巴氏染色液EA 染色液使用说明书
EA50染色液使用说明书
【产品名称】EA50染色液
【产品编号】EA50-OT-100，EA50-OT-500，EA50-OT-1L，EA50-OT-2.5L
【包装规格】100ml500ml1000ml2500mL
【预期用途】细胞质染色试剂，用于Papanicolaou染色法细胞学上使用的对比
染料
【检验原理】
EA50染色液,Pap3B试剂为伊红Y和亮绿SF酸（加入了磷钨酸，PTA）染液的酒
精溶液。Papanicolaou染色，首先用苏木素将细胞核染色，之后用OG-6试剂和
EA试剂继续染色。橘黄G染料对细胞质染色，并保持在成熟细胞和角质化细胞。
之后的EA试剂对未染色的细胞组分染色，如鳞状细胞，核仁，纤毛，红细胞。
测试样本可为妇科细胞样本和非妇科细胞样本，如痰液，尿液，细胞穿刺等。为
获得优质的染色效果，EA50Pap3B试剂特性与KOHYPATH其他用于细胞学涂片
染色试剂（苏木素HP，Pap1A试剂，OG-6，Pap2A试剂）相符。
【主要组成成分】含生物染料级别（BSC）的伊红Y和亮绿SF，并添加磷钨酸和
适当的稳定剂，两者浓度和比例不同于其他EA Pap试剂。
细胞学涂片染色：
收集和准备细胞学材料的两种方法：
收集细胞学样本后置于载玻片（Vitro Gnost）上，立即喷洒固定液（CitoSpray）
进行固定，干燥后染色备用。样本固定后可放置于95%乙醇（Histanol95）
中30min。
用液体基质的细胞学方法（LBC），刷子刷下细胞学样本，立即浸入固定液（CitoFix）
固定。染色前，从固定液中分离样本细胞（离心固定液），置于载玻片上，准备
进一步染色。
巴氏（Papanicolaou）染色法，进行性染色：
染色之前，样本材料应收集并固定于载玻片上。
如样本已经用CitoSpray固定并干燥，应放置于95%乙醇（Histanol95）中
10min，以去除聚乙二醇；若样本是经95%乙醇（Histanol95）溶液固定，
请忽略此步骤。细胞学样本染色过程中（用LBC法），包含低浓度乙醇，因此无
需用递减梯度的乙醇进行水化。后续用苏木素HP，Pap1A染色。
1.递减梯度浓度乙醇溶液（Histanol95,Histanol
4组，每次上下跌落6-8次80and Histanol70）水化，并用蒸馏水或去离
子水冲洗
2.苏木素HP，Pap1A染色2-3min
3.Scott溶液或显蓝试剂处理1min
注：若没有此试剂，可直接用自来水冲洗3-5min
4.递增梯度浓度乙醇溶液（Histanol70,Histanol
3组，每组上下跌落6-8次80and Histanol95）进行脱水
5.OG-6，Pap2A染色2-3min
6.95%乙醇（Histanol95）冲洗2次，每次上下跌落6-8次
7.EA31，Pap3A试剂染色/EA50，Pap3B试2-3min
剂染色
8.95%乙醇（Histanol95）冲洗上下跌落6-8次
9.100%乙醇（Histanol100）脱水上下跌落6-8次
10.100%乙醇（Histanol100）脱水3-5min
11.二甲苯（BioClear）或其替代物（BioClear New）
透明处理
上下跌落6-8次12.二甲苯（BioClear）或其替代物（BioClear New）
透明处理
3-5min
透明化处理后应?即?合适的封?剂进?封?。如果使??甲苯（BioClear）透明化，对应使?KOHYPATH?甲苯基质的封?剂（BioMount，BioMount High，BioMount M，BioMount DPX，BioMount C，或普通BioMount）；如果是由?甲苯替代物（BioClear New）透明化，使?BioMount New封?。
使?盖玻片覆盖。
注意事项：
为防?苏木素HP，Pap1A溶液沉淀和表?形成?属光泽漂浮物，使?前过滤处理。
染色时间为非标准化、固定化，需要根据临床和实验经验来调控。
建议的操作方法是根据KOHYPATH试剂的特性和长时间的临床和实验经验。
