His-Tag表达蛋白纯化原理
[应用]His-GFP蛋白的纯化步骤
![[应用]His-GFP蛋白的纯化步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/e498d7d1ab00b52acfc789eb172ded630b1c983f.png)
以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。
使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。
His6标签有许多优点：（1）由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
His6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。
1. E. coli重组菌体破碎表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。
当需要破碎的细胞沉淀较少（＜ 1 g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。
而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。
本实验采用细胞破碎仪法。
细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。
如，1 g细胞沉淀加入约10 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。
过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。
裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 × protease inhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。
His-Tag蛋白纯化步骤
变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1× PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS），并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 × PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30～60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。
His标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4℃下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.5～1 ml/min的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit（No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。
His标签蛋白纯化
His标签蛋白纯化His标签是由6至10个组氨酸残基组成的一种表位标签，很容易被标签特异性抗体识别。
His标签是蛋白纯化和检测的常用标签之一，由于其分子量小（只有0.84KD），融合到重组蛋白后，不会影响标记蛋白质的结构和生化特性。
His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等，应用十分广泛。
His标签蛋白纯化原理His标签蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化的方法，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸残基的蛋白。
由于His标签可与多种金属离子（如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe2+等）发生特殊的相互作用，所以可利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。
组氨酸的残基上带有1个咪唑基团，可与Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性结合在金属离子上，这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性结合在介质上，而其他杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。
结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到纯度较高的His标签蛋白。
Ni2+、Co2+和Cu2+是His标签蛋白纯化中使用较为广泛的金属离子，因为它们在水溶液中与组氨酸具有较好的亲和性。
其中，Ni2+是亲和纯化实验中最常使用的，根据结合基团不同，Ni2+亲和层析柱可分为两类：一类是Ni-IDA，另一类是Ni-NTA。
Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-NTA螯合了四价，Ni-IDA螯合了三价。
所以，IDA的载量要比NTA高，在同样条件下，Ni-IDA洗脱时所需的咪唑浓度要高于Ni-NTA，但其弱结合能力使金属离子在洗脱时容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。
NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落，所以实际实验中往往选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。
His蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸(His)标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
6X组氨酸标记(His-tag)蛋白纯化试剂盒产品说明书(中文
1． 本产品为 5 次操作 2． 操作时，须戴手套 3． 整个操作在 4℃温度下进行 4． 如果用户需要获得变性标记蛋白，建议使用变性液（Reagent D），整个操作在室温下进行 5． 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品须完全可溶状态，否则影响蛋白的结合（例如包涵体）；建议使用
不溶性融合蛋白溶解试剂盒（ 30016 ）帮在纯化前，须进行目标蛋白鉴定试验，例如 IPTG 测试；建议使用
2
白浓度 14．本公司提供系列融合蛋白处理试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能长期稳定 2． 本产品经鉴定结合效果满意
HIS 标记蛋白扩增试剂盒（ ＨＬ30018.1 ） 7． 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品避免含有二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇（BME）、EDTA、EGTA 等
化学成分 8． 亲和液（Reagent B）建议保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，建议分装 9． 亲和液（Reagent B）每次使用 1 毫升，可结合 5 至 10 毫克目标蛋白，回收率高达 95％。
产品内容
平衡液（Reagent A） 亲和液（Reagent B） 洗脱液（Reagent C） 产品说明书
XX 毫升 XX 毫升 XX 毫升 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证 6 月
用户自备
变性液（Reagent D）：用于变性融合蛋白纯化 透析液（Reagent E）：用于蛋白纯化后透析 细菌可溶性总蛋白样品：用于纯化的待测样品 1.5 毫升离心管：用于反应操作的容器 50 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器 平式摇荡仪：用于混匀反应物 4℃台式离心机：用于沉淀反应物 4℃微型台式离心机：用于沉淀反应物
6 X 组氨酸标记（His-tag）蛋白纯化试剂盒产品说明书（中文版）
“His-tag蛋白的亲和层析纯化及检测”生化实验报告
His-tag蛋白的亲和层析纯化及检测操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXXX 温度：16℃一、实验目的：1.了解亲和层析纯化蛋白的原理；2.了解6xHis-tag标签蛋白的的亲和层析纯化原理；3.学会亲和层析的操作方法和超滤管的使用方法和原理。
二、试验方法与过程：1.清洗凝胶：向已经装柱并使用过的层析柱中加入20mlddHO（沿层析柱壁加2入，避免使凝胶不平衡）。
2.平衡：沿壁旋转加入10ml 0mM咪唑溶液，打开开关，释放缓冲液，用烧杯接废液，凝胶上保留0.3cm溶液，使凝胶处于一定的盐浓度和pH。
3.上样：将细胞裂解上清液3ml缓慢加入柱子中，将开关打开，让未结合的蛋白随液体缓慢流出，收集流穿液。
4.洗涤及洗脱：分别用0mM咪唑缓冲液洗脱10ml；20mM咪唑缓冲液洗脱10ml；200mM咪唑缓冲液洗脱5ml；1M咪唑缓冲液洗脱5ml。
每个浓度的流出液都收集在试管中，每次洗脱都保持凝胶上保留0.3cm高度的溶液，流速大约30-40滴/分钟，收集下一浓度洗脱液前先释放20滴于上一管中。
5.观察：各取100ul于紫外灯下观察，比较哪个浓度的咪唑缓冲液下的洗脱液荧光最亮。
6.离心：将紫外灯下最亮的洗脱液转入浓缩管中8000rpm离心10min，将浓缩液吹打后收集，至于-20℃冰箱保存。
7.清洗凝胶：用20ml蒸馏水冲洗凝胶，将凝胶保留在蒸馏水中。
三、原始数据：图一紫外灯下观察结果，从左到右咪唑缓冲液浓度依次增加四、结果处理与分析：使用200mM咪唑缓冲液洗脱的溶液荧光最亮，蛋白含量最高。
五、讨论：1.心得与体会：向层析柱加入蒸馏水、洗脱液时，一定要沿管壁缓慢加入，防止加入时压力太大，使凝胶柱表面不平整。
2.思考题：（1）纯化蛋白质时引入标签蛋白的优缺点：优点：简单亲和纯化、可实现；增加蛋白表达量和稳定性；增加外源蛋白的可溶性及正确折叠。
缺点：如果蛋白不可溶，很难纯化；有些蛋白分子量较大又不能用专门的亲和基质纯化，会影响蛋白质的功能和下游实验；不是所有标签蛋白都具有很好的特异性，尤其是一些分子量小的标签蛋白。
HisTag_融合蛋白纯化(默克新版)
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何 BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。 2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括 His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表 1。 例如，某蛋白表达水平约为 0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则 100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩 100 倍比例重悬于含变性剂的 1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用 50-100 倍浓缩。
