血凝操作规程

血凝项目标准操作规程

1．一般注意事项

1.1样品采集

●静脉抽血；

●穿刺要一针见血，避免淤血，气泡，溶血和组织液污染；

●如果使用真空采集管，以第二或第三管样品为佳；

如果从导管取样，则需用生理盐水冲洗管道，前面5ml血不能使用；

●采血后立即与抗凝剂充分混合，尽快送往实验室；

●采血量必须准确，如果少于计划量的90%，则不能使用；

●不能在静脉穿刺部位或附近部位采样。

1.2样品处理

●使用3.8%或3.2%(W/V)枸橼酸钠溶液作为抗凝剂；

●血样与抗凝剂的比例为9：1，如果血球压积﹤20%或﹥55%，则需调整这个比例，

方法是：0.00815X血液毫升数X(100-压积)=抗凝剂毫升数；

●血浆分离（如果不能立即测试，应尽快分离血浆）；

——采样后60分钟内进行；

——离心速度为1000g/10分钟

●盛血浆容器应加塞，防止PH改变；

●血浆应保存在2-8℃；

●血浆存放时间不能太久；

●低温保存的样品，要在37℃迅速解冻，减低凝血因子的消耗，并立即测试。

●与样品接触的所有器材（注射剂，样品管，检测杯等）必须采用塑料袋或硅化玻璃材质。

●全部器材均不得含去污剂或清洗液。

1.3影响测定结果的几种因素

●抗凝剂：草酸钠、EDTA、肝素不适于作抗凝剂；

●黄疸，脂血，重度溶血和冰冻血浆影响测定结果不准；

●使用纤溶药物，如双香豆素，链激酶，尿酶等可使凝固时间延长；

●超过治疗试剂量的肝素使凝固时间延长；

●FDP增加使凝固时间延长；

●某些药物，如口服避孕药，雌激素，天门冬酰胺酶，钠络酮等影响测试结果；

●样本采集和处理不当，都会使凝固时间缩短或延长；

●妊娠和急性炎症会影响某些测试结果。

1.4干粉试剂及血浆溶解

●保证干粉完全溶解；

●溶解时，轻轻转动容器，避免剧烈震荡；

●确认溶剂种类，一般溶解液包括：蒸馏水/生理盐水/缓冲液/厂家特定溶解液，按说明书选择；

复溶后，室温放置5-10分钟后方可使用

二．具体项目操作注意事项

1.PT凝血酶原时间

I. 概述

凝血酶原时间(Prothrombin Time)测定用来作为外科手术前对某一凝血因子的评价，以及用于监视抗凝治疗，当进行凝血酶原时间测试时，对于正常结果需有2、3级所有因子。因此，该实验对因子I、II、V、VII和X的量减少或不足是很灵敏的。

除了因子IX，凝血酶原时间测试对于其它所有因子缺乏是灵敏的，它已被证明在监视抗凝治疗是有效手段。

凝血酶原时间测定也用于因子II、V、VII和X的定量分析(因子分析)。

II.试剂

干粉试剂需复溶，液体试剂直接使用，使用前轻轻混合，可使用一些备件如搅拌。使用期间保持适当的悬浮液状态。如质控结果在范围之外，或试剂颜色发生变化，可能表明产品变质。然而，差的性能、结果也可能是由于其他因素包括试验系统引起的。

警告：PT-DS试剂含有叠氮钠，勿服、勿接触皮肤和黏膜。

III. 样本收集

3.8%(0.109M)枸橼钠做为抗凝剂。避免溶血和其他组织液的污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g下离心10分钟，如样本在22—24℃下，须在2小时内测定。有关样本收集和储存的详细资料，请参见NCCLS文件。

IV. 步骤

提供材料PT试剂

另需材料：

①纯化水

②合适的计时器

③精密移液管：0.1ml和0.2ml

④正常和异常质控物，（凝血质控血浆三个水平)

PT适合于手工、仪器、光度计和其它凝固的测定方法。

手工方法

A：在37℃预热PT试剂；

B：加0.1ml血浆到比色杯中，在37℃下预热；

C: 用力加0.2ml预热的PT试剂到血浆中凝结形成，并记录时间建议至少使用一正常和一异常对照血浆，每40份病人样品至少一次轮换，逐日测定对照血浆，建议每个实验室应做好室内质控范围。

V. 结果

用最近的0.1秒报告每个血浆的凝固时间，所得PT时间结果与正常参考范围值一起列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人比值。质控仅仅是为了保证试验系统的准确性。)

