2016分子生物学复习重点

分子生物学

1.Poly （A）尾巴：

①大多数真核mRNA的3’端有多聚腺苷酸序列；②poly(A)序列不是DNA编码，是转录后被poly(A)聚合酶加上去的；③mRNA初进入细胞质时，其poly(A)尾长度大致与核中长度相同，随后逐渐缩短；④单poly(A) 尾长短并不影响其功能，poly(A)尾常结合了一约78,000道尔顿的蛋白质分子。⑤组蛋白mRNA不含poly(A) 结构。

（2）功能①保护mRNA，增强mRNA的稳定性②增强mRNA的翻译能力

2.帽子结构：

①mRNA转录完成后，前提mRNA进行加帽，帽子为7-甲基鸟苷，与5’第一个核苷酸以5’-5’三磷酸键相连②合成：A、RNA焦磷酸酶将前提mRNA末端的磷酸基团去除B、鸟苷转移酶在此末端加上GMP

C、两个甲基转移酶分别将鸟苷的第七位的N和倒数第二个核苷2’-羟基甲基化

功能：1）增加mRNA稳定性；2）增强mRNA的翻译能力3）增强mRNA从细胞核到细胞质的转运4）提高mRNA剪接效率

3.回文序列

回文序列是双链DNA中含有的结构相同、方向相反的序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构,这两个反向重复序列不一定是连续的。这种结构中脱氧核苷酸的排列在DNA两条链中顺读与倒读其意义是一样的，脱氧核苷酸的排列对于一个假象的轴成180°旋转对称，这种结构称为回文结构。

4. 反向重复序列

在同一多核苷酸链内下游存在着与上游某一段序列的互补序列反向的序列，如GTGCTAA和TTAGCAC构成反向重复序列。在双链DNA中反向重复可能引起十字形结构的形成。

5.不依赖于p因子的终止子结构特点：

1.终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。

2.在终止位点前面有一端由4—8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。

6.依赖于p因子的终止子的结构特点：

1.转录的RNA也具有发夹结构，但发夹结构后无poly(U)。

2.形成的发夹结构较疏松，茎环上不富含GC。

3.终止需要ρ因子的参与。

4.与不依赖于ρ因子的终止一样，终止信号存在于新生的RNA链上而非DNA链上过程。

7. 原核、真核生物释放因子的作用

（1）原核：RF1识别终止密码子UAA、UAG；RF2识别UAA、UGA；RF3是GTP结合蛋白，能促进RF1和RF2与核糖体的结合。

（2）真核：eRF1识别三个终止密码子；eRF3是一种核糖体依赖性GTP酶，帮助eRF1释放翻译成熟的肽链。

8. 细菌转录机制的转换模式

细菌RNA聚合酶全酶由核心酶和σ因子组成，核心酶是基本的转录装置，σ因子指导核心酶转录特异的基因。

转录起始：RNA聚合酶结合在DNA上形成闭合启动子复合体，σ因子促使聚合酶由闭合启动子复合体转变为开放启动子复合体。

转录延伸：聚合酶合成一段初生RNA产物后，聚合酶的启动子清除，核心酶转换为延伸特异构象，σ因子与聚合酶核心酶解离，由核心酶单独执行延伸功能，σ因子可被不同的核心酶再利用。是核心酶决定了RNA 聚合酶全酶对利福平的抗性或敏感性。)

噬菌体感染细菌后,其基因转录以时序模式进行:早期基因先转录,然后是中期基因,最后是晚期基因.这种转换由噬菌体编码的一系列σ因子来调控。这些σ因子与宿主核心聚合酶结合，从而改变对早、中、晚期

基因启动子识别的特异性。

早期转录：特异性因子为宿主σ因子，指导早期基因的转录，产生早期蛋白gp28

中期转录：特异性因子为gp28，指导中期基因的转录，产生中期蛋白gp33和gp34

晚期转录：特异性因子为gp33和gp34，，指导晚期基因的转录，产生晚期蛋白。

9. λ噬菌体对大肠杆菌的感染

（一）裂解繁殖

在裂解模式下，λ噬菌体利用大肠杆菌的RNA聚合酶进行转录，几乎所有的噬菌体基因都转录并且翻译，同时噬菌体DNA复制形成子代噬菌体，然后裂解宿主细胞。噬菌体处于颗粒状态时，DNA为线性，感染宿主菌后，由于线性基因两端有cos位点，会形成环形DNA。转录分为三个时期：

1.极早期：极早期基因为Cro和N，Cro位于右向启动子PR的下游，N位于左向启动子PL的下游。在极早期，没有阻遏物与这些启动子的操纵基因（OR‘与OL‘）结合，转录过程不受阻遏。

