鸡胚
鸡胚
鸡胚概述
鸡胚就是鸡的胚胎，是研究动物发育的重要模型，已被大量用于发育生物学的研究。对鸡胚的研究可以追溯到古希腊著名的博物学家亚里士多德，之后被很多生物学家予以深入的研究。现在对鸡胚发育的过程已有清楚的了解和认识。鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。
鸡胚装片
a．当孵化第一天，染色较深的一端为头部，染色较浅的一端为尾部。血岛、脊索原基、神经板。体节出现1—3对。
b．48小时鸡胚装片
颈曲、背曲，脑已分化为前、中、后脑三部分。体节已发展到16—23对。视、听囊出现，心脏开始搏动。胚盘血管已形成并与体内建立了联系。胚体长度达9—12毫米。
c．72小时鸡胚装片
脑已清楚地分为五个部分；体节数达33对左右。前、后肢芽出现，鳃弓具有5对。尿囊出现。
d．96小时鸡胚装片
头部显著增大，大脑半球明显。眼发育极快，眼内色素沉着，眼球明显。鳃弓和鳃囊开始模糊不清，全部体节约50对左右。心脏发育已近似成体心脏。胚体已极度弯曲，大脑半球与前肢芽几乎和尿接触。
鸡胚培养
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基本原理
途径
器材
操作步骤
附：鸡胚培养法
血凝试验
基本原理
途径
器材
操作步骤
附：鸡胚培养法
血凝试验
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基本原理
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
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途径
各种病毒接种鸡胚均有其最适宜的途径，故应注意选择.本实验用牛痘病毒（vac cinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
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器材
牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；
白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；
孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
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操作步骤
1．准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种
1)绒毛尿囊膜接种
(a)将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。(b)用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。
(c)用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。
(d)用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室
(e)用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0．05—0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。
(f)在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。
(2)尿囊腔接种
用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。
(a)将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。
(b)将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。
(c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒
毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。
(d)用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
(3)羊膜腔接种
(a)将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。
(b)用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。注意勿划破壳膜。
(c)用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。
(d)用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图Ⅻ-6）。
(e)左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液0．1ml。针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。
(f)用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时，保持蛋胚的钝端朝上。
3．收获
(1)绒毛尿囊膜
(a)用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。
(b)将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。然后或用于传代，或用50%甘油保存。
(2)尿囊腔接种法收获尿囊液
(a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。
(b)用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。
(c)将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。
(d)观察鸡胚，看有无典型的症状。
(3)羊膜腔接种法收获羊水
(a)按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。(b)先吸出尿囊液。
(c)再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。经无菌试验后，保存于低温中。
(d)观察鸡胚的症状。
写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后，鸡胚所出现的变化。
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附：鸡胚培养法
一、.实验材料
(一)7—11日龄鸡胚
(二)孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种病毒后的鸡胚。
(三)照明灯，打孔器和卵盘。
(四)其它：注射器，针头，消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)，镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。