VI. 局限性

血凝生物化学包含一系列受许多预试验条件影响的反应。这些变异性必须被控制，以获得好的结果：

样本收集

勿延迟血液与抗凝剂的混合；

避免样本产生泡沫；

用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；

混浊、溶血、脂血或黄疸的样本，可能会引起错误结果；

冷冻和解冻包含残留细胞血浆，会裂解细胞膜而影响结果；

急性炎症反应由于纤维蛋白原的升高，会缩短PT结果；

红细胞压积在20—55%范围以外，所加抗凝剂需调整比例。

技术：

如果血浆暴露到空气中pH将升高；

PT工作要求37℃±0.5℃。经常检查加热部分的温度。在4—8℃保持的血浆可能会引起冷激活而导致PT缩短；

所有的实验器皿必须清洁，没有脏物痕迹；

按照仪器供应商的要求，保养仪器。

影响物质：

草酸钠，EDTA和肝素不适合做抗凝剂；

口服避孕药物、天门冬氨酰胺酶、皮质酮、EDTA、红霉素、酒精、四环素和抗凝剂如肝素和华法令可能引起PT延长。

抗组织胺药、布塔巴比妥、咖啡因、口服避孕药、苯巴比妥、维生素K.可能引起PT缩短。

VII. 期望值

PT对正常人评估可获得以下结果

平均±2SD范围

仪器11.9 11.0—15.0

可见光度计12.5 10.7—14.3

这些值仅作为一个指导，每个实验室应建立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样收集技术或抗凝剂的改变，都应重新建立新的正常参考范围。

有关性能特征、因子分析精密度等详见英文说明书。

2.APTT测定试剂

I. 概述

APTT(Activated partial Thromboplastin time)测试广泛应用已有数年，用作外科手术对某些凝结因子的评价，以及监视肝素治疗。当测定APTT 时，所有内途径因子对于正常结果是必需的。然而它主要地用于检测2级因子的不足，即因子VIII、IX、XI和XII，以及Fletcher因子(4)。

APTT测试也用于监视肝素治疗，测定结果显示延长0.1单位以上(5)。

此试验也用在因子VIII、IX、XII和Fletcher因子的定量测度(因子分析)。

II. 摘要与原理

APTT的延长直接与肝素量的增加成正比。APTT时间测定就是加入APTT试剂混合物在此37℃孵育3分钟“激活”，再加CACl2计数凝块形成时间。

III. 试剂

试剂在2—8℃保存，勿冷冻，开瓶后在2—8℃可稳定30天。长时间储存后，可能会出现黄色沉淀。在使用前轻轻混合。不稳定值、超出质控范围之外的值或产品颜色变化，可能表明试剂变质。然而其它因素包括试验系统也可能引起这些误差。

IV. 样本收集

3.2%(0.105M)或3.8%(0.109M)柠檬酸作抗凝剂，避免溶血和其它组织液体污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g离心10分钟，如样本放在22—24℃下，需在2小时内测定。有关样本收集和储存的详细资料，请参见NCCLS文件。

V. 步骤

提供材料：APTT试剂。

另需材料：

①美创公司提供的CaCl2(0.025M)，高纯度、高质量；

②适当的计时器(秒表和时间表)；

③精密移液管：0.1ml；

④正常和异常质控，(凝血质控血浆，1、2、3、三个水平)APTT是适用于手工、仪器、光度计和其它凝结测定的方法。

手工方法：

A：在37℃预热CACL2(0.025M)；

B：加0.1ml测定血浆到比色杯中，在37℃预热；

C：加0.1ml预温过的APTT试剂入测定血浆中，混合；

D：在37℃下孵育血浆试剂混合物3分钟。(激活时间)，为了试验的一致性，用同样的激活时间，测定所有血浆；

E：用力加0.1ml预热的CACL2，凝结形成，注意凝块形成时间。用正常、异常质控血浆(如美创公司的质控三个水平1、2、3)与病人血浆结合

起来测定。建议至少用一个正常和一个不正常血浆，至少每测20份病人样本轮换一次。

VI. 结果

用最近的0.1秒报告每个血浆的凝结时间，所得APTT时间结果与正常参考范围值一起列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人的值。质控仅仅是为了保证试验系统的准确性。)

VII. 局限性

血凝生物化学包含一系列受许多预试验条件影响的反应。这些变异性必须被控制，以获得好的结果。

样本收集：

勿延迟血液与抗凝剂的混合；

避免样本产生泡沫；

用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；

混浊的溶血、脂血或黄疸的样本，可能引起错误结果；

反复冷冻和解冻血浆，会损伤细胞膜，会影响结果；

血胞压积在22—25%范围之外，所加抗凝剂需调整比例；

技术：

如果血浆暴露到空气中pH值将升高；

APTT工作要求37℃±0.5℃，经常检查所有加热部分的温度；

所有的试验器皿必须被清洁，没有赃物痕迹；

按照仪器供应商的要求，保养仪器。

影响物质：

草酸钠，EDTA和肝素不适合作抗凝剂；

口服避孕药物，雌激素，怀孕，氧杂萘邻酮类的药物，肝素，天门冬氨酰胺酶和naloxone已有报道报告会影响APTT结果。

VIII. 期望值

APTT-LS正常人可获得下面结果：

平均±2SD范围

仪器28.6 24-38

可见光度计26.0 23.4—28.6

这些值仅作为一个指导，每个试验室应建立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样收集技术或抗凝剂的改变，都应重新建立新的正常参考范围。