染色强度根据染色时间而定，实际染色操作需根据具体实验需求确定。
在符合细胞学技术操作的前提下，染色流程可根据个人实验需求改变。
巴氏（Papanicolaou）染色法，退行性染色：
退行性染色法使样本染色后更加容易区分，细胞核结构更加清晰。
染色之前，样本材料应收集并固定于载玻片上。
如样本已经用CitoSpray固定并干燥，应放置于95%乙醇（Histanol95）中10min，以去除聚乙二醇；若样本是经95%乙醇（Histanol95）溶液固定，请忽略此步骤。细胞学样本染色过程中（用LBC法），包含低浓度乙醇，因此无需用降低梯度的乙醇进行水化。后续用苏木素HP，Pap1A染色。
1.递减的梯度浓度乙醇溶液（Histanol95,
Histanol80and Histanol70）水化，并用蒸
馏水或去离子水冲洗4组，每次上下跌落6-8次
2.苏木素HP，Pap1A染色6min
3.蒸馏水或去离子水冲洗上下跌落6-8次
4.HCL Pap溶液或0.1%HCl溶液分化处理5-10s
注：此步骤可去除细胞核和细胞质上过多的苏
木素染液，但分化时间过长会使细胞核发生褪
色。
5.蒸馏水冲洗上下跌落6-8次
6.Scott溶液或显蓝试剂处理1min
注：若没有此试剂，可直接用自来水冲洗3-5min
7.递增梯度浓度乙醇溶液（Histanol70,
Histanol80and Histanol95）进行脱水3组，每组上下跌落6-8次
8.OG-6，Pap2A染色3min
9.
95%乙醇（Histanol95）冲洗2次，每次上下跌落6-8次
10.EA31，Pap3A试剂染色/EA50，Pap3B试剂
染色
3min
11.95%乙醇（Histanol95）冲洗上下跌落6-8次
12.100%乙醇（Histanol100）脱水上下跌落6-8次
13.100%乙醇（Histanol100）脱水3-5min
14.二甲苯（BioClear）或其替代物（BioClear New）
透明处理
上下跌落6-8次15.二甲苯（BioClear）或其替代物（BioClear New）
透明处理
3-5min
透明化处理后应立即用合适的封?剂进?封?。如果使用二甲苯（BioClear）透明化，对应使?二甲苯基质的封?剂（BioMount，BioMount High，BioMount M，BioMount DPX，BioMount C，或普通BioMount）；如果是由二甲苯替代物（BioClear New）透明化，使?环保封片剂BioMount New进行封?。
使?盖玻片覆盖。
注意事项：
为防?苏木素HP溶液沉淀和表?形成?属光泽漂浮物，使?前过滤处理。
染色时间为非标准化、固定化，需要根据临床和实验经验来调控。
建议的操作方法是根据KOHYPATH试剂的特性和长时间的临床和实验经验而整理的
染色强度根据染色时间而定，实际染色操作需根据具体实验需求确定。
在符合细胞学技术操作的前提下，染色流程可根据个人实验需求改变。
染色结果：
蓝色—细胞核
黄色至橙色—角质化细胞
粉色至红色—表皮鳞状细胞，红细胞，核仁，纤毛
绿色—其他细胞胞质（副基底和中层鳞状细胞，柱状细胞，多核细胞白细胞，淋巴细胞，组织细胞，腺癌细胞及未分化癌细胞）
【储存条件及有效期】保证产品包装完整的情况下，储存温度在+15°C和+25°C 之间。保持储存环境干燥，不要放置于寒冷的环境中，不要冷冻产品，避免直接阳光直射。产品使用效期为2年，具体效期见标签。
【适用仪器】不适用
【样本要求】使用合适的设备仪器收集组织样本，并标记清楚，根据操作说明进行实验。
为避免发生错误，染色及诊断过程最好由具相关专业知识的技术人员操作。
根据标准医疗诊断实验室标准镜检诊断。
【参考文献】
1.Papanicolaou,G.N.(1941):Some improved methods for staining vaginal smears.J Lab Clin Med.
2.Papanicolaou,G.N.(1942):A new procedure for staining vaginal smears. Science.
