石蜡切片冰冻切片超薄切片
石蜡切片技术
虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。
病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。
硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。
第一节组织制片的概述
组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。
组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。
第二节制片的种类
一、组织切片法：
任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。
病理学研究中最常用的组织切片技术是常规石蜡切片和冷冻切片。其要点是将研究的组织进行切片，然后进行各种染色。冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片。
二、组织非切片法
不用切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。
第三节石蜡切片技术
石蜡切片法组织切片的主要程序：
一、取材
取材是根据实验目的及临床活检、尸解组织的病变程度而合理取得组织材料。为了制作优质的切片，取材时组织愈新鲜愈好，并应及时固定。
（一）病理标本的来源及分类：
病理标本的来源有临床活检、尸体解剖、实验动物、培养细胞。
主要病理标本大致可分类如下：
1、手术标本
2、内镜取材标本
3、穿刺取材标本
4、细胞学标本可分为：痰、尿、阴道分泌物、胸水腹水、穿刺细胞学标本、内镜刷取标本、其它等。
（二）取材的一般原则
1、认真观察，取准标本病变部位，切勿漏取。
2、要能全面反映出器官有无病变，显示病变全貌(最大面积)，包括肿瘤转移部位、切缘等。
3、根据临床或肉眼所见及病史提示对病变组织多取材，主要病变与相关组织多取材，特殊病变要尽量多取材。
4、若取材大小受限，应尽量取包含病变周边相对正常组织。
5、应避免选取凝血块、坏死组织及粘液成分。
6、要全面描述病变状况，由表及里，测重量、部位、体积等。
（三）取材方法
常见标本取材方法如下：
1、阑尾炎标本
2、肿瘤标本
3、胃标本
4、肠标本
5、肺、肾脏标本
6、乳腺癌根治标本
7、子宫标本
8、卵巢与输卵管囊肿标本
9、淋巴结标本
10、一般小标本
（四）取材注意事项
1、新鲜
2、配合
3、目的
4、部位
5、避免挤压
6、大小
7、数量
8、方向
9、标记
10、手术
11、小标本
12、交叉污染
（五）临床病理取材注意事项
姓名、样本、件数
二、组织固定
（一）固定的作用：
1、保持细胞与生活时的形态相似。
2、保持细胞内特殊的成分转变成不溶性物质。
3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，以便染色后易于区别和观察。
4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。
（二）原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质。
（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸
（四）固定时间: 一般固定液在24小时内不能穿透厚度大于2~3mm的实体组织或0.5cm的多孔疏松组织。
常规组织病理学：可长时间固定
细胞病理学：可长时间固定
细胞化学：不宜过长，约1小时为宜
（五）固定注意事项
1. 固定液有毒性，注意自身防护
2. 及时，尽可能新鲜。
3. 超微结构观察：低温固定
4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要
5. 固定液用量：足，必要时及时更换。一般应为组织块总体积的4~5倍，也可达15~20倍。
（六）常用的固定液：
1、单纯固定液：甲醛、乙醇、丙酮、戊二醛、醋酸、4%多聚甲醛
2、混合固定液：乙醇-甲醛液（AF液）、B5固定液（醋酸钠-升汞-甲醛）、Bouin氏液、Carnay氏液、Zenker固定液、氯化汞、苦味酸、重铬酸钾、AAF 液、甲醛-生理盐水等。
三、固定后处理：
（一）固定后处理的目的：及时洗去固定液，有利于脱水、切片和染色，并防止染色中甲醛色素的产生。
（二）固定后处理的注意事项：洗涤注意固定剂是否含乙醇或以水配制。
四、脱水：
（一）脱水的目的：利用脱水剂置换及驱除组织中的水分，以利于透明和浸蜡。
（二）脱水的步骤：
一般大小约为1.5cm×l.8cm×0.2cm的组织，其脱水步骤和时间如下：
70％乙醇1～2h
80％乙醇2～4h
90％乙醇2～4h
95％乙醇2～4h
无水乙醇2～4h
（三）脱水的注意事项：
1、浓度梯度
2、彻底干净
3、时间适度
4、有盖瓶子
5、达到无水
6、其它
五、透明
（一）透明的目的
组织块在浸蜡前，必须通过透明以便使石蜡浸入组织内，起充分支持硬化组织块的作用，以便完整切片。
通常根据透明时间与肉眼观察相结合判断透明程度。
（二）常用透明剂的种类和使用方法
最常用的是二甲苯，另外还有甲苯、苯、氯仿、香柏油、松节油、汽油等。
六、浸蜡
（一）浸蜡的目的
组织经过脱水、透明后要用石蜡、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部，使其变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察，这个过程称为“透入（浸蜡）”或“包埋”。
（二）浸蜡的方法
将组织经过透明以后立即投入到液体石蜡中去。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片质量。
（三）浸蜡剂的种类
1、石蜡石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56℃以上的石蜡。低熔点在54℃以下，用于酶的显示和保存抗原活性。
2、火棉胶目前使用火棉胶透入组织较少，用于染色前的覆盖液较多。
3、碳蜡
4、明胶
七、包埋