二、接种技术
(一)活胚检查
鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
1．血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
2．胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
3．绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二)接种途径
尿囊腔接种
通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用先用2.5％碘酒消毒，再用75％酒精脱碘。用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。用注射器注入样品0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳
并取走，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌注射器通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶内4℃或低温保存待用。
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血凝试验
一．仪器设备
一次性注射器，微量血凝板（V型、96孔），微型振荡器，移液器
二．所需试剂
（1）稀释液10×PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2）
氯化钠8.5g，磷酸二氢钾0.68g，氢氧化钠0.15g，上述成分溶于100ml蒸馏水后高压灭菌，于4℃保存，使用时作10倍稀释。
（2）红细胞保存液（阿氏液）
葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克，溶于1000毫升蒸馏水中，调PH值6.8~7.2，分装，115℃15分钟灭菌，低温保存备用。
（3）1％红细胞悬液
用一次性注射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公鸡翅下静脉血液2ml，混匀，转移到离心管中，用1×PBS洗涤红细胞三次，头两次以1500rpm离心5min，最后一次以2000rpm离心10min。将1ml离心压积后红细胞加入到100mlPBS中或阿氏液中即配成。
三．操作方法
（1）于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×PBS 50μL，根据被检样品数量定所加排数。
（2）吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。最后一列不加样品作空白对照。
（3）于每孔中加入1%红细胞悬液25μL。
（4）置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
（5）放室温下(18～20℃)30min，观察结果。
一、检视标记鸡胚
（1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态
血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块
胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动
绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚
胎的另一面形成明显的界限
（2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限
（3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
二、接种样本
（1）将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。
（2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。
(3)用注射器吸800μl标本。
(4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内
层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射200μl标本。将针头退出至?寸，将另外200μl 标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2个鸡胚。
(5)将针头弃于合适的生物安全装置中
(6)用消毒过的医用胶布封口
(7)33～35o C 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传
代通常培养2天。
注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去
三、收获尿囊液和羊水
（1）鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时
（2）用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部
（3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。
（4）用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养 [实验材料] 9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。 [实验内容及操作程序] 1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。 2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。 5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。 6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)SOP
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作规程 一、目的：使鸡胚尿囊腔接种规范化。 二、使用范围：适用于鸡胚尿囊腔接种工序。 三、责任者：鸡胚尿囊腔接种操作员。 四、内容： 1 准备工作 1.1 人员着装：操作人员按要求穿工作服、戴帽子、戴口罩、戴手套。 1.2 确认物品：签字笔、记录表、10日龄鸡胚、医用胶带、封孔胶、75%酒精棉、无菌棉 花、4%碘酒、毛笔、打孔器、直镊、1mL一次性无菌注射器（带针）、接种液、含冰容器、打火机、酒精灯、止血钳、危废缸、垃圾桶。 1.3 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.4 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一 消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下；每15枚蛋胚更 换一个酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔， 注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中； 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸； 4.3 取1mL一次性注射器，确认外包装完好后，取出注射器，注意拧紧针头与针筒连接处， 将注射器针帽取下，将接种液瓶倾斜60°，将针头插入接种液瓶塞中央部位，确保接种瓶内液体完全没过针头，抽取病毒液1.2mL，注意缓慢抽取以减少气泡产生；将注射器针头朝上直立，用手指轻弹气泡部位，待气泡上移到注射器顶端时，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下， 注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。（此操作否定项：每溢出一枚扣5分，超过3枚则此项操作为零分） 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。