3.Carson,F.L.,Hladik C.(2009):Histotechnology:A self-instructional text,3rd ed.ASCP Press.
售后服务单位名称：上海科汇生物技术有限公司
联系方式：4008207036
代理人的名称：上海科汇生物技术有限公司
住所：上海市闵行区新骏环路115号3幢B420室
联系方式：4008207036
巴氏染色法
巴氏染色液说明书 【产品名称】 巴氏染色液 【包装规格】 货号：DA0082 单瓶(盒)包装规格：100ml 、250ml 、500ml 、5000ml ； 套组(盒)包装规格：4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 主要用于对脱落细胞的组织细胞学染色。 【检验原理】 细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法，橘黄G 与EA36或EA50联合使用可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色，细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料的亲和力较强；而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力较大。巴氏染色液利用这一特性对细胞进行多色性染色，细胞经染色后能清晰地显示细胞的结构，胞质透亮鲜丽，各种颗粒分明，细胞核染色质非常清楚，从而较容易发现异常细胞。通过巴氏染色可反映出细胞在炎症刺激下和癌变后的形态学变化，对早期发现和诊断一些病变和肿瘤具有较重要意义。 【主要组成成分】 试剂组成 主要成分 l 、苏木素染色液 苏木素 2、1%盐酸乙醇分化液 盐酸、乙醇 3、橘黄G 染色液 橘黄G 4、EA50染色液或EA36染色液 EA50染色液：淡绿、伊红、磷钨酸、冰乙酸； EA36染色液：淡绿、伊红、磷钨酸 【储存条件及有效期】 5℃～35℃环境保存，原包装未开封染色液的有效期为18个月，在有效期内的已开封染色液建议在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 新鲜标本涂片后，应尽快用95%乙醇固定，以避免细胞变形。 【检验方法】 1、固定：将细胞涂片置于95%乙醇中固定； 2、染色，按要求进行染色。 3、二甲苯透明，中性树脂封片，镜检。 【检验结果的解释】 【检验方法的局限 性】 仅供形态学初检观察染色使用。 【注意事项】 1、冬季气温较低时，苏木素染色液不易着色，可适当延长染色时间。 细胞核 蓝紫色或黑色 非角化细胞的胞质 淡蓝色或淡绿色 角化细胞的胞质 粉红或橘黄色 红细胞 鲜红色或橙红色 粘液 淡蓝或粉红色
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。
抗酸染色——标准操作
抗酸染色 一、原理 本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。 二、试剂 石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液 三、方法 1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰
2.固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色 3.染色 3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温 3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止 3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟 3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检 3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块 四、结果判定 1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
13.巴氏染色液
巴氏染色液说明书 【产品名称】巴氏染色液 【产品名称】巴氏染色液PAP Staining Solutions 【产品编号】PAP-500ml,PAP-1000ml,PAP-2500ml 【包装规格】苏木素染色液500ml、1000ml 2500ml；橘黄G6染色液500ml、1000ml 2500ml；EA50染色液500ml、1000ml 2500ml。 【预期用途】主要用于对脱落细胞的组织细胞学染色。 【检验原理】 巴氏染色液由3部分组成：苏木素染色液、橘红G6染色液和EA50染色液。 苏木素染色液，是一种针对正常以及变态细胞学涂片染料，对核膜、核质、核仁染色效果非常清晰。涂片标本可是妇科或非妇科的，如痰液，尿液及细胞学穿刺样本。为获得优质的染色效果，苏木素染液技术完全按照帕氏染色法，以及OG-6染液；EA 31染液；同时供应选择性多色复染染料，如EA50试剂；EA65试剂，满足细胞学染色需求。 橘黄G6染色液，是橘黄G (Orange G) 染料添加磷酸（PMA）后的酒精溶液。Papanicolaou染色，首先用苏木素将细胞核染色，之后用OG-6 试剂和EA试剂继续染色。橘黄G染料对细胞质染色，并保持在成熟细胞和角质化细胞。之后的EA试剂对未染色的细胞组分染色，如鳞状细胞，核仁，纤毛，红细胞。测试样本可为妇科细胞样本和非妇科细胞样本，如痰液，尿液，细胞穿刺等。为获得优质的染色效果，OG-6试剂特性与其他用于Papanicolaou染色法中染色试剂-苏木素试剂，EA 31试剂，及对比染色试剂EA50试剂，EA65试剂相符。 EA50染色液,为伊红Y和亮绿SF酸（加入了磷钨酸，PTA）染液的酒精溶液。Papanicolaou染色，首先用苏木素将细胞核染色，之后用OG-6 试剂和EA试剂继续染色。橘黄G染料对细胞质染色，并保持在成熟细胞和角质化细胞。之后的EA试剂对未染色的细胞组分染色，如鳞状细胞，核仁，纤毛，红细胞。测试样本可为妇科细胞样本和非妇科细胞样本，如痰液，尿液，细胞穿刺等。为获得优质的染色效果，EA 50 Pap 3B试剂特性与其他用于细胞学涂片染色试剂（苏木素试剂，OG-6试剂）相符。 【主要组成成分】 苏木素：乙二醇、苏木素、碘酸钠、硫酸铝；橘黄G染液：橘黄G6、磷酸、稳定剂；EA50：伊红Y、亮绿 SF、磷钨酸、稳定剂 【储存条件及有效期】保证产品包装完整的情况下，储存温度在+15°C 和+25°C
细胞DNA定量分析在脱落细胞学诊断中的应用