（一）包埋的目的：用石蜡将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织包绕成长方体块状以便于切片。
石蜡是动物植物、人体组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为56℃～58℃。将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织用石蜡埋入，待组织冷却、变硬，这样组织可以获得一定的硬度，以便切成薄片。
（二）石蜡包埋的注意点：
1、动作要迅速。
2、注意切面。
3、加温镊子。
4、组织不能重叠。
5、包埋用蜡一般为工业蜡。
八、切片
（一）切片前的准备工作
1、修块：石蜡切片前应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。
2、粘块
（二）切片操作
包括切片、展片和烤片。
1、切片：将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度(一般为4μm)的薄片称为切片。切片机多为轮转式切片机或平推式滑动切片机。
2、展片：将已切妥的切片在温水中铺展平整后，用载玻片捞起附贴其上称为展片。
3、烤片稍晾干后再用烤片机烤片，使其牢固附着，称为烤片。
冰冻切片技术
冰冻切片在组织学技术中应用范围较广，对病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大。
冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
一、冷冻切片的目的
1、在手术进行中的病理确定。
2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或转移的程度。
3、了解恶性肿瘤手术范围。
4、诊断剖腹探查时所发现的异样组织。
5、显示组织中的脂肪和脂类物质。如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
6、某些酶的显示。
7、神经病理学技术中的某些染色法。
8、免疫荧光的研究。
二、实验方法
1、准备：将仪器打开，样品台温度调至-40℃。
2、取材：组织必须新鲜，尽可能不经水洗。取材时应避免组织挤压，防止人为假象。样品大小5×5×3mm。
3、速冻：将样品放在样品台上，样品四周加水加固，冷冻5～10min。
4、切片：升高温度至- 15℃（视样品而定），约5min后开始切片，厚度6～15μm。
5、制片：将切片直接放在载玻片上。
6、固定液（丙酮）中固定1～2min。
7、染色观察
8、记录：将观察的结果记录实验报告上。
切片温度的设定原则：
1、柔软、含水较多的组织设定温度高。
2、致密、富含脂肪的设定温度低。
冰冻切片的特点：
优点：
1、简便。
2、快速。
3、组织变化不大。
4、能很好保存脂肪，类脂等成分。
5、较完好地保存各种抗原活性及酶类。
不足：
1．不容易做连续切片。
2．切取的组织不能过大。
3．不容易制作较薄的切片。
4．组织结构不如石蜡切片清晰。
超薄切片的制作技术简介
一、透射电镜样品制作操作流程
取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右)——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 oC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37oC 烘箱过夜；纯包埋液45oC烘箱2小时）——包埋聚合（45oC烘箱3小时，65oC 烘箱48小时）。
二、扫描电镜样品制备操作流程
取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——脱水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟，换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟）——干燥（零界点干燥或冷冻干燥）——镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
石蜡切片制作标准程序
动物病理组织学 石蜡切片制作标准操作程序（SOP） 一、\器材和试剂准备 （一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡； （6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用； 注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理 （1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。 或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。 （2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。 二、石蜡组织切片的制作 （一）取材 注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横
术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析
XX医院病理科2010～2012年术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析 肿瘤手术中冰冻切片快速病理诊断具有十分重要的意义，它不仅是鉴别良、恶性肿瘤准确快速的方法，也是指导临床医生决定手术切除范围及制定下一步治疗方案的关键手段。比较冰冻切片快速病理诊断与石蜡切片病理诊断的符合率，分析可能导致误诊的原因。现 对我科2010年１月～2012年5月间所有冰冻切片诊断工作进行回顾性分析。 一、材料与方法 为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产SHANDN ）上制作切片。切片厚4μm，经酒精固定，HE 染色，普通光镜（Olympus BX41）下观察。 二、结果
三、讨论 冰冻切片与石蜡切片诊断的符合率逐年有所提高，说明我科病理医生对冰冻切片诊断的知识面及经验都有所提高。误诊原因分析