产品使用说明书
His·Tag 融合蛋白纯化操作手册
采用 pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到 20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考 pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和 E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用 NTA His·Bind 树脂或 IDA His·Bind 树脂进行纯化。
蛋白纯化知识
His标签单抗，又叫6×His标签单抗，或6×His单克隆抗体，英文全称为anti-6*His tag monoclonal antibody，因为制备单抗的实验动物多为小鼠，所以小鼠来源的His标签抗体英文全称为Mouse anti-6*His tag monoclonal antibody。
目前市场上用到的His标签单抗基本都是用小鼠制备的
根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。
用于融合表达的亲和纯化蛋白标签，首先个子越小越好，这样不会对目标蛋白的构象，大小和特性有影响。
*（以前常用的融合表达亲和纯化蛋白GST标签个子就比较大）第二生理条件下带电越少越好。
第三融合标签的免疫原性越少越好，融合产物不必去除标签可直接作为抗原免疫。
6xHis Tag的6个组氨酸比较小，ph8是不带电，免疫原性差。
螯合物：NTA(氮川乙酸) IDA(亚胺二乙酸)
离子交换介质：通过调节ph，可以改变蛋白质的带电性质，从而改变离子交换层析行为。
当ph低于蛋白质等电点时，蛋白质被阳离子交换介质吸附，反之蛋白质被阴离子交换介质吸附。
His-Tag表达蛋白纯化
His-Tag 表达蛋白纯化原理、方法和问题分析（转）组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porat h et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和N i2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
纯化his标签蛋白的镍柱填料
纯化his标签蛋白的镍柱填料如何纯化His标签蛋白的镍柱填料。
第一部分：理论知识介绍（8001000字）1.1 His标签蛋白的定义和性质His标签是通过基因工程技术将610个连续的组氨酸残基（His）插入到目标蛋白的其中一段序列中，以便后续纯化和检测。
His标签蛋白具有一些独特的性质，如易表达、易纯化和高亲和力等。
1.2 镍柱填料的原理和应用镍柱填料是常用的His标签蛋白纯化材料之一，它利用镍离子与His标签之间的特异性亲和力来实现纯化。
填料的主要成分是硅胶固相材料，通过将镍离子与其配位，形成一种特定的亲和柱填料。
1.3 纯化His标签蛋白的步骤纯化His标签蛋白的基本步骤包括样品处理、柱子平衡、负载和结合蛋白、洗脱、再平衡等。
其中，填料的选择和操作条件的优化对纯化的效果起着关键作用。
第二部分：实验方法介绍（20004000字）2.1 镍柱填料的选择和预处理在实验开始之前，我们需要选择合适的镍柱填料。
可以从商业供应商购买预包装的填料，也可以选择自包装的填料。
并且，填料在使用之前需要进行预处理，如清洗和等离子改性处理。
2.2 样品处理和柱子平衡将待纯化的His标签蛋白样品进行必要的处理，如去除杂质和浓缩。
然后将样品废液进行平衡柱中，以保证柱子在纯化过程中的流动性和亲和性。
2.3 His标签蛋白负载和结合通过将样品溶液添加到镍柱中，利用His标签与镍离子之间的亲和力，使His标签蛋白能够与填料结合。
在此步骤中，控制pH值、盐浓度和蛋白负载量等因素十分重要。
2.4 洗脱和再平衡在结合蛋白后，通过逐渐提高洗脱缓冲液的镍离子浓度或改变pH值，使结合的His标签蛋白从填料中洗脱出来。
最后，再平衡填料以便下一次的使用。
第三部分：常见问题及解决方法（2001000字）3.1 His标签蛋白不结合或结合不牢固可能是因为填料的质量或预处理步骤不当，可以尝试更换填料或者重复预处理步骤。
3.2 His标签蛋白洗脱不完全可以尝试调整洗脱缓冲液的镍离子浓度、pH值或者增加洗脱缓冲液的体积。
His标签融合蛋白纯化常见问题解析
His标签融合蛋白纯化常见问题解析（博进生物）1. 纯化原理His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。
组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。
通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。
2. His标签蛋白纯化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：2.1 标签长度及暴露程度最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在4-10个组氨酸的标签长度。
标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。