细胞DNA 定量分析在脱落细胞学诊断中的应用 王永军，王 珩，刘世正，杨会钗，王小玲，王占东，郭明，杜芸 摘要：目的 探讨自动细胞DNA 定量分析系统在良恶性胸水、腹水、心包积液及乳腺包块诊断中的价值。方法 297例浆膜 腔积液（胸水185例、腹水94例、心包积液18例），经细胞采集器处理，每例制成4张薄层细胞片，2张细胞片做巴氏染色，用于常规细胞学检查。另2张经Feulgen 染色，用自动细胞DNA 定量分析系统检测。122例乳腺包块住院患者，诊断医师进行针吸穿刺后每例制成2张薄层涂片，1张涂片做巴氏染色，用于常规细胞学检查。另1张经Feulgen 染色，用自动细胞DNA 定量分析系统检测。每例均有病理结果证实。结果 297例浆膜腔积液标本常规检测138例（44.5%）异常，而同样的标本中 DNA 定量检测131例（44.1%）异常。常规细胞学诊断为癌及可疑癌细胞84例中100%出现异倍体细胞，常规诊断为找到异型细胞的54中有47例（87%）出现异倍体细胞。122例乳腺肿物经病理证实， 41例为乳腺良性肿瘤，81例为恶性。常规细胞学方法对良恶性乳腺包块的诊断阳性率分别为92.7%、91.4%，AICM 的诊断阳性率分别为100%、90.1%。结论应用自动 细胞DNA 定量分析系统可弥补常规形态学工作的不足，二者协同诊断，可发现早期癌变的细胞，提高诊断率，为临床制定治疗 方案提供有价值的信息，使细胞学检查工作更完善、客观。关键词：细胞学；DNA 分析；异倍体中图分类号：Q 24 文献标识码：A 文章编号：1001－7399（2011）02－0150－04 Celluar DNA quantitative analysis in cytology for clincal application in diagnosis WANG Yong-jun ，WANG Heng ，LIU Shi-zheng ，YANG Hui-chai ，WANG Xiao-ling ，WANG Zhan-dong ，GUO Ming ，DU Yun （Department of Pathology ，the Fouth Hospital of Hebei Medical University ，Shijiazhuang 050011，China ）Abstract ：Purpose To differentially diagnose the benign and malignant ，peritioneal effusions ，pericarditis effusions and breast masses by using automatic imaging cytometer．Methods In 297samples of serous effusions ，including 185samples of hydrothorax ，94peri-tioneal effusions ，18pericarditis effusions ）were processed with a cell collectioner ，4slides were prepared for each sample ：2sliders were stained by Papanicolaou method for cytology analysis ，and other 2sliders were stained with Feulgen method for DNA imaging cy-tometer．In 122patients with breast masses ，2smears were prepared by fine-needle aspiration puncture for each patient ：1for Papanico-laou stain for cytology analysis ，and other 1for Feulgen stain for DNA imaging cytometer．Pathological results were confirmed in each case．Results In 297samples of serous effusion ，138（44.5%）were abnormal by cytology analysis ，and 131（44.1%）were abnormal by DNA imaging cytometer．By cytology analysis 84were found as cancer cells and dubious cells ，and 100%were found heteroploid cells．By cytology analysis 54were found a few proliferating cells ，and 47（87%）were found heteroploid cells．In the pathologically confirmed breast masses ，41were classified as benign and other 81as malignant．Cytological investigation showed 92.7%sensitivity for benign and 91.4%sensitivity for malignant ，while DNA imaging analysis revealed 100%sensitivity for benign and 90.1%sensitiv-ity for malignant．Conclusions The automatic imaging cytometer can remedy insufficiency of routine cytology ，and collaboration of the two methods could improve the diagnostic rate of breast cancer ，which provides valuable information for clinical manegement and makes cytology analysis more perfective and objective．Key words ：cytology ；DNA analysis ；heteroploicl cells 收稿日期：2010－04－20 基金项目：河北省科技厅科技支撑计划（09276174）作者单位：河北医科大学第四医院病理科，石家庄050011作者简介：王永军，女，副主任技师。Tel ：（0311）86095374， E-mail ：shan_jianli@126．com 王小玲，女，硕士生导师，教授，通讯作者。Tel ：（0311）86095663，E-mail ：wangxiaoling5412@163．com 疾病的诊断，既要从整体、器官和细胞水平上认 识和分析，还应从蛋白质、mRNA 和DNA 水平上来认识和分析 ［1］ 。随着新技术的发展，肿瘤细胞DNA 含量的研究被广泛、深入的应用，使肿瘤的研究提高 到了定量研究的分子水平。细胞病理学医师除对病变作出诊断外，还应考虑到细胞学的改变与制定治疗方案和评估预后的关系，而DNA 定量分析技术能在形态学改变的基础上提供更准确、客观、重复性好 的增添信息［2］ 。因此利用脱落细胞常规检测结合细胞DNA 定量分析，可以极大的完善脱落细胞的检查工作，使其更加准确、快捷，为临床治疗提供有价值的信息。