实训八 病毒的鸡胚接种技术
实训八病毒的鸡胚接种技术 目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。 仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。 方法与步骤（实验视频六） （一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。 发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。 （二）接种前的准备 病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。 照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。 （三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。 （四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。 绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。 注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。 思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？ 2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？ 1
鸡蛋孵化过程发育图片
鸡蛋孵化过程发育图片 未受精蛋种蛋中通常被称为“卵黄”的部分，实际上只是一个细胞，即雌性生殖细胞或卵子。卵黄绝大部分是营养物质，细胞核和大部分细胞质集中为一个不规则的小白点，浮于卵黄上面和卵黄膜的下面，如图中箭头所示。这种蛋虽经孵化但不能发育，称未受精蛋。 受精蛋鸡的卵子在输卵管的漏斗部与精子相遇而受精，受精卵在母体内滞留期间不断分裂，到种蛋产出体外时已分裂成一团细胞，此时为胚胎发育的囊胚期。从正面看囊胚像覆盖在卵黄表面的圆盘，中央为明区，边缘为暗区，通常称为胚盘。 无精蛋受精蛋 进入孵化，蛋的发育过程 第一天：状区经过24小时的孵育，胚盘 变大变厚，明区和暗区同时增大，在卵黄上 可见到椭圆形的盾称为胚盾，是未来的胚区。 第一胚龄照蛋第一胚龄解剖
第二天：胚盘已扩展一倍并被红色的血管 围成樱桃形或椭圆形，这些血管即胚胎的 卵黄囊循环的边缘血管----缘窦。胚盘中 心有一变曲的透明体----胚胎，透明体中 可见一搏动着的小红点，即原始心脏。 第二胚龄照蛋第二胚龄解剖 第三天：由孵化的第一天开始，蛋白 中的水分通过半透性卵黄膜向卵黄中 移动，使卵黄中水分含量大增，新进 来的水分并不与卵黄液全仙融合而主 要存在于胚区。胚胎与伸展的卵黄囊 血管形似蚊子，白壳种蛋通过照视可 见蚊状的血管区，俗称“蚊虫珠”。 第三胚龄照蛋第三胚龄解剖 第四天：卵黄体积继续增大，颜色变淡， 卵黄囊血管包围卵黄近1/3，由于卵黄 液化膨胀的压力，使卵黄囊血管紧贴于 内壳膜，可与外界进行气体交换。照蛋 时卵黄不易转动，胚与卵黄囊血管形似 蜘蛛，俗称“小蜘蛛”。尿囊是一个很 小的水泡，眼睛开始沉积黑色素。 第四胚龄照蛋第四胚龄解剖
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备 一、材料和试剂 1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚 2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等 二、操作步骤 1、操作前的准备： ○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 ○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 ○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 ○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 ○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 ○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 2、成纤维细胞制备： ①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。 ②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。 ③再用PH7.2的PBS冲洗两次。 ④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。 ⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。 ⑥期间配制细胞培养液： 培养基：MEM 双抗：2% 7.5% 碳酸氢钠：2% 牛血清：6% 3% 谷氨酰胺：1% ⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。 ⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。 ⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。 ⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。 11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。 ○ 12分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养。 ○
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞的制作及培养 鸡胚成纤维细胞培养 1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微 生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10,15分钟。一般约12