Cro基因产物是阻遏物，结合CⅠ基因，阻止λ阻遏物蛋白的产生。

N基因产物是N蛋白，是抗终止子，可使RNA聚合酶忽略早期基因末端的终止子而继续转录后续的晚早期基因。N蛋白不能代替Q蛋白，对Cro和N基因后的抗终止作用是特异性的。

2.晚早期：O基因和P基因产物为噬菌体DNA复制所必需的蛋白质，而复制是裂解周期的关键。

Q基因产物Q蛋白是另一个抗终止子，可使晚期基因转录。

3.晚期：右顺时针转录，晚期启动子PR’位于Q的下游，Q蛋白可使晚期基因转录，S基因和R基因产物是裂解宿主细胞的蛋白，其他基因产物是噬菌体头部和尾部蛋白。

（二）溶源模式

（1）某些晚早期基因的产物是噬菌体DNA整合到宿主基因组形成溶源态所必须的

（2）CⅡ和CⅢ基因产物使CⅠ基因转录产生λ阻遏物，λ阻遏物结合到操纵基因PR和PL上，阻止极早期基因的转录，从而进入溶源态，噬菌体DNA会整合到宿主基因组中。CⅡ直接刺激聚合酶结合到PRE和PI 上，CⅢ缓解CⅡ的降解。

（3）CⅠ基因有两个启动子，PRM和PRE，PRM为阻遏物保持启动子，位于OL’下游，PRE为阻遏物建立启动子，位于cro和PR右侧，是溶源态的建立启动子，向左转录CⅠ基因。

10.复制体中的几种蛋白因子及其功能：

1)、DNA拓扑异构酶：释放因解旋酶的活性而造成的扭曲链，恢复复制后松弛的DNA双链成负超螺旋；2）、DNA聚合酶：前导链的合成，后随链的合成以及修复

3）、DNA连接酶：连接修复后的后随链片段

4）、单链结合蛋白（SSB）：稳定复制叉的单链区域

5）、DNA解旋酶：使复制叉前的双链解开

6）、RNA引发酶：合成RNA引物

7）、RNaseH：切除RNA

11.原核DNA聚合酶：

1、DNA聚合酶：以DNA为模板合成DNA新链时需要的酶，DNA聚合酶从5‘到3’把核苷酸连续加在延伸DNA的游离3‘羟基上。

2、DNA聚合酶的特性：1）底物必须是dNTP；2）以DNA为模板，链延伸功能，不能从头开始合成；3）合成方向只能是5‘→3’。

3、DNA聚合酶的种类

polⅠ：3’-5’外切酶活性，主要是起修复的作用（比如光修复）,5’-3’外切酶活性，把RNA引物切除后的空隙填补起来,在温和蛋白酶水解下，大结构( Klenow片段)与和小结构与分离，任具有完整聚合酶的三种活性。

PolⅡ：是参与原核生物SOS修复的酶,

polⅢ：是原核生物在DNA延长中起主要作用的酶，是真正的复制酶。PolⅢ核心由α、ε、θ亚基组成，α亚基由DNA聚合酶活性，ε具有执行校正功能的3’-5’外切酶活性。β亚基二聚体形成环形结构，环绕DNA模板，并与α亚基相互作用，将模板与聚合酶结合在一起，起持续性作用。

pol Ⅲ全酶为双头酶，两个核心聚合酶通过两个τ二聚体和一个γ复合体连接在一起。一个核心酶合成前导链。一个核心酶合成后随链。γ复合体作为钳装载器将β钳装载到待转录的DNA模板上，装载完成后，β钳与γ复合体失去亲和力，转而与核心酶作用，帮助核心聚合酶持续性合成冈崎片段，合成完成后，β钳与核心酶失去亲和力，再与γ复合体结合，γ复合体作为钳卸载器将其从DNA模板释放下来，再循环到下一个引物。

12、真核生物DNA聚合酶

α在DNA合成期水平升高，主要负责复制引发和后随链部分序列的合成；

δ是DNA双链合成的主要聚合酶，在合成起始后存在聚合酶α/δ的转换；

DNA聚合酶α没有3’-5’核酸外切酶活性；而δ和ε有校正阅读活性，保证复制忠实性。

γ存在于线粒体内，复制线粒体DNA

ε存在于细胞核内，修复后随链

13. 端粒酶

真核生物染色体末端具有端粒结构,端粒的一条链由许多串联重复且富含G的短序列组成,该重复序列具有种属特异性。富含G的端粒链由端粒酶合成，端粒酶的短RNA分子是端粒合成的模板。富含C的端粒链通过常规的RNA引发DNA复制的方式进行合成，类似常规后随链的合成。该机制能保护染色体末端被重建，避免因每轮复制而导致的末端短缩。