巴氏染色的几点体会
巴氏染色的几点体会 李瑞祥熊灏靳敏 巴氏（Papanicolaou）染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。其适用于上皮细胞及间皮组织的标本。是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法。该染色法不但具有显示细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。对如何染好巴氏染色，笔者有以下几点体会，报告如下。 1 EA 36 染液pH值的测试 EA 36 染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 36 染液由伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等染料配成。伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等属于酸性染料。在溶媒中其发色团是负离子部分。发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色。但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电）。在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电）。所以必须把染液pH 值调至5.2为宜［1］。EA 36 染液pH的调节，可用石蕊试纸法，也可用酸度计测试。当然用酸度计法最为准确。但以上方法均比较麻烦，同时还要受到仪器设备的限制，不方便。本文采用一种简单方便的方法。即用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试。具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂。并充分混匀。直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。用此法测试染液pH同用石蕊试纸法测试一样，同样可获得满意的染色效果。磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂。可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱。保证染色达到理想效果。 2 分色 分色或酸化，对染色效果也很重要。分色目的是去掉胞浆中染上的多余的苏木素，使胞核着色显示特异性。因此，经分色后的胞浆在镜下观察应无色为佳。若胞浆中还残留有苏木素染料，会影响EA 36 染液的着色。结果会出现该红的胞浆不红，该绿的胞浆不绿，或不红不绿的现象。看不到红蓝相间现象。因此，掌握好分色是关键。分色时间不能过短或过长。太短胞浆中苏木素除不尽，太长会把核上的苏木素也退掉。每次应在数秒内完成。盐酸浓度应偏低（0.5%为好）。这样便于掌握分色的时间。 3 蓝化或碱化 蓝化的目的是使胞核着色更具有特异性。经蓝化后的胞核紫中带蓝。这与红色的胞浆对比更鲜明。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱。因此，蓝化过程中碳酸锂还可中和分色时可能残留下的少量盐酸。为EA 36 的着色创造良好条件。所以蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好［2］。 若涂片经EA 36 染色后，镜下观察效果不理想时。根据涂片着色情况，可于EA 36 染液中滴加少量10%磷钨酸或饱和碳酸锂后重染EA 36 3～5min而补救。比如:角化细胞浆不红，就滴加10%磷钨酸。若角化前细胞浆也变红，就滴加饱和碳酸锂如此边复染边镜下观察，直至获得最佳染色效果为止。
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。 2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 4．碘液变透明，则不能使用。 5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。 革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。其配制方法如下： (1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。 (2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。 (3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。 (4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
巴氏染色技术要点
巴氏染色 巴氏（Papanicolaou）染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。其适用于上皮细胞及间皮组织的标本。是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法。该染色法不但具有显示细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。对如何染好巴氏染色，笔者有以下几点体会，报告如下。 1 EA 36染液pH值的测试 EA 36染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 36染液由伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等染料配成。伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等属于酸性染料。在溶媒中其发色团是负离子部分。发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色。