过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越高，结合能力越强。
2.2 过渡金属离子半径常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。
上述金属离子与His标签蛋白结合能力的强弱顺序为Cu2+ >Zn2+ >Ni2+ >Co2+2.3 缓冲液条件His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。
在中性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。
His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用还受缓冲液种类的影响。
通常磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。
由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的升高可减弱上述螯合作用力。
His标签蛋白纯化全攻略
His标签蛋白纯化全攻略作为重组蛋白构建过程中最常用的标签，相信奋战在实验室中的小伙伴对His标签并不陌生。
His标签可通过Ni2+柱进行简单有效的纯化，不过纯化容易想要纯化好却并不那么容易。
爱纯派助力His标签纯化，马上为大家送上His标签纯化全攻略。
His标签蛋白的纯化原理组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。
结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的His标签蛋白。
His标签蛋白纯化说起来简单做起来难。
小编也常常收到小伙伴们类似于“His标签重组蛋白Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His标签蛋白挂不到Ni2+柱上”等等之类的抱怨。
其实呢，不怕做不到，就怕没想到。
His标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~His标签纯化优化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用力的强弱，而这种作用力主要和一下因素相关：1） 标签长度及暴露程度：最常用的His标签时6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。
较短的标签与金属离子的结合更弱，较长的标签与金属离子的结合更强；而标签的暴露程度也很容易理解，金属离子只能和蛋白表面的His结合，所以His标签暴露程度越高，结合能力越强。
2） 金属离子半径：除最常用的Ni2+以外，但 Cu2+、Zn2+、Co2+等金属离子都可用于标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，离子半径越小，与与His His标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，的结合能力也就越强。
His-Tag 表达蛋白纯化原理、方法和问题分析
之阳早格格创做组氨酸标签蛋黑的杂化His-Tag混同蛋黑是暂时最罕睹的表黑办法，而且很老练，它的便宜是表黑便当而且基础不效率蛋黑的活性，无论是表黑的蛋黑是可溶性的大概者包涵体皆不妨用牢固金属离子亲战色谱去（IMAC）杂化.2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用牢固IDA动做配基的挖料螯合过度金属铜、镍、钴大概锌离子，不妨吸附杂化表面戴组氨酸、色氨酸大概半胱氨酸残基的蛋黑，1987年Smith et al. 创造戴有几个组氨酸大概色氨酸小肽战螯合金属离子的IDA-sephadex G-25效率力更强，此前正在1986年他战他的合做家用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲战杂化正在氨基端戴组氨酸战色氨酸的胰岛素本.共年1987年Hochuli et al.创造戴有贯串组氨酸的多肽战Ni2+-NTA挖料效率力更强于一般的肽，1988年他第一次用那样的要领杂化了戴六个组氨酸标签的多肽，无论是正在天然仍旧变性条件下一次亲战杂化皆得到很佳效验，今后表黑戴六个组氨酸标签的蛋黑协共IMAC变得非常普遍，相对付而行，不戴标签的蛋黑杂化便非常艰易，所以表黑戴六个组氨酸标签的蛋黑协共IMAC 杂化形成最时常使用而且最灵验的钻研蛋黑结媾战功能的有力脚法.1986年Porath et al.还创造Fe3+-IDA-sephadex G-25不妨用于磷酸化蛋黑的杂化，而后创造Ga3+-IDA也有共样的效验，那样螯合那二种金属离子的挖料便灵验用于磷酸化多肽的富集战杂化，共时IMAC也不妨用于杂化百般战金属离子分离的多肽，应用非常广大.市里罕睹的商品化IMAC用于戴六个组氨酸标签蛋黑的配基有以下几种：2.2效率IMAC杂化截行的果素：2.2.1挖料的种类：分歧挖料厂家的挖料有不共，所以使用历程最佳能得到厂家的技能支援，果为分歧的厂家挖料分歧，别的蛋黑杂化本性很强，不哪一个挖料是能符合所有戴六个组氨酸标签蛋黑的杂化，载量下战特同性佳自己便是冲突.2.2.2挖料的配基种类、稀度、金属离子种类挖料最简朴的推断是螯合佳共样的金属离子，哪产业品的颜色越深便表示着战蛋黑的效率力越强，适用范畴越广，载量也越下，杂化的佳坏关键瞅杂化的条件，仅有挖料的特同性是不敷的，共样配基稀度下IDA挖料的亲战力要比NTA的强，所以NTA上不克不迭吸附的样品不妨采用IDA为配基的挖料.螯合金属离子战蛋黑效率强强为铜战镍离子的强，而锌战钴离子的强.果此如果一个蛋黑效率力强，念得到佳的特同性不妨采用螯合钴离子，它另有一个便宜是不怕还本剂，特天时间有下浓度的还本剂.