分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间 太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水 解乳蛋白Hank，s液少许。(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的 组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)， 加入适量含有血清的培养液。 10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄， 说明液体变酸，可用NaHCO调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。3 培养基为0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24,48小时可形成单
胚胎照蛋解剖图解修订稿
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未受精蛋种蛋中通常被称为“卵 黄”的部分，实际上只是一个细胞， 即雌性生殖细胞或卵子。卵黄绝大部 分是营养物质，细胞核和大部分细胞 质集中为一个不规则的小白点，浮于 卵黄上面和卵黄膜的下面，如图中箭 头所示。这种蛋虽经孵化但不能发 育，称未受精蛋。 受精蛋鸡的卵子在输卵管的漏斗部 与精子相遇而受精，受精卵在母体内 滞留期间不断分裂，到种蛋产出体外 时已分裂成一团细胞，此时为胚胎发 育的囊胚期。从正面看囊胚像覆盖在 卵黄表面的圆盘，中央为明区，边缘 为暗区，通常称为胚盘。 无受精蛋受精蛋 第一天：状区经过24小时的孵育， 胚盘变大变厚，明区和暗区同时增 大，在卵黄上可见到椭圆形的盾称为 胚盾，是未来的胚区。 第一胚龄照蛋第一胚龄解剖 第二天：胚盘已扩展一倍并被红色的 血管围成樱桃形或椭圆形，这些血管 即胚胎的卵黄囊循环的边缘血管---- 缘窦。胚盘中心有一变曲的透明体-- --胚胎，透明体中可见一搏动着的小 红点，即原始心脏。 第二胚龄照蛋第二胚龄解剖
第三天：由孵化的第一天开始，蛋 白中的水分通过半透性卵黄膜向卵 黄中移动，使卵黄中水分含量大 增，新进来的水分并不与卵黄液全 仙融合而主要存在于胚区。胚胎与 伸展的卵黄囊血管形似蚊子，白壳 种蛋通过照视可见蚊状的血管区， 俗称“蚊虫珠”。 第三胚龄照蛋第三胚龄解剖 第四天：卵黄体积继续增大，颜 色变淡，卵黄囊血管包围卵黄近 1/3，由于卵黄液化膨胀的压 力，使卵黄囊血管紧贴于内壳 膜，可与外界进行气体交换。照 蛋时卵黄不易转动，胚与卵黄囊 血管形似蜘蛛，俗称“小蜘 蛛”。尿囊是一个很小的水泡， 眼睛开始沉积黑色素。 第四胚龄照蛋第四胚龄解剖 第五天：胚胎被包围在一个透明的 水泡（羊膜）中，羊膜内充满羊 水，胚体弯曲，眼睛黑色素大量沉 积。卵黄囊已包围1/2的卵黄，照 蛋时可见到眼睛的影子，俗称“单 珠”或“黑眼”。肉眼已可见到尿 囊，直径6毫米左右。 第五胚龄照蛋第五胚龄解剖
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养 ［实验材料］ 9~１0日龄鸡胚,Hanｋ”s液5０mL,０.5％水解乳蛋白液或MEＭ培养液20ｍL(内含犊牛血清１mL,双抗0。2ｍL,ｐH7、2),O。25％胰蛋白酶5mL、7％Ｎa ＨC031mＬ,手术剪,镊子,灭菌得培养皿,５0ｍL三角瓶,滴管若干,链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用),高压灭菌塞子若干,培养盘,蛋座,95%酒精,水浴锅。［实验内容及操作程序] １。配液制备细胞前先在Hｎａk＂s液中加青、链霉素,使其含量为青霉素1０0ＩU／mL,链霉素10０μｇ/mＬ,用7％NａＨC０3调整pH至7.２～7.４,将胰蛋白酶调整ｐＨ7.6(玫瑰红色)、置3７℃水浴锅中预热备用、 2。取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中、剪去头部、翅爪及内脏,用Hａnｋ"s液(简称Ｈ液)洗去体表血液,移人灭菌三角瓶中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小得碎块,加5mＬH液轻摇,静止1～２min,使其组织块下沉。吸去上层悬液,依同法再洗2次,至上悬液不混浊为止,吸干H液留组织。 3.消化自水浴锅内取出预热得胰酶,按组织块量约３～5倍加入三角瓶中,１个鸡胚约需5mL胰酶,三角瓶上加塞,以免CＯ２挥发及污染、37℃水浴约２0mｉn 左右,每隔５ｍiｎ轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间得氨基与羧基游离,待液体变混而稍稠,此就是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时, 则需中止消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够, 则细胞不易分散。
胚胎照蛋解剖图解
胚胎照蛋解剖图解
未受精蛋种蛋中通常被称为“卵黄” 的部分，实际上只是一个细胞，即雌性 生殖细胞或卵子。卵黄绝大部分是营养 物质，细胞核和大部分细胞质集中为一 个不规则的小白点，浮于卵黄上面和卵 黄膜的下面，如图中箭头所示。这种蛋 虽经孵化但不能发育，称未受精蛋。 受精蛋鸡的卵子在输卵管的漏斗部 与精子相遇而受精，受精卵在母体内滞 留期间不断分裂，到种蛋产出体外时已 分裂成一团细胞，此时为胚胎发育的囊 胚期。从正面看囊胚像覆盖在卵黄表面 的圆盘，中央为明区，边缘为暗区，通 常称为胚盘。 无受精蛋受精蛋 第一天：状区经过24小时的孵育，胚 盘变大变厚，明区和暗区同时增大，在 卵黄上可见到椭圆形的盾称为胚盾，是 未来的胚区。 第一胚龄照蛋第一胚龄解剖
第二天：胚盘已扩展一倍并被红色的血 管围成樱桃形或椭圆形，这些血管即胚 胎的卵黄囊循环的边缘血管----缘窦。 胚盘中心有一变曲的透明体----胚胎， 透明体中可见一搏动着的小红点，即原 始心脏。 第二胚龄照蛋第二胚龄解剖
第六天：尿囊增长迅速，一天之内增 长了约4倍，尿囊血管系统迅速发 育，已经覆盖羊膜与部分卵黄，但较 卵黄囊血管细；卵黄囊血管分布在卵 黄面积达2/3以上。胚体已初具翼和 腿的外型，已眼睛黑色素更多，照蛋 可见头部与躯干部两个小圆团，俗称 “双珠”。 第六胚龄照蛋第六胚龄解剖 第七天：卵黄体积达到最大程度， 以后将逐渐缩小，卵黄囊虽然也增 大，仍有1/4卵黄未被覆盖；尿囊比 第6天增长约两倍；胎儿的外形已 具备禽类的特点，头和眼所占的比 例相当大，前后肢分化明显，胎儿 的透明度开始降低，胚胎半沉半浮 横卧于羊水中。 第七胚龄照蛋第七胚龄解剖 第八天：尿囊较第7天扩大了一 倍，几乎包围了卵黄囊。从第4 天到第8天是尿囊发育的第一阶 段，胚胎由卵黄囊呼吸转化为尿 囊呼吸。胎儿外形发育趋于完 善，上喙白色，破壳齿明显可见， 胸腹腔尚未封闭，心、肝、胃都 暴露于体腔外。羊水与尿囊液迅 速增多。
鸡胚培养和细胞培养
第一节 鸡胚接种 一、鸡胚的结构 鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。 一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。 孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”） 是卵白，是胚胎发育晚期的养料
