致,即在4# 5#位为饱和键,根据上述分析可知,物质6的可能结构为3 丙基 依替米星或其同分异构体。

物质7的二级质谱为:m /z 486、441、369、350、345、327、282、233、215、191、160、155,其碎片离子m /z 350、233为奈替米星B +C 环的特征离子,m /z 191为奈替米星B 环的特征离子,表明物质7的B +C 环与奈替米星相同,乙基化发生在A 环上,m /z 345、327均比奈替米星的A +B 环离子m /z 317、299多28也旁证该推测;物质7的二级质谱中出现了丰度相对较高的A 环离子m /z 155,该离子在奈替米星、西索米星及其他几个杂质的加氢离子二级质谱中丰度很低,几乎观察不到,如果A 环的2#位氨基上连接乙基,使得离子生成过程中由于发生了 H 重排,形成相对稳定的离子(图4),据此可以推出物质7的结构为2# N 乙基奈替米

星。

图3 物质5可能结构及其多级质谱裂解途径

Fig 3 T he possi b le che m ica l structure of co m pound 5and its possible pa t hway o fM S n

物质8的二级质谱为:m/z486、469、441、378、317、299、282、264、191、188、146,碎片离子m/z317、299、282为典型的奈替米星A+B环的特征离子, m/z191为奈替米星B环的特征离子,表明物质8的A+B环与奈替米星相同,增加的乙基在C环上,m/ z378比奈替米星的B+C环离子m/z350多28、m/z 188比奈替米星的C环离子m/z160多28,旁证该推测合理,为明确该乙基在C环上具体位置,采用手动多级质谱模式:m/z504+378+188+M S4,得到四级碎片离子为m/z170,144,113;对碎片离子进行分析表明,只有当乙基连接在3? 氮位上,这几个碎片离子才能得到合理解释,解析过程见图5,可以推断,物质8的化学结构为3? N 乙基奈替米星。

物质9的[M+H]+为m/z490,二级质谱中子离子为:m/z472、455、364、341、317、299、282、233、215、191、174、146,其中m/z299、282、233、215、191与奈替米星的二级质谱中对应的碎片离子完全相同,m/z299、282分别对应于奈替米星的[A+B+H -H2O]+及[A+B+H-H2O-NH3]+,表明物质9中有奈替米星的A+B环结构,增加的14应在C环上,m/z364、174均比奈替米星中对应离子m/z350 (B+C环)、160(C环)多14,推测物质9可能为物质2的二乙基化产物。

根据上述推定过程,对硫酸奈替米星样品中有关物质可能化学结构式总结见图6。

3 讨 论

硫酸奈替米星样品中有关物质来源复杂,有合成起始原料西索米星及其引入的杂质去甲基西索米星等;有降解产物如1 N 乙基 加洛糖胺,有乙酰化过程中产生的二乙酰化副产物5 O 乙基 奈替米星、2# N 乙基 奈替米星、3? N 乙基 奈替米星等,以及起始原料中杂质在乙酰化过程中形成的副产物3 N 丙基 依替米星等。提高产品质量可从以下几个方面入手:,尽量采用高纯度的合成原料,西索米星为微生物发酵产生,含有多组分,应尽量纯化;?尽管奈替米星的合成步骤较多,包括)乙酰化、三甲基硅烷化、然后再无水条件下经亚胺、还原、水解、分离、纯化?等步骤[6],但定向乙酰化过程是关键;.控制好存储条件,减少产品降解的可能。

用多级质谱,采用)诊断碎片离子推断策略?,可推定硫酸奈替米星样品中大多数未知杂质的结构,但用低分辨多级质谱进行结构确证时,有时也只能推理出结构的轮廓,结构的准确鉴定还需要借助其他的手段如高分辨多级质谱如LC ESI I T TOF,或采用LC NMR

手段。

图6 硫酸奈替米星中有关物质可能的化学结构式

Fig 6 T he proposed che m ica l structures of re lated substances i n ne til m i c i nsu lfate samp l e

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