相共金属离子，IDA的强于NTA.螯合金属离子的价位越矮战蛋黑的效率力越强.共时镍离子是最时常使用的，如果有条件不妨换分歧金属离子以得到更佳的效验，果为分歧的金属离子有分歧的采用性.果此要期视挖料应用范畴广便采用镍琼脂糖凝胶，如果是期视特同性佳而且宁静便采用镍NTA琼脂糖凝胶.2.2.2蛋黑自己的结媾战样品根源IMAC本理已经证明只消是戴组氨酸、色氨酸大概半胱氨酸残基的蛋黑皆不妨被吸附，所以要念得到佳的杂化效验，必须采用佳杂化的条件，常常戴组氨酸蛋黑皆不妨正在天然情况下被镍琼脂糖凝胶大概镍NTA琼脂糖凝胶吸附，然而是如果标签合叠正在蛋黑里里阻挡易表露，那样便易杂化，如果镍琼脂糖凝胶皆不克不迭吸附，不妨正在样品战仄稳慢冲液中加1-2M 脲，那样蛋黑结构相对付紧集，也许能吸附而蛋黑不会变性，对付于自己便是变性的蛋黑如果8M脲不克不迭吸附，改用6M盐酸胍溶解样品便不妨被吸附，果为盐酸胍不妨挨启脲挨不启的结构使得标签能表露.天然如果有二硫键最佳加1-2mMDTT也不妨更佳办理吸附的问题.别的也不妨把标签换到其余一端.2.2.3 慢冲体系，pH及盐浓度对付于一些效率力强的蛋黑不克不迭采用戴氮本子的的一些慢冲体系，如Tris-HCl等，符合普及慢冲液pH不妨减少吸附效验，共样本理不妨降矮pH洗脱一些咪唑洗不去的杂戴.为预防由于电荷效率的搞扰，仄稳慢冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而正在仄稳慢冲液增加00.1-0.5%吐温大概者triton不妨降矮由于疏火相互效率引导的非特同吸附.2.2.4 表面活性剂及其余增加剂增加一些表面活性剂不妨减少蛋黑的溶解度，降矮疏火相互效率，那样使杂化的截行更佳，正在真验标明正在仄稳慢冲液中加0.5-1%的吐温不妨使电泳的背景更浑晰，杂戴缩小.对付一些易溶解的样品也不妨加乙醇大概者苦油.正在变性条件下偶尔会正在样品中增加还本剂如巯基乙醇大概者二巯基苏木糖醇，它们如果浓度过下大概者上样量过大，会引导镍离子还本以至脱降，使挖料做废，如果要正在那样的环境下，那最佳采用螯合价位下的挖料如镍NTA琼脂糖凝胶大概降矮还本剂的浓度，常常1-2mM是出问题的.如果一定要采用下浓度的还本剂，也不妨把镍离子还成钴离子，它不怕还本，把一般的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可.以下是破碎及提与、杂化支配战罕睹问题办理要领：破碎要领样品的处理对付杂化是很要害的，要害的准则是破碎要温战，不克不迭使蛋黑断裂大概者降解，可则一些片段共样也戴有标签，那样减少了杂化的易度.需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间大肠杆菌的破碎要领：1）支集培植收酵液，4度7000-8000g离心10分钟，支集重淀的菌体(如果不是赶快破碎不妨搁-70度热冻，然而是最佳能保存成小块大概者薄片，那样佳用.)2）与1-2克菌体加10ml破碎慢冲液（pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）正在冰上混同45分钟，如果pH不正在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混同时间不妨支缩到10分钟.3）把混同菌体正在冰火中用超声探头破碎20秒种,总合四次,中间隔断要脆持2分钟热却破碎液,检测pH,如果不正在7-8,仍旧用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,不妨下压破碎的要领,慢冲液共上,体积为1降,破碎三次,压力为800 bar.4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄浑，不妨4度50000g离心30分钟，那时间不妨把上浑战重淀分别留样，跑电泳，如果只重淀中有目标蛋黑，那便用变性条件下去提与.5）破碎离心的上浑加2M咪唑溶液0.12ml使末浓度为20mM，样品的总体积为10ml.过柱子的样品最佳过0.45μm的滤膜，预防堵柱.2．可溶性蛋黑的杂化1）仄稳慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑.2）洗脱慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑.3）与1ml镍琼脂糖凝胶FF大概镍NTA琼脂糖凝胶FF预拆柱，用10ml仄稳慢冲液仄稳，而后与破碎上浑10ml样品以0.5ml/min上样，而后2ml/管分管支集.4）用15ml仄稳慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.5）用5 ml洗脱慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.6）再用5ml仄稳慢冲液仄稳柱子，灌谦20%乙醇，启关，以备下次使用.7）此要领是通用的要领，然而是一定能得到符合自己蛋黑的谦意效验，所以劣化的办法是洗脱不妨用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，那样协共电泳检测，得到符合自己的蛋黑的条件.8）支集的部分不妨用紫中分光光度法、BCA法大概用考玛斯明蓝法测定蛋黑的浓度，再与有蛋黑的部分电泳检测杂度.3．