细胞培养技术复习资料(全)题库

名词解释：

细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。

二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。

细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。

原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。

传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。

世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。

细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。

细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。

传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。

组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。

消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。

平衡盐溶液（BSS）：集缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度，同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。

清洁液：是一种不含磨蚀性物质，能迅速清除物品上污垢,分解脏污，令物品透明亮如的清洁用品。

去分化：指已分化成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。但去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化特点。

接触抑制：指细胞相互接触后失去运动（移动）的现象。

细胞融合：细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。可在自发或人工诱导下发生。它可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达相应的功能，这样的细胞称异核体，若异核体出现有丝分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞。

转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。

Stem cell:干细胞，是指一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞。

杂交瘤技术：又称单克隆抗体制备技术。是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。

杂交瘤细胞：指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞，它既保留了肿瘤细胞无限繁殖的能力，有具有参与融合的体细胞的一些特征。

克隆：指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。

单克隆抗体（McAb）：B淋巴细胞在抗原刺激下能增殖分化，转变成产生抗体的浆细胞，若将单个产生特质性抗体的B淋巴细胞分离出来，使之在体外分化增殖，产生一大群即一个克隆的细胞，这样便可得到大量的、结构相同的、均一的、针对抗原某一决定簇的抗体，这样由一个克隆B淋巴细胞产生的抗体又称为单克隆抗体。

干细胞：干细胞是人体内最原始的细胞，它具有较强的再生能力，在干细胞因子和多种白细胞介素的联合作用下可扩增出各类的细胞。其生物学特性有：1.多能性2.自我更新能力3、高度增殖能力

群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间

密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象

生长基质：培养皿表面包被的这层能改善生长表面的特性，促进细胞粘附和贴壁的物质。即生长基质

问答：

1．简述体外培养细胞的主要生物学特点。

答：体外培养细胞的生物学特点：（1）去分化：体外培养,分化特征逐渐减弱，使细胞结构与功能上的“可塑性”增大（2）贴壁铺展：粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求。细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附，是细胞培养以后能否成功的第一步.提供什么样的生长表面是细胞能否成功粘附的主要因素。铺展是进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞。极性细胞就是各种有机体细胞是在体外的特征性细胞形态（3）接触抑制和密度依赖性生长抑制：细胞生长有密度抑制，血清可降低密度抑制，转化细胞可降低密度抑制

2．简述成体干细胞的定义与特点。

答：成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。包括造血干细胞、骨髓间质干细胞及神经干细胞。成体干细胞有以下几个特点：

（1）成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。

（2）成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。

（3）成体干细胞常处于一个有干细胞细胞基质、对干细胞的增殖和分化起调控作用的各种信号分子的特定微环境或称生物位中，取决于所在的微环境和自身的功能状态。（4）成干细胞没有确定的来源。

3．试比较天然和合成培养基的各自优缺点。

答：1、天然培养基：最初的体外细胞培养，均采用天然培养基。其主要取自动物体液或从

动物组织中分离提取。天然培养基（液）的种类很多，包括生物性体液（如血清、

血浆）、组织浸液（胚胎浸液）、水解乳蛋白等。

优点：营养丰富，培养效果良好；

缺点：成分复杂，来源受限，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染。

2、合成培养基：研究者模拟、借鉴细胞在体内生存生长所需物质的种类和数量，设计出类似体内环境而适宜细胞在体外生存的各种培养基。

优点：（1）标准化生产，组成成分及含量明确便于精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况。

（2）便于控制和调整实验设计并使培养条件标准化。

（3）合成培养液中没有不透明物质，使得培养的细胞形态清晰透明，便于观察记录。

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

4．简述细胞培养污染的种类及污染的预防措施。

答：细胞污染可分为以下三类：物理性、化学性和生物性，物理污染：主要指温度、放射线、振动和辐射等。化学污染：主要指血清、培养液及试剂、水、培养用器皿和孵箱等。生物污染：主要指细菌、霉菌和酵母、支原体、病毒、细胞系交叉污染。

预防的方法：1。从物品、用品消毒灭菌着手2。从操作者做起：（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持是钥匙清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。3。早期留有充足的冻存储备，可以复苏早期冻存细胞使用。

5．试比较治疗性克隆与体细胞重新编程。

答：项目治疗性克隆体细胞重新编程

干细胞名称ES细胞iPS细胞

细胞来源供者卵母细胞和患者体细胞患者体细胞

技术路径将体细胞核移植到去核卵母细胞利用体外基因转染技术，将转录导入中，形成克隆囊胚后，分离并建到体细胞核，筛选并建立iPS细胞系

立ES细胞系

优势ES细胞技术有较丰富的经验积累，取材容易，操作方案相对简单，技无外源性基因污染术体系较稳定

主要问题卵母细胞去核技术待改进；克隆胚细胞核重编程的具体过程和导入的胎形成效率过低；建立hES细胞系转录因子的作用机制不明；制备iPS

的效率低，且不稳定；hES细胞不细胞的效率低；iPS细胞体外诱导

分化状态和多潜能性的条件待优化；定向分化的研究经验较少；逆转录

诱导hES细胞体外定向分化成熟的病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的

方案尚不完善；移植治疗存在成瘤性潜在风险；转染基因可能给机体带

风险来不利影响

伦理问题存在激烈的伦理学争议不存在伦理学争议

细胞替代治疗理论上是最有希望的途径具有潜在的应用前景

其他可能用途制备疾病的新模型以研究发病机制、药物筛选和鉴定药物治疗反应等6．对新建细胞系或株的细胞确认试验可采用哪些方法？列举一种或以上方法并说明其原理。

答：新建细胞系或株、细胞库（MCB和WCB）和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验的方法有多种，包括细胞形态、生物化学法（如同工酶试验）、免疫学检测（如HLA、种特异性抗血清）、细胞遗传学检测（如染色体核型、标记染色体检测）、遗传标志检测（如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列）等。