3 .纤维蛋白原

采用clauss法，即在待检稀释血浆中加入高浓度的凝血酶，血浆凝固时间与血浆纤维蛋白原浓度成反比。

二、试剂及材料准备

1. 冻干牛凝血酶(100NIH Unit/ml)干粉或液体

2. 纤维蛋白原参比血浆

1.0ml/瓶，3瓶/盒

该制剂系人枸橼酸钠抗凝血浆，加入稳定剂和缓冲液后冻干而成。使用前用蒸馏水溶解，轻轻摇动至完全溶解。2—8℃存放可以稳定一周，也可-20℃冻存，避免反复冻溶。

3. 咪唑缓冲盐水(pH7.4±0.2)

135ml/瓶，1瓶/盒

该缓冲液以叠氮钠为防腐剂，叠氮钠如遇酸将产生有毒化合物，因此，含有该剂的容器、试管及丢弃的试剂均应用大量流水冲洗。此外，亦应避免该试剂在金属管道内沉积。

4. 塑料试管(自备)

5. 移液器100μl、200μl(自备)

6. 正常及异常质控血浆(自备)

7. 双对数坐标纸

三、方法

(一) 标准曲线的制备

1. 稀释的纤维蛋白原参比血浆的制备

将已知浓度的纤维蛋白原参比保存浆用咪唑缓冲盐水稀释成1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶40，5个浓度。

2. 每稀释度各取0.2ml、37℃预热5分钟，然后加入室温的凝血酶，记录各稀释度的血浆凝固时间。每稀释度重复2—3次测定，取平均值。

3. 以各稀释度纤维蛋白原的浓度为纵坐标，对应的血浆凝固时间的平均值为横坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线，每条标准曲线至少应包括所做的5个稀释度中的连续3个以上的点。否则结果不予接受，应重新绘制。

(二) 标本的测定

1. 标本采集：3.2%或3.8%的枸橼酸钠1∶9抗凝全血，以RCF3000×g离心10分钟，分离血浆待检。在室温条件下，标本存放不应超过2小时，2小时不能完成检测，应冻存。

2. 测定步骤

①待检标本用咪唑盐水1∶10稀释。

②取1∶10稀释的血浆0.2ml、37℃预热5分钟，然后加入0.1mL

已预热的凝血酶试剂，记录血浆凝固时间。

③根据血浆凝固时间在标准曲线上查得标本的纤维蛋白原浓度。

④若血浆凝固时间超出标准曲线的范围，若过长将标本作1∶5稀释,过短改作1∶20稀释，重新测定凝固时间，如标本作1∶5稀释，将从曲线上查得结果除2，如标本作1∶20稀释，将从曲线上查得结果乘2，得到最终结果。

四、参考范围2.0g～4.0g/l(200～400mg/dl)

五、注意事项

1. 分离的血浆中不应含有细胞成分；

2. 纤维蛋白原含量低于1.5g/l，而血浆FDP含量明显增高时，可致标本的测定结果较实际结果低；

4. TT测定

一、样本收集

A. 抗凝细胞压积剂：3.2%枸橼酸钠血样与枸橼酸盐的比例为9∶1。然而，对于个别病人血细胞压积低于20%或高于55%，须调整这个比例以保证获得结果。下面公式用来计算调整抗凝剂的量。

0.00185×血液(ml)×(100-血细胞压积) = 抗凝剂(ml)

B. 样本收集：血样可用针刺或其它方法取得。针刺是非损伤性的，避免溶血或其它组织液的污染。

C. 样本处理：血液收集后立即用抗凝剂轻轻混合，用RCF3000×g 离心10分钟，过多血小板污染的血浆可能会引起一些因子水平假性升高，包括纤维蛋白原(因子1)，分离血浆勿使红细胞混入，或立即做实验。盖好样品以免样品pH值变化而影响试验结果。样本在22—24℃下, 可稳定2小时，在-20℃下稳定2周，在-70℃下稳定6个月，样本在37℃下快速解冻并立即测定。

二、试剂

TT试剂在2—8℃下保存。

三、凝血酶凝结时间步骤

37℃孵育0.2ml未稀释的血浆3分钟，加0.1ml TT试剂，测定凝结形成时间。

四、解释

像其它试验一样，正常范围根据实验室，和所使用的仪器的不同，会有所不同。然而，当使用TT试剂如上面步骤三所提到的试验时，正常的个人将凝血酶原时间一般地约为10-18秒。

五、参考文献(略)

肝素可致本方法测定结果减低。