鸡胚发育观察实验报告
鸡胚发育观察实验报告 一、实验目的： 1.熟悉模式生物——鸡胚的正常发育过程，从而了解相关生物物种的发育过程； 2.养成勤观察，多记录，多对照，多分析的良好实验习惯； 二、实验材料和器材： 1.种蛋品种：海兰灰 2.孵化箱，照蛋器 3.酒精棉球，大培养皿等 三、实验准备： 1.孵化器的预运行：将孵化器清理干净，温度调至37.8℃，保证湿度53-57%和正常通 气，设置翻蛋（每2小时翻蛋一次，一昼夜12次，孵化满18天移盘后停止翻蛋） 2.种蛋的订购 ①品种：海兰灰 ②选择条件：品质新鲜，形状和大小合适，蛋壳结构正常，壳面清洁。 四、实验方法和步骤： 1.鸡胚孵化： ①每组挑选8个种蛋，戴手套后用酒精棉球擦拭消毒，用铅笔做好标记（4个用 于鸡胚孵化，4个用于打蛋观察）； ②在照蛋器照射下，用铅笔在钝端沿气室边缘画一个圆环； ③入箱孵化 2.鸡胚孵化观察内容： ①记录孵化温度，蛋壳形态，气孔，气室，重量等变化； ②每日照蛋、打蛋（分组轮流进行），拍照； ③照蛋记录： 第一次：第5、6天 抽检：第10、11天 第二次：第18、19天 ④打蛋观察、拍照后，将鸡胚材料交给助教老师，不要擅自丢弃； ⑤鸡的孵化期为21天，出壳。 3.照蛋观察方法： ①第一次：第5、6天
受精蛋：可以看到眼点，血管分布占整个蛋面的五分之四，色泽鲜红。 弱精蛋：看不到眼点，血管分布占不到整个蛋面的五分之四。 死精蛋：蛋内浑浊、有血圈、血块儿。 ②第二次：第18、19天 受精蛋：照蛋器对着蛋的小头，已经看不到发亮的部分，看见大头紧贴气室有一条1厘米宽左右的红带。 死精蛋：上述带不是红色的。 ③抽检：第10、11天 受精蛋：血管在蛋的小头部分聚拢。 弱精蛋：血管在蛋的小头部分没有聚拢。 死胎蛋：若气室比较模糊，胚胎呈现黑团状。 五、实验结果： 表1 孵化记录表 表2 蛋的观察结果（4月3日第一批种蛋） 表3 蛋的观察结果（4月11日第二批种蛋）
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 （一）鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。 3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： （1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 （2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 （3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 （4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 （二）各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 （1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL 新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。收获前将鸡胚置于0～4 ℃冰箱中冷藏4 h 或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.5～2.0 cm 的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得5～6 mL ，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 （3）消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min ，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min 。 2.卵黄囊接种法 （1）接种方法 选用6～8日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm ，向卵黄囊内注入0.1～0.5 mL 病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化3～7 d （实图6-22）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 ℃冰箱冷冻保存。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养 171850044 生拔钱诗晨 一、背景知识 1.1原代培养与传代培养 1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。 1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养 注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数 1.2细胞体外培养要求的条件 ?无菌 ?适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右 ?生理渗透压 ?适宜酸碱度：7.2-7.4 ?气体：95%空气+5%二氧化碳 ?培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型 悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。而呈现悬浮生长的细胞。 贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。又称黏附依赖型细胞（分如下四类） ?成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射 状。 ?上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。 ?游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。 ?多形型：是一些形态上不规则的细胞。细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多 边形，胞突呈细长丝状。如神经元和神经胶质细胞 1.4原代细胞培养的一般办法 1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法 1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法 注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 二、实验目的 ●了解体外培养的原理及原代细胞培养的基本方法 ●掌握无菌操作的一般技术
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)记录