但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电）。在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电）。所以必须把染液pH值调至5.2为宜［1］。EA 36染液pH的调节，可用石蕊试纸法，也可用酸度计测试。当然用酸度计法最为准确。但以上方法均比较麻烦，同时还要受到仪器设备的限制，不方便。本文采用一种简单方便的方法。即用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试。具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂。并充分混匀。直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。用此法测试染液pH同用石蕊试纸法测试一样，同样可获得满意的染色效果。磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂。可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱。保证染色达到理想效果。 2 分色 分色或酸化，对染色效果也很重要。分色目的是去掉胞浆中染上的多余的苏木素，使胞核着色显示特异性。因此，经分色后的胞浆在镜下观察应无色为佳。若胞浆中还残留有苏木素染料，会影响EA 36染液的着色。结果会出现该红的胞浆不红，该绿的胞浆不绿，或不红不绿的现象。看不到红蓝相间现象。因此，掌握好分色是关键。分色时间不能过短或过长。太短胞浆中苏木素除不尽，太长会把核上的苏木素也退掉。每次应在数秒内完成。盐酸浓度应偏低（0.5%为好）。这样便于掌握分色的时间。 3 蓝化或碱化 蓝化的目的是使胞核着色更具有特异性。经蓝化后的胞核紫中带蓝。这与红色的胞浆对比更鲜明。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱。因此，蓝化过程中碳酸锂还可中和分色时可能残留下的少量盐酸。为EA 36的着色创造良好条件。所以蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好［2］。
巴氏染色原理及操作步骤
巴氏染色原理及操作步骤 巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。 巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。
标准革兰氏染色液
标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
巴氏染色的操作方法及注意事项
巴氏染色的操作方法及注意事项 染色染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透明。主要达到以下要求：1、核的结构清晰；2、透明度高；3、分色恰当。 一、固定固定的目的细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步，否则会影响细胞学诊断的准确性。对于不同的标本需要不同的固定方法。最为常用的固定方法是95％酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶捋蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要的。如果酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的人为变化，并可导致假阳性或假阴性的诊断。1、固定方法湿固定法：作为用95％酒精固定液固定的细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95％酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄他处染色时，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，如果发生干燥后都会影响染色的效果。 2、固定注意事项固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是
使用过的固定液，必须过滤后才能再使用。使用过长的固定液，必须用酒精相对密度计测定，酒精浓度低于90％时应该及时更换新液。湿固定的重要性：标本再新鲜时及时固定时保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，均可因标本干燥后固定而大受影响。制片标本的邮寄：标本再固定15min后取出，立即加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。实验室在收到标本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再进行染色。 二、核染色1、苏木素液浸染时间一般在3-5min，但是必须随气温和燃料情况而酌情改变。夏季或放置较久的苏木素染液容易着色，时间要缩短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏木素染料去掉，使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多的标本。2）淡染法：在核染色过程中，严格掌握染色时间，使核染色适宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA 染色的质量。主要用于黏液少的标本，避免在酸化和自来水冲洗的过程中使细胞成片地脱落。在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤，否则苏木素结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以使用较长时间，所以每日增加少量新鲜
7细菌的革兰氏染色 (1)
微生物实验报告 细菌的革兰氏染色及形态观察 一、目的要求： 1、熟悉光学显微镜的使用方法。 2、掌握革兰氏染色法。 3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征 二、器材和器皿： 1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等 三、实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 四、实验步骤： 1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