罕睹问题及办理要领1）蛋黑不溶解大概重淀正在柱子上：要注意慢冲液体的pH，别的表样品中增加一些表面活性剂以至乙醇等有机溶剂不妨减少疏火性蛋黑的溶解度，预防重淀.2）蛋黑不吸附：那是最罕睹的，常常的本果有1是标签不表露，被合叠正在蛋黑的结构内，不妨正在变性的条件下去杂化，2不妨采用效率力更强，配基稀度更下的挖料，常常镍琼脂糖凝胶效率力最强，如果蛋黑分子量大不妨采用脚臂少的挖料，如镍NTA琼脂糖凝胶，挖料的佳坏不妨瞅挖料的颜色，颜色越深那配基稀度越下，效率力也相映要强.3样品的pH过矮大概者重淀引导不克不迭吸附，所以样品战慢冲液的pH要尽管普遍，预防重淀，常常再偏偏碱性条件下吸附更佳.3）易洗脱：如果脱透中目标蛋黑明隐缩小，而洗脱又不，与面挖料加电泳慢冲液煮后离心跑电泳仍旧有目标蛋黑，不妨用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不克不迭洗脱，不妨曲交用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂戴多：果为那种亲战到底特同性要好面，本果正在蛋黑中戴组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很罕睹，特天是蛋黑合叠会引导几个那样的氨基酸残基临近，那样也会使它们战镍柱的效率力减少，果此不妨用分歧浓度的咪唑阶段洗脱，别的表咪唑洗脱前减少一步0.5M pH5的醋酸慢冲液洗脱，正在仄稳慢冲液中增加0.5%吐温大概Triton不妨预防果为疏火相互效率引导非特同吸附，那样不妨电泳的杂戴明隐缩小，然而是如果用那样的要领仍旧杂戴多，那便天转头去瞅瞅破碎的条件是不是太剧烈大概者温度统造短佳引导蛋黑短裂大概者领会引导一些蛋黑片段戴标签，大概者果为样品万古间保存引导火解等，总之杂化的佳坏决断于每一个步调，不然而仅是杂化的问题.另有一个阻挡忽略的问题是偶尔间果为蛋黑相互效率大概者果为产生散合体引导杂戴减少，而由于疏火相互效率大概者果为离子效率不妨通过增加表面活性剂大概者减少离子强度得到革新，对付于果为产生散合体的不妨正在慢冲液战样品中加1-2mM巯基乙醇预防，如果那样的情况下最佳是采用镍NTA琼脂糖凝胶，果为它正在还本剂下更宁静.包涵体蛋黑的杂化及复性包涵体破碎1、大肠杆菌的破碎要领：１) 支集培植收酵液，4度7000-8000g离心10分钟，支集重淀的菌体(如果不是赶快破碎不妨搁-70度热冻，然而是最佳能保存成小块大概者薄片，那样佳用.２) 与1-2克菌体加10ml破碎慢冲液（pH8.5 50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5% Triton X-100，1mg/ml溶菌酶.）正在冰上混同45分钟.３) 把混同菌体正在冰火中用超声探头破碎20秒种,总合四次,中间隔断要脆持2分钟热却破碎液,检测pH,如果不正在8.5,仍旧用1M Tris溶液一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,不妨下压破碎的要领,慢冲液共上,体积为1降,破碎三次,压力为800 bar.４) 破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄浑，不妨4度50000g离心30分钟，那时间不妨把上浑战重淀分别留样，跑电泳，如果只重淀中有目标蛋黑，那便用变性条件下去提与.５) 破碎离心的重淀用4M荡涤包涵体，再离心得重淀加（pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M脲，20mM咪唑）.过柱子的样品最佳过0.45μm的滤膜，预防堵柱.4．包涵体蛋黑的杂化1）仄稳慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M 脲，20mM咪唑.2）洗脱慢冲液：pH7.4的50mM磷酸慢冲液含0.5M NaCl，8M脲，含500mM咪唑.3）与1ml镍琼脂糖凝胶FF大概镍NTA琼脂糖凝胶FF预拆柱，用10ml 仄稳慢冲液仄稳，而后与破碎上浑10ml样品以0.5ml/min 上样，而后2ml/管分管支集.4）用15ml仄稳慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.5）用5 ml洗脱慢冲液洗去已吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管支集.6）再用5ml仄稳慢冲液仄稳柱子，灌谦20%乙醇，启关，以备下次使用.7）此要领是通用的要领，然而是一定能得到符合自己蛋黑的谦意效验，所以劣化的办法是洗脱不妨用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，那样协共电泳检测，得到符合自己的蛋黑的条件.8）支集的部分不妨用紫中分光光度法、BCA法大概用考玛斯明蓝法测定蛋黑的浓度，再与有蛋黑的部分电泳检测杂度.9）其问题妥协决要领不妨参照可溶性蛋黑的杂化的相关真质.复性格中搀杂，所以修议参照文件战一些博门的叙述.罕睹问题及办理要领1）不溶解大概重淀正在柱子上：要注意慢冲液体的pH，别的表样品中增加一些表面活性剂以至乙醇等有机溶剂不妨减少疏火性蛋黑的溶解度，对付于戴半胱氨酸多的蛋黑很简单氧化汇集重淀，所以需要加2-5mM巯基乙醇预防重淀.2）黑不吸附：那是最罕睹的，常常的本果有1是标签不表露，被合叠正在蛋黑的结构内，不妨正在变性的条件下去杂化，如果用脲变性吸附短佳，不妨改用盐酸胍，部分体味是那样常常不妨使吸附不上的蛋黑得到革新，成功杂化.2不妨采用效率力更强，配基稀度更下的挖料，常常镍琼脂糖凝胶效率力最强，如果蛋黑分子量大不妨采用脚臂少的挖料，如镍NTA琼脂糖凝胶，挖料的佳坏不妨瞅挖料的颜色，颜色越深那配基稀度越下，效率力也相映要强.3样品的pH过矮大概者重淀引导不克不迭吸附，所以样品战慢冲液的pH要尽管普遍，预防重淀，常常再偏偏碱性条件下吸附更佳.3）易洗脱：如果脱透中目标蛋黑明隐缩小，而洗脱又不，与面挖料加电泳慢冲液煮后离心跑电泳仍旧有目标蛋黑，不妨用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不克不迭洗脱，不妨曲交用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂戴多：果为那种亲战到底特同性要好面，本果正在蛋黑中戴组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很罕睹，特天是蛋黑合叠会引导几个那样的氨基酸残基临近，那样也会使它们战镍柱的效率力减少，果此不妨用分歧浓度的咪唑阶段洗脱，别的表咪唑洗脱前减少一步0.5M