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质粒构建流程

一、引物设计

1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI

2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，

4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取

1. RNA提取

试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）

准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套

操作步骤：

1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。

3）4℃，12000rpm离心10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）

5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀

6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s

7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s

8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s

9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s

10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min

11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min

12）4℃，12000rpm离心60s

13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存

2.RNA反转录

试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）

准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管

操作步骤：

1）基因组DNA去除（10μl体系）

② 5×gDNA eraser buffer 2μl

① gDNA eraser 1μl

Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)

⑥ RNase free water 3μl

PCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃

注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入

2）反转录反应（20μl体系）

④ 5×primerScript buffer 2 4μl

③ primerScript RT enzyme mix I 1μl

⑤ RT primer mix 1μl

⑥ RNase free water 4μl

1）反应液10μl

PCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃

注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中

3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存

3. PCR扩增

高保真酶primerstar扩增，50μl

5×PS buffer 10μl

dNTP 4μl

dH2O 32.5μl

Primerstar 0.5μl

cDNA 1μl(可变)

R-primer 1μl

F-primer 1μl

点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min

4.PCR产物纯化

1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）

试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01

①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。

②转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。

③弃废液，加700μl DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。

④弃废液，重复③

⑤弃废液，空管离心13000g，1min

⑥柱子放入新EP管，加10-20μl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min

⑦电泳检测

2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）

①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。

②加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min

③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次

④弃废液，加300μl binding buffer（XP2），离心10000g，1min

⑤弃废液，加700μl SPW washing buffer，离心10000g，1min

⑥重复⑤

⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管

⑧加入30-50μl elution buffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min

⑨ 电泳检测

三、双酶切

30μl 反应体系如下：

PCR 纯化产物 15μl

10×M/L/K buffer 3μl

3dH2O 10μl

酶A 1μl

酶B 1μl

反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65℃金属浴10min 终止反应

注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表

四、连接

1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl

2）酶切产物液相纯化

3）20μl 连接体系（皆可）

PCR 产物 5μl

pcDNA3.1 2μl

10×T4buffer 2μl

T4 ligase 1μl

3dH2O 10μl

PCR 仪中进行：22℃，30min →4℃冰箱过夜

注：连接产物-20℃可长期保存

五、转化

准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃

1）将感受态细胞置于冰上，待其融化

2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞

3）轻混匀，冰浴30min

4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min

5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h

6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）

7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h

六、菌落PCR

1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR

3dH2O 35.7μl 10×buffer 5μl MgCl2 3μl dNTP 4μl rTaq 0.3μl R-primer 1μl

F-primer 1μl

2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16h。

3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。

七、测序

1.摇菌

1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌

2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基

3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中

4）37℃。250rpm摇菌12-16h

2.送样

每瓶取1ml箘液，送华大基因测序

3.比对

将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。

（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）

八、菌种保存

菌种比对成功，则可保存菌种备用。

1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl 80%灭菌甘油。

2）再加入800μl 箘液，轻混匀。

3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）

九、质粒提取

菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。

试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep

操作步骤：

1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min

2）弃上清，加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀

3）加250μl solution II，倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5min）

4）加入250μl solution III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。

5）室温离心13000g，10min

6）上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min

7）弃废液，加500μl buffer HB，室温离心10000g，1min

8）选择性步骤：重复第7步

9）弃废液，空管室温离心13000g，2min

10）柱子转入新EP管，加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min

11）室温离心13000g，1min

12）提取的质粒-20℃保存备用

附：

感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：

1. 菌种活化

1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h

2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h

3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h

4）检测箘液OD600≤ 0.5（0.3-0.4）

2.感受态制备

准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。步骤：

1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min

2）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管

3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min

4）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀

5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀

6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl ，液氮冻存。

试剂配制：

1.琼脂糖凝胶（1.2%）

琼脂糖粉0.6g

1×TAE 50ml

微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料，混匀，倒板

2.电泳缓冲液TAE（50×）

2mol/L tris-碱242g

1mol/L 冰醋酸57.1ml

EDTA(pH8.0) 18.622g

二蒸水至1L

用NaOH调节pH至8.6，常温储存。用时稀释成1×溶液使用。

3.LB培养基

Yeast extract（酵母提取物）1g

Tryptone 2g

NaCl 2g

Agar powder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）

二蒸水200ml

灭菌20min，冷却后加入抗生素。

4.CaCl2（0.1M）

CaCl2 1.47g

H2O 100ml