无精症及严重少精症患者染色体核型和Y染色体微缺失分析

焦坠匡堂！！！兰生！！旦笙望鲞箜！！塑坐！堕！型塑！尘堕竺！望！！！竺！竺！！！！！ｙ！！垫：塑！！！：文章编号：１６７３－８６４０（２０１４）１２．１２１２＿０３中图分类号：Ｒ４４６．１１文献标志码：ＡＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－８６４０．２０１４．１２．００３

无精症及严重少精症患者染色体核型和Ｙ染色体微缺失分析

滕贤麟，施金俏，郭辉，周燕霞

（浙江省金华市人民医院检验科，浙江金华３２１０００）

摘要：目的分析男性不育中无精症及严重少精症患者染色体核型和Ｙ染色体微缺失情况及分布特点，为

卵细胞浆内单精子注射术（ＩＣＳＩ）辅助助孕前提供遗传学筛选依据。方法对１５０例无精症及严重少精症患者外周血液采用外周血淋巴细胞培养Ｇ显带方法进行染色体核型分析，采用多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合琼脂糖凝胶电泳检测Ｙ染色体微缺失。结果１５０例无精症及严重少精症患者，染色体核型异常１４例，异常率９．３％；

Ｙ染色体微缺失１６例，异常率１０．７％。结论对无精症及严重少精症患者进行染色体核型分析和Ｙ染色体微缺失检测，可为患者在ＩＣＳＩ辅助助孕前提供筛选依据，避免在ＩＣＳＩ治疗中将遗传缺陷传递给子代，同时减少患者精神上和经济上的负担。

关键词：染色体；核型；Ｙ染色体微缺失；无精症；严重少精症

ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｓａｎｄＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａｏｒｓｅｖｅｒｅｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａＴＥＮＧＸｉａｎｌｉｎ，ＳＨＩＪｉｎｑｉａｏ，ＧＵＯＨｕｉ，ＺＨＯＵＹａｎｘｉａ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＪｉｎｈｕａＰｅｏｐｌｅ’ＳＨｏｓｐｉｔａｌ，ＺｈｅｊｉａｎｇＪｉｎｈｕａ３２１０００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｓａｎｄＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａｏｒｓｅｖｅｒｅｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＳＩ）ｂｅｆｏｒｅｐｒｅｇｎａｎｃｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｔｏｔａｌｏｆ１５０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａｏｒｓｅｖｅｒｅｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄ．ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈＧ－ｂａｎｄｉｎｇ．Ｙｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｅｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｒｅｗｅｒｅ１４ｃａｓｅｓｏｆａｂｎｏｒｍａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｓａｎｄ１６ｃａｓｅｓｏｆＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎ１５０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａｏｒｓｅｖｅｒｅｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，ａｎｄｔｈｅ

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据世界卫生组织调查显示，全世界有１５％的

夫妇患有不孕不育症，其中男性因素占４０％一

５０％，而３０％的男性不育是由遗传因素引起的生

精障碍¨ｏ，表现为无精或少精。男性不育遗传因

素主要包括三方面：（１）染色体核型异常，如克氏

症４７，ＸＸＹ；（２）Ｙ染色体微缺失，如ＡＺＦｂ缺失；

（３）基因突变，如囊性纤维化病等。目前，对无精

症及严重少精症患者辅助生育的有效治疗方法是

卵细胞浆内单精子注射术（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍ

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＣＳＩ），精子的主要来源是精液中排出

的少量精子，也可以通过睾丸细针穿刺术或经皮

附睾穿刺抽吸取精术获取。这些技术的应用，使

自然选择的过程大大减少，增加了将父代的遗传

缺陷垂直遗传给男性子代的风险。因此，精子异

作者简介：滕贤麟，男，１９７８年生，学士，主管技师，主要从事临床检验工作。常的不育患者在ＩＣＳＩ辅助助孕前都应常规进行遗传学筛查，包括染色体核型分析和Ｙ染色体微缺失检测。我们通过对金华地区１５０例无精症及严重少精症患者的染色体核型分析和Ｙ染色体微缺失检测，旨在分析其异常发生的分布和频率，为不育患者在ＩＣＳＩ治疗前提供必要的遗传咨询。