pH5的醋酸慢冲液洗脱，正在仄稳慢冲液中增加0.5%吐温大概Triton不妨预防果为疏火相互效率引导非特同吸附，那样不妨电泳的杂戴明隐缩小，然而是如果用那样的要领仍旧杂戴多，那便天转头去瞅瞅破碎的条件是不是太剧烈大概者温度统造短佳引导蛋黑短裂大概者领会引导一些蛋黑片段戴标签，大概者果为样品万古间保存引导火解等，总之杂化的佳坏决断于每一个步调，不然而仅是杂化的问题.另有一个阻挡忽略的问题是偶尔间果为蛋黑相互效率大概者果为产生散合体引导杂戴减少，而由于疏火相互效率大概者果为离子效率不妨通过增加表面活性剂大概者减少离子强度得到革新，对付于果为产生散合体的不妨正在慢冲液战样品中加1-2mM巯基乙醇预防，如果那样的情况下最佳是采用镍NTA琼脂糖凝胶，果为它正在还本剂下更宁静.。
HisTag 融合蛋白纯化(NTA)
产品使用说明书His·Tag融合蛋白纯化操作手册采用pET系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到20mg/100ml培养物并不是困难的事。
在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。
我们建议研究者在蛋白表达后，首先进行目的蛋白的细胞定位（请参考pET系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。
外源蛋白在大肠杆菌中表达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。
尤其在高水平表达的条件下，更容易形成包涵体。
包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以通过选择不同表达载体和E.coli宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表达的目的。
His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用NTA His·Bind树脂或IDA His·Bind树脂进行纯化。
内容提要一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量2. 细菌裂解获得可溶蛋白• BugBuster Master Mix蛋白抽提方法• 机械破碎（如超声等）二、亲和纯化步骤附录：补充背景知识• NTA和IDA化学基团• His·Bind基质选择指南• 在确定裂解方法前的考虑• 蛋白可溶性及细胞定位• 天然或变性条件下目的蛋白的纯化• 批次小量纯化或柱层析纯化方法• 目的蛋白的结合• 杂蛋白• 如何降低非特异性结合• 漂洗杂蛋白• 目的蛋白的洗脱• 纯化真核表达体系来源的His·Tag融合蛋白• His·Tag融合标签的去除• 推荐资料Ni-NTA 树脂纯化1. Ni-NTA树脂的兼容性2. 天然条件纯化• 柱层析• FPLC• 批次小量纯化3. 变性条件的纯化• 柱层析• FPLC纯化• 批次小量纯化4. 树脂再生5. 常见问题与改善建议一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag融合蛋白表达水平和上样量。
蛋白纯化His-tag介绍、优势及原理
蛋白纯化His-tag介绍、优势及原理1、什么是His-tag？His-tag单抗又叫6*His-tag单抗，或6*His单克隆抗体，用小鼠制备，His可被镍柱吸附，用于纯化重组蛋白，无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析（IMAC）纯化。
金属螯合亲合层析，又称固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），是近30年发展起来的一种新型分离技术。
最早由Paroth等人提出。
该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。
这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，而且这其中又以6组氨酸标签（His-Tag）应用最为广泛。
His-tag是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为6个组氨酸HHHHHH，其特点是分子量小，只有不到0.84 KD，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便。
根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，His-Tag 可结合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。
人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his-tag的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。
以实验小鼠为宿主制备的His-tag单抗叫His-tag鼠单抗。
其制备方法通常是这样的：人工合成6*His多肽，即氨基酸序列为HHHHHH 的多肽，必要时在末端添加偶联载体用到的特殊氨基酸。