14. cDNA克隆

（1）cDNA克隆：利用mRNA反转录酶，逆转录合成互补cDNA，然后重组入载体，经过复制，筛选得到单一种cDNA分子的技术。

（2）cDNA克隆法操作流程

①cDNA第一链的合成：以mRNA为模板，利用反转录酶，从mRNA3’端poly（A）尾巴开始，以oligo(dT)引物，合成其次是合成cDNA第二链。单链cDNA3’端的发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥5’→3’聚合酶活性，合成cDNA第一链。②cDNA的第二链：用RNaseH将mRNA部分降解，残留的mRNA片段作为引物，以cDNA第一链为模板，利用DNA聚合酶，合成cDNA的第二链。（此过程中用DNA聚合酶Ⅰ进行切口平移）

③将双链cDNA克隆到质粒和噬菌体载体上：用末端转移酶和某种脱氧核苷酸在cDNA和载体上创建粘性末端，cDNA末端与载体末端退火后，连接成重组DNA，然后进行扩增。④进行测序，研究转录本的信息以及功能。

（3）cDNA克隆法的应用

真核生物DNA的结构中有内含子和外显子。内含子并不表达蛋白质，如果直接剪接真核生物的DNA的话，内含子肯定是很难去除，这样连接到表达载体（一般都是原核生物）后表达出来的蛋白质就不再是目的蛋白质。所以用真核生物细胞中的mRNA为模板，再经反转录为cDNA后，也就除去了原本应该有的内含子。再经PCR扩增，就能得到大量的目的基因了。

15.cDNA文库

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA 文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。因为真核生物基因的选择性表达，由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

基本步骤：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA 第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。

16.离子交换层析

利用树脂分离携带不同电荷的物质。DEAE- Sephadex 带正电荷的树脂用于阴离子交换，醋酸纤维素等带负电的树脂用于阳离子交换。（1）制备DEAE-Sephadex悬浮液并装柱（2）树脂沉积后，加入待分离的物质（3）逐渐升高洗脱液的盐离子强度，将结合在树脂上的物质洗脱下来或者除去。设置盐浓度梯度的作用是用盐溶液中的阴离子（阳离子）与样品竞争树脂上的离子结合位点。

17.寡聚组氨酸表达载体

寡聚组氨酸对镍等二价金属有很高的亲和性，多克隆位点前有一段肠激酶所识别的氨基酸编码区。在起始密码子ATG之后，有编码连续六个组氨酸的一段序列（His）6，之后是肠激酶（EK）识别位点的编码区，最后是载体的多克隆位点(MCS）。通常载体有三种形式，三种不同的可读框内都有MCS，选择载体时，使插入基因相对于寡聚组氨酸是正确的可读框。（1）将目的基因插入与寡聚组氨酸编码区一致的可读框，用重组载体转化细菌细胞。细胞产生融合蛋白及其他蛋白。（2）裂解细胞释放蛋白混合液（3）将蛋白质混合液加到只结合融合蛋白的镍层析柱上（4）用组氨酸或其他同系物咪唑从柱上洗脱融合蛋白（4）用肠激酶切割融合蛋白，切成寡聚组氨酸标签与目的蛋白（5）将切过的蛋白质再过一遍镍柱，使目的蛋白与寡聚组氨酸分离。

18.在杆状病毒内表达外源基因

杆状病毒转移载体含有多角体蛋白启动子（polh）（多角体蛋白的编码区已被删除，但不影响病毒复制，因为病毒在培养细胞间的传递不需要多角体蛋白）。启动子下游存在唯一的BamHⅠ位点，转移载体含有病毒复制所必须的基因以及围绕多角体蛋白的基因。将野生型病毒DNA删除复制基因和多角体蛋白基因，形成仅含有多角体蛋白启动子的线性病毒DNA。（1）带有BamHⅠ粘性末端的外源基因片段插入转移载体中。（2）共转染：重组转移载体与已切掉重要基因的线性病毒DNA混合并转染昆虫细胞。在细胞内，两个DNA 通过双交换重组使目的基因和重要基因一起插入病毒DNA，结果形成多角体蛋白启动子调控下的目的基因的重组病毒DNA，（3）用重组病毒感染细胞并收集蛋白产物。（原初的病毒DNA是线性的且缺失重要基因，不能感染细胞，利用这种感染性的缺失可以自动删选重组病毒）

转染方法有两种（1）在磷酸缓冲液中将细胞与DNA混合，添加钙盐溶液形成磷酸钙沉淀，细胞可吸收含有磷酸钙的结晶（2）将DNA与脂质混合，形成脂质体，脂质体与细胞膜融合，DNA进入细胞。（3）植物细胞转染用轰击法。