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作记录 考生姓名：准考证号： 鸡胚接种物品准备 物品名称数量是否齐全物品名称数量是否齐全 签字笔1支含冰容器1个 记录表1张打孔器1把 10日龄鸡胚15枚1mL一次性注射器3个 标签纸1卷止血钳1把 封孔胶1瓶75%酒精棉1瓶 4%碘酒1瓶危废缸1个 毛笔1支不锈钢托盘1个 接种液1瓶利器桶1个 操作步骤及记录 1 准备工作 1.1 确认物品。 1.2 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.3 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一消毒，消毒 面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，注意打孔力 度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 是否完成□ 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中。 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸。 4.3 取1mL一次性注射器，抽取病毒液1.2mL，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保 持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，注意注毒 时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。 是否完成□ 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。 是否完成□ 6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。 是否完成□ 7 记录：按操作顺序填写记录。是否完成□ 8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。 是否完成□操作人签名：日期：年月日 备注： 1、物品准备齐全在□内画“√”，不齐全的在□内画“×”。 2、步骤完成的在□内画“√”，未完成的在□内画“×”。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养 细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。 组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。 很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。 组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。 本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。 （一）实验目的 了解单层细胞培养方法 （二）实验材料 1、10日龄鸡胚。 2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。 3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。 （三）实验方法 1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。 2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。 ３、用镊子将组织块放入无菌三角烧瓶内，加入１０～１５ml0.25液，37?水溶浴20分钟，中
鸡胚培养法
鸡胚培养法（病毒分离培养） 鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。 鸡胚的接种方法、孵育及收获 一、仪器和器材 SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。 二、鸡胚的孵育 应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。 如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。 三、鸡胚接种（尿囊腔） （一）尿囊腔接种：一般应用于流感病毒、新城鸡瘟病毒和腮腺炎病毒的适应、传代和病毒量的扩增。病毒在尿囊的内胚层细胞中繁殖，并释放到尿液中，因此，在尿囊液中含有大量病毒，可用血凝实验来测定病毒的存在。1.接种方法及步骤：选择发育良好的9—11日龄鸡胚，用于尿囊腔接种，在检卵器上画出鸡胚的气室边界及胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1mm处避开血管做一标记。此即为注射点，用酒精消毒，用开卵钻在注射点部位开一个约2mm的小孔，勿损伤壳膜，用注射器注入： 0.1---0.2ml接种物，用医用胶布将小孔封好，气室朝上置于卵架，放入330C---350C 孵卵箱进行培养，孵育24小时后检视，弃去死胎，2收获：收获时间依据不同病毒而异，一般培养36—48小时可进行收获。收获前，将鸡胚置于40C冰箱6小时或过夜，如实验急需进行，可置-200C冰箱半小时至1小时左右，目的是避免收获时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发生凝集造成病毒滴度下降。经冰冻的鸡胚即可用酒精消毒气室部位卵壳，用镊子除去气室卵壳及壳膜，注意勿使卵壳碎片落在未损伤的壳膜上，撕破绒毛尿囊膜，用巴氏吸管轻插于尿囊腔中，缓慢吸取尿囊液于无菌试管内并作无菌实验，此步操作应特别注意避开血管，不要刺破卵黄囊，一个鸡胚可收获6ml左右清量微黄的尿囊液，最多可达10ml，
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养 一、目的要求 掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。 二、器材 1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。 2.接种材料新城疫I系疫苗 3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。 三、内容和方法 （一）接种前的准备 1.鸡胚的准备 本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。 2.病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1
小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。 （二）接种 绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。（三）收获 新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种 一、鸡胚的结构 鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。 一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。 孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在 11-13 日龄时最高，平均达 6 毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15 日龄时最高，平均约为 1 毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料。