材料和方法

一、材料

１．研究对象２０１０年５月至２０１２年１２月来金华市人民医院生殖中心就诊的１５０例无精症或严重少精症患者（按照世界卫生组织标准连续３次精液常规分析确诊），年龄２５～３８岁；正常对照２０名（年龄２５—３５岁），分别采取２份外周血标

万方数据

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本，１份乙二胺四乙酸抗凝用于Ｙ染色体微缺失分析，１份肝素抗凝用于染色体核型分析。

２．仪器和试剂（１）试剂：ＤＮＡ提取和扩增试剂购自深圳亚能生物技术有限公司，试剂批号２０１００４０１；ＲＰＭｌｌ６４０培养基为湖南湘雅基因技术有限公司，试剂批号２０１００３２６；（２）仪器：美国伯乐公司的ＭＪＰＴＣ－２００型聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增仪，江苏兴化市仪器厂的ＤＹ一１Ａ稳流稳压电泳仪。

二、方法

１．外周血染色体检查取正常人和患者外周血做淋巴细胞培养，制片，Ｇ显带核型分析，镜下计数３０个分裂相，分析３—５个核型，异常核型做加倍分析，结果分析按照人类细胞遗传学国际命名体制进行。

２．Ｙ染色体微缺失检测取患者乙二胺四乙酸抗凝血，按照全血细胞ＤＮＡ提取试剂盒说明提取ＤＮＡ。根据ＡＺＦ区所检测的１５个特异性标签序列位点的片段大小进行适当组合，分成４管（Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）进行ＰＣＲ扩增，每管采用性别决定因子作为内控，Ｉ管为ＳＹ２５４、ＳＹｌ４３、ＳＹ２４２、ＳＹ２５５，ＩＩ管为ＳＹ８４、ＳＹ２３９、ＳＹｌ５２，Ⅲ管为ＳＹ８６、ＳＹｌ２７、ＳＹｌ４５、ＳＹｌ２４，１Ｖ管为ＳＹｌ３４、ＳＹ８２、ＳＹｌ２８、ＳＹｌ３３。按照试剂说明书进行扩增，扩增产物用２％的琼脂糖凝胶电泳检测，每管扩增产物均能跑出内控带，根据电泳跑出的条带和正常男性的标准条带进行对比，从而得出是否有缺失及缺失位点。

本研究中，检测人员２００９年５月经浙江省临床检验中心举办的ＰＣＲ培训班取得ＰＣＲ上岗证。ＰＣＲ实验室于２００４年通过卫生部验收，２００９年通过复审。具有开展Ｙ染色体微缺失的条件和资质。

结果

１５０例无精症及严重少精症患者染色体异常核型１４例（９．３％），Ｙ染色体微缺失１６例（１０．７％），２０名正常对照者未见异常核型和Ｙ染色体微缺失，具体结果见表１；１４例染色体核型异常中染色体数目异常４例，Ｙ染色体长臂缺失３例，平衡易位５例，臂间倒位１例，环形染色体１例，见表２；１６例Ｙ染色体微缺失中Ｃ、ｄ座位联合缺失１３例，ｂ、Ｃ、ｄ座位联合缺失２例，ｂ座位缺失１例，见表３。可见，无精症及严重少精症组的染色体核型异常率和Ｙ染色体微缺失率都显著高于精液正常对照组。

表１１５０例无精及严重少精症患者核型和

Ｙ染色体微缺失检测结果

缺失座位缺失例数缺失位点

讨论

导致男性不育的各种因素中遗传因素近占三分之一，染色体核型异常和Ｙ染色体微缺失为常见遗传因素。本研究在无精及严重少精症患者中检测到染色体核型异常，发生率为９．３％，与孙宝刚等旧。研究报道的９．３％结果相近；Ｙ染色体微缺失发生率为１０．７％，与杨欢利等＂ｏ报道的９．６％结果相近。本研究发现导致男性无精或少精的染色体异常核型中以Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ综合征（４７，ＸＸＹ）和Ｙ染色体长臂缺失为主。４７，ＸＸＹ染色体异常核型较正常男性多了１条ｘ染色体，使睾丸的发育受到影响，睾丸功能萎缩，临床表现有睾丸发育不良、无精子、第二性征发育不良等。本研究中检出４６，ＸＹ，ｄｅｌ（Ｙ）３例，其Ｙ的长臂明显短于正常，有微小的缺失。由于男性生殖器官的发育和成熟是Ｙ染色体上睾丸决定因子和睾丸成熟因子等一系列基因的协调作用，染色体结构异常均会造成基因片段缺失或重复，基因协调受阻而导致无精症或严重少精症‘４Ｊ。染色体平衡易位由于没有发生遗传物质的丢失，所以患者的表型正常。有报道平衡易位也可以引起不育，可能是同源染色体在减数分裂前期不能联合，引起配子染色体大片段遗传物质的重