7．简述杂交瘤技术产生的三个技术关键。

答：（1）. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：

B淋巴细胞：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞

骨髓瘤细胞：恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。

（2）. 细胞融合技术：两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞。常用方法有生物方法：如仙台病毒化学方法：如聚乙二醇（PEG）物理方法：如电融合。

（3）. 杂交瘤细胞的筛选：人工诱导细胞融合是一个随机的过程，可能产生多种类型的细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。应根据其细胞特性来选择适当的筛选方法（如酶缺陷、药物抗性标记、营养缺陷、温度敏感等）。

B淋巴细胞：HGPRT+，TK+ 存活但短命

骨髓瘤细胞：HGPRTˉ或TKˉ死亡

杂交瘤细胞：HGPRT+，TK+ 存活

由此可见，HAT选择培养基及补救合成途径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后选择出杂交细胞株的关键因素。

8．简述体外培养癌细胞的三个显著基本特征。

答：肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性状等方面都有显著的不同。体外培养肿瘤细胞的三个显著基本特征：永生性、不受控增殖性、致瘤性。（1）永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞系（株）都表现有这种性状。永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控。从一些具有永生性而无恶性的细胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞可以证明。（2）生长增殖（不受控增殖性）：失去接触抑制，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。失去锚着依赖性，可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。低血清要求，不依赖生长因子，因其可自分泌产生促增殖因子。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。（3）致瘤性。细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度的指标。

9.细胞培养目的与用途

1. 药物研究与开发

(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等.

(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.

(3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等.

(4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发.

(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体.

基础研究

(1) 药物作用机理

(2) 基因功能

(3) 疾病发生机理

2, 生物制药

(1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.

(2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产

(4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等

10.细胞培养基本条件

1,合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.

2,优质血清

目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分.

3,无菌无毒细胞培养环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物.

4,恒定的细胞生长温度

维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.

5,合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳. 细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类.干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便.每种细胞都有其合适的培养基,

11.细胞冻存与复苏要点与注意事项

1、细胞冻存要点

(1)冷冻过程要缓慢.需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30-60分钟;然后转入-20℃,放置30分钟;然后再转入-80℃放置16-18小时(或过夜);最后放入液氮中长期保存.有条件的地方,可用程控降温仪,按每分钟-1 到-3℃速度降温,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中长期保存.

(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90%,无微生物污染.

(3)细胞浓度控制在:1×107-5×107/ml.

(4)使用高浓度血清或蛋白保护剂.一般情况下,用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20%.

(5)使用合适的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜),使用终浓度为5-10%.但是,有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.因为,DMSO能诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele),羟乙基淀粉等.

特别注意:

(1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时,以防止冰晶过大而破坏细胞.也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中,但这样做细胞存活率要低一些.

(2)DMSO稀释时会释放大量热量.因此,DMSO不能直接加到细胞液中,必须事先配制.

(3)DMSO 必须是细胞培养级别的.新买的DMSO本身处于无菌状态,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中,4℃保存.避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质.并可减少污染机会.如要过滤DMSO,必须选用耐DMSO的尼龙滤膜. 细胞冷冻保存液主要成分:冷冻保护剂,基础培养液,血清或蛋白.

常用细胞冷冻保存液:

(1)10%DMSO + 完全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液)

(2)10%甘油+ 完全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液)

悬浮细胞冷冻保存操作程序(液氮保存法):

(1)取对数生长期细胞培养物,离心200-400g 5分钟.用粘附(贴壁)细胞冷冻保存操作程序(液氮保存法):

2、冷冻保存细胞的解冻与复苏要点:

(1)快速解冻.冻存细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟).

(2)解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.一般情况下,解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养(1ml 冻存细胞液加入到25-30ml新鲜完全培养液中),24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液,以去除DMSO.如果,细胞对冷冻保护剂特别敏感,那么,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中.

特别注意:

(1)解冻时务必注意安全,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免冻伤.

(2)冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否则,易发生污染.

解冻冷冻保存细胞的离心方法:

(1)从液氮中取出冻存的细胞,立即放入37℃水浴中快速解冻.

(2)将1-2ml 冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中,轻轻混匀.

(3)用80g 离心2-3分钟,弃上清液.

(4)用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞.

(5)接种细胞到培养瓶中,起始密度为3×105/ml.

12.细胞传代要点与注意事项

1 细胞传代方法

贴壁细胞

（1）洗掉旧培养液；

（2）、用无钙镁PBS洗涤细胞一至二次；

（3）、加入适量Trypsin-EDTA溶液

方法一：37℃或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。

方法二：37℃或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止trypsin作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。

悬浮型细胞

（1）、吸去细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm、5min

（2）、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养。

2 细胞传代时注意事项

（1）、紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半个小时后再进入。

（2）、所有的实验器材都要经过消毒处理，所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。（3）、细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境，补加生长液后要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。

（4）、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只能进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。PBS，培养液和消化液应严格分开。

（5）、每天观察细胞状态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长至致密单层后即可传代。

13.细胞培养的基本概念、原理、优缺点及实际意义

细胞培养是指生物体内取出细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、成长、并维持其结构和功能的方法。

1.培养的组织器官或细胞，能在一定范围和程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培

养的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物质基础。

2.细胞培养和生物工程：已经成为生物技术产品的核心。如目前可提供的产品，病毒疫苗、

非抗体型免疫调节剂、多肽生长因子、酶类、激素、杀虫剂、各种单克隆抗体。

3.细胞培养技术的商业化

4.局限性：细胞培养，包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系等，不能

代表整个机体。在进行医学生物实验的过程极结果的评估时是都必须考虑这些。