增强革兰氏染色液
增强革兰氏染色液 简介： 在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Enhanced Gram ˊs stain 采用最经典的革兰染色配方进一步改进，使用复红复染液替代沙黄染色液，增强了染色效率，用于极难染色的细菌。临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 2、 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、 固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每 次1s ，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、 初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。 5、 媒染：滴加Gram 碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。 6、 脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液， 终止反应。 7、 复染：滴加复红复染液染色，水洗。 8、 干燥。镜检：置油镜观察。 编号 名称 DM0016 4×10ml DM0016 4×100ml DM0016 4×250ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml RT 试剂(D): 复红复染液 10ml 100ml 250ml RT 避光 使用说明书 1份
巴氏染色液(Papanicolaou EA50)使用说明
巴氏染色液(Papanicolaou EA50)使用说明 产品简介： 细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法。Papanicolaou Stain最初仅用检测于阴道上皮雌激素水平以及生殖道念珠菌、滴虫等病原体。橘黄G6与EA36或EA50联用，可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色。目前大多数实验室采用成品染液，所以每种染液应注意其改良后的最佳条件。最终胞浆染色应透明可见，核染色质应很容易辨别出来。目前改良的巴氏染色液含有多种离子，具有多色性染色效能。染色后胞质鲜艳、透明性好以及核膜、核仁、染色质结构清晰。细胞核染色液主要为Harris苏木素染液，细胞质染色液主要为EA36染液、EA50染液。巴氏染色液用于细胞脱落标本，细胞核呈蓝色或黑色，角化鳞状细胞胞浆呈粉红或橘红色。 巴氏染色液(Papanicolaou EA50)细胞质染色采用EA50染液，细胞核染色采用无毒改良型苏木素染色液，不仅适用于妇科细胞学涂片染色如筛查宫颈癌和癌前病变，也适用于胸水、腹水、痰液等非妇科细胞样本的染色。 产品组成： 规格名称 G1540 4×100ml G1540 4×500ml Storage 试剂(A):苏木素染色液100ml500ml RT避光试剂(B):蓝化液100ml500ml RT 试剂(C):橘黄G6染色液100ml500ml RT避光试剂(D):EA50染色液100ml500ml RT避光使用说明书1份
自备材料： 固定液如95%乙醇-冰乙酸固定液；系列乙醇；显微镜，盐酸乙醇分化液。操作步骤（仅供参考）： 1、细胞涂片用95%乙醇-冰乙酸固定液固定10～15min。 2、95%的乙醇浸泡1min。 3、80%的乙醇浸泡1min。 4、70%的乙醇浸泡1min。 5、蒸馏水或自来水浸泡或冲洗1min。 6、苏木素染液染色5～10min。 7、自来水冲洗2min。 8、1%的盐酸乙醇分化液分化约4～5s或0.5%盐酸水溶液分化10s。 9、自来水冲洗2min。 10、蓝化液中蓝化2min。 11、自来水冲洗2min。 12、70%的乙醇脱水2min。 13、80%的乙醇脱水2min。 14、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水2min。 15、橘黄G6染液染色2min。 16、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水2min。 17、EA50染液染色3～5min。 18、95%的乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水1min。 19、无水乙醇(Ⅰ)(Ⅱ)各脱水1min。
革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法 2.学习细菌制片方法 3.学习细菌染色原理和方法 4.巩固无菌操作技术 5.学习图像结果的规范表示 【实验原理】 1.显微镜的结构和各部分功能 现代普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透 镜系统来放大成像，故又 常被称为复式显微镜。它 们由机械装置和光学系 统两大部分组成。在显微 镜的光学系统中，物镜的 性能最为关键，它直接影 响着显微镜的分辨率。而 在普通光学显微镜常配 置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生
物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。 1.2增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离= λ2NA 式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为： NA=n*sin? 式中：?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距
巴氏染色
巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，质去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴
道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液配制 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。 （2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。 （4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项：