万方数据

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复和缺失，导致基因组不平衡，引起配子死亡，造成少精子症或无精症∞Ｊ。另外，ｌ例常染色体结构异常的病例为９号染色体的臂间倒位，对于９号染色体倒位在不孕、不育中的作用一直存在争议，尚无明确的定论‘６Ｊ。因此，该例少精子症是否由９号染色体倒位引起还有待进一步深入研究。可见，染色体的核型异常可以导致男性的无精或少精，其中一部分核型异常如Ｋｌｉｎｅｆｅｈｅｒ综合征表现为无精症，几乎无法从睾丸穿刺取得精子，在ＩＣＳＩ辅助助孕前就需要选择供精；而有部分如平衡易位患者因其生殖细胞会出现遗传物质的重复或缺失，需要选择第３代试管婴儿技术，即需要做植入前诊断；而一般的生殖中心只能做第２代，因此在ＩＣＳＩ辅助助孕前做染色体核型分析除了可以避免把遗传缺陷传给子代，还可以帮助患者减少精神上和经济上的负担。

Ｔｉｅｐｏｌｏ等＂ｏ首次发现了Ｙ染色体长臂１区ｌ带存在精子发生相关基因，称为无精子因子，后来有学者提出将无精子因子分为：无精子因子ａ、无精子因子ｂ、无精子因子ｄ、无精子因子ｃ４个功能区，每个功能区在男性生殖细胞发育的不同时期起着重要的作用，不同区域的缺失有着不同的临床表现。无精子因子ａ缺失导致精子在青春期前发生阻滞，表现为唯支持细胞综合征，临床还表现为无精子生成。无精子因子ｂ缺失导致在减数分裂前期或减数分裂中精子生长阻滞，停留在精母细胞阶段，睾丸内可见精原细胞和初级精母细胞，没有精子生成。无精子因子ｃ缺失者的临床表现呈多样化，可从正常精子到无精子各种表型。无精子因子ｄ缺失可导致不同程度的生精障碍。本研究发现Ｙ染色体微缺失以无精子因子ｃ和无精子因子ｄ缺失为主，这也是热点缺失区域旧Ｊ，无精子因子ｂ缺失相对较少，未发现无精子因子ａ缺失。这类有Ｙ染色体微缺失的无精症或严重少精症患者，若是无精子因子ａ和无精子因子ｂ完全缺失患者，几乎不能从睾丸内获得精子，只能选择供精，因此在辅助助孕前进行Ｙ染色体微缺失检测，可减少不必要的睾丸穿刺取精，可降低患者身体、精神上的伤害及减少经济负担。对于无精子因子ｃ和无精子因子ｄ缺失但尚有精子的患者，其精子数目有进行性下降的趋势，部分患者最后发展为无精子症，此类缺失患者应及早治疗或将精液进行冷冻保存，避免发展到无精症时进行有创伤的取精，且在ＩＣＳＩ辅助助孕时需要选择女性胚胎，以免将缺失遗传至下一代。

随着辅助生殖技术的发展，为越来越多的不育患者获得后代提供了机会，特别是一些无精症或严重少精症患者只有通过ＩＣＳＩ才能有机会获得自己的后代。但是通过ＩＣＳＩ助孕的方式越过了一些自然淘汰的屏障，具有将亲代的一些遗传缺陷垂直传递给子代的风险。因此建议在ＩＣＳＩ治疗前均应先做染色体核型分析和Ｙ染色体微缺失检测，如有核型异常或无精子因子缺失，为不育患者是否行ＩＣＳＩ治疗或行ＩＣＳＩ治疗时用种植前的遗传诊断选择女婴提供遗传咨询，尽量避免把遗传缺陷传给后代。

综上所述，在无精症和严重少精症的男性不育患者中，染色体核型异常和Ｙ染色体微缺失是导致不育的重要遗传因素。因此，需要对这类患者进行染色体核型分析和Ｙ染色体微缺失检测，为辅助生殖提供遗传咨询和制定合理的治疗方案提供依据。

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（收稿日期：２０１４－０５—１２）

（本文编辑：范基农）

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