1、科外因素： ⑴.术中标本送检时放入生理盐水或其它液体中，或用湿纱布包裹标本，或术者用水冲洗标本等，做冰冻切片时由于骤冷产生大量冰晶使组织呈空网状，使病理医师误认为是粘液或脂肪组织来源的肿瘤，被迫第二次取材。 ⑵.手术医师取材不当或取材错误，可造成冰冻切片诊断的准确率和预测值之间的差异，如滑膜肉瘤送检组织为纤维结缔组织；胰腺癌时切取正常胰腺组织送检；脑胶质瘤送检脓性坏死渗出物，从客观上导致假阴性。 ⑶.有些病变由于组织结构的特殊性，冰冻切片很难确诊，例如：①乳腺硬化性病变，包括某些类型的腺病（硬化性腺病）及放射状瘢痕。有人认为良性硬化性病变与硬癌的鉴别很困难，在冷冻切片中尤其如此。我们曾遇见过乳腺硬化性腺病的假浸润现象而诊断为乳腺癌的病例。②乳腺乳头状病变，包括导管内乳头状瘤与末梢导管的乳头状瘤病。③乳腺导管上皮增生性病变，包括不典型增生。本组有一例导管上皮增生呈“搭桥”样生长，并形成不规则的间隙，误诊为恶性。这些病变有时在石蜡切片中多处取材都可能难以确诊，不能苛求在一张切片短时间内作出确切诊断，必须等待石蜡切片最后确诊，特别是对年轻患者。 2、科内因素：
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
石蜡切片的制作
说明 石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。文档来自于网络搜索 取材 应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。文档来自于网络搜索 固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa 液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。文档来自于网络搜索 洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用
石蜡切片的基本操作流程
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太
石蜡切片步骤
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
石蜡切片与冰冻切片
石蜡切片与冰冻切片 一、组织和细胞标本类型： （一）组织标本类： 1、石蜡切片：组织形态保存好 2、冰冻切片：抗原性保存好 （二）细胞标本类： 1、组织印片 2、细胞培养片（细胞爬片） 3、细胞涂片 二、组织取材 1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。 2、组织取材注意事项： （1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。 （2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。 （3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。 三、活细胞标本的制备法 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。 四、石蜡切片的制备 1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。 2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。 五、冰冻切片的保存和使用 1、冰冻切片固定后-80℃保存备用 2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
石蜡切片的制作过程(精)
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
石蜡切片详细步骤
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要） 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要） 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗 17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵； 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行： 二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min） 2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min，甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。 9、自来水冲洗，封片，观察。 注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。 （4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。 注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。 （10）次日取出切片，室温下复温30min。 （11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 （13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。（15）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （16）中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 （1）必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 （2）抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。