合成好此多肽后，通过化学方法将此多肽与载体蛋白偶联（如KLH、BSA、OVA 等），偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，免疫结束后杀死免疫好的小鼠，无菌条件下取脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合，用ELISA或者其它手段进行筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到His-tag鼠单抗，再用Western blot或其它手段进行鉴定即可。
常见tag蛋白标签介绍
常见tag蛋白标签介绍在分子生物学和生物化学领域中，蛋白质标签是进行蛋白质表达、纯化和定位的重要工具。
其中，tag蛋白质标签是通过在蛋白质的N端或C端结合不同的蛋白质标签，可用于检测、纯化和追踪蛋白质。
下面，我们将介绍几种常见的tag蛋白标签。
His-TagHis-Tag是由6个组氨酸序列（His-His-His-His-His-His）组成，并且容易被许多金属离子亲和树脂（如Ni-NTA矩阵）捕捉。
这使得His-Tag成为常用的纯化标签之一。
此外，His-Tag蛋白标签具有中性对目标蛋白质溶解压力的作用，能够在蛋白质纯化的过程中保持目标蛋白原始的构象和生物活性。
GST-TagGST-Tag是由谷氨酸（G）-丝氨酸（S）-硫氨酸（T）三个氨基酸，以及谷氨酸二肽（DGP）组成的标签。
GST-Tag主要用于增强蛋白质的溶解和稳定性，并且也常用于纯化蛋白质。
此外，由于GST-Tag蛋白标签对多种酶具有亲和性，也可以用于显微镜研究中的指示标记。
FLAG-TagFLAG-Tag标签由Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DYKDDDDK）组成，通常用于识别和高效表达蛋白质。
FLAG-Tag的鉴定方法是通过利用抗体识别FLAG标签，从而对FLAG标签的蛋白产物进行检测分析。
由于其广泛应用和成功的用例，它成为了最常用的蛋白质标记之一。
HA-TagHA-Tag标签由YPYDVPDYA序列组成，被广泛用于病毒插入物好转载体的制备。
HA-Tag蛋白标签可以将蛋白质捕捉到表面上的抗HA抗体上，并通过其特异性快速检测引入的基因。
Myc-TagMyc-Tag通常由EQKLISEEDL序列组成，并且通常被用于稳定的表达和检测。
当蛋白质连接到Myc-Tag标签时，它与特异性抗体反应，从而实现检测。
Myc-Tag 标签是许多流行的促进反应的标记中最新的标记之一。
GFP-TagGFP-Tag由最常见的荧光蛋白质GFP（Green Fluorescence Protein）制成。
histag蛋白纯化步骤
histag蛋白纯化步骤
His-tag 蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，其基本步骤如下：
1. 表达和收集：通过基因工程技术在目标蛋白的 N 端或 C 端添加 His-tag 序列，并在适合的宿主细胞中表达目标蛋白。
收集表达后的细胞或细胞培养上清液。
2. 破碎细胞：使用适当的方法破碎表达细胞，以释放出目标蛋白。
3. 离心和过滤：对破碎后的细胞裂解液进行离心，去除细胞碎片和不溶性物质。
然后，通过过滤去除残留的固体杂质。
4. 结合：将离心和过滤后的上清液与含有镍离子的亲和层析树脂混合，使 His-tag 与树脂上的镍离子结合。
5. 洗涤：用适当的缓冲液洗涤树脂，以去除未结合的杂质。
6. 洗脱：使用含有咪唑或其他竞争配体的缓冲液洗脱结合在树脂上的目标蛋白。
7. 浓缩和透析：对洗脱下来的目标蛋白进行浓缩和透析，以去除残留的咪唑和其他杂质。
8. 纯度鉴定：通过 SDS-PAGE、Western blotting 等方法鉴定纯化后的目标蛋白的纯度。
9. 保存：根据需要，将纯化后的目标蛋白保存于适当的条件下，如缓冲液、冷冻保存等。
组氨酸纯化目的蛋白的原理
十点多回去的地铁上，无聊的时光陪着思绪远望窗外；安静的不可束缚的情怀似乎盯着放在地上的背包也会勾出一副诗的意境，思想里的自在至少丰富了这宁静的时光；在组氨酸标签蛋白纯化的原理中，知识的空白枯燥了看资料的心情，但不情愿辜负了跟在我身后的时光，搜集资料，开始在脑海里织网，将别人分享的知识编织成一篇新的、有价值的文章，因此生物日记实验室部落在此总结了组氨酸标签蛋白纯化的原理、在纯化时一些细节上的影响因素。
愿你也能够踩着自己的时光脚印，踏踏实实的学到一些新的知识。
——不要辜负了跟随你的时光关键词：His 标签；Ni 2+ ；咪唑基；填料；平衡缓冲液；结合缓冲液；洗脱缓冲液；组氨酸标签蛋白纯化的原理组氨酸（His ）标签蛋白纯化利用基因工程的方法将目的蛋白和亲和纯化的His 标签进行融合，充分利用标签的性质纯化重组蛋白，添加His 小标签不会影响表达蛋白的构象、活性，获得目的蛋白质之后，将分子量较大的标签切除，即组氨酸标签蛋白纯化原理可进行下一步的目的蛋白检测。
His（组氨酸）标签融合蛋白对Ni2+等金属离子有高选择的特异性，因此，Ni2+等金属离子能够螯合His标签蛋白固定在层析介质上，而其他的杂质蛋白质不能结合或者仅能微弱的结合而被洗脱下来，利用高浓度的咪唑基能够竞争性的结合Ni离子，洗脱液中含有500 mM的咪唑能够保证目的蛋白完全洗脱，从而获得目标蛋白。
这种通过亲和纯化组氨酸标签蛋白来实现目的蛋白的纯化的方法是IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)固定化金属离子亲和色谱法，是最有效的研究蛋白质结构和功能的方法。
目前，利用IDA（亚胺二乙酸）或者NTA（氮川乙酸）作为配基共价结合在固体支持物填料上，螯合过渡金属镍，吸附纯化带6个His标签的蛋白，6个组氨酸标签较小，免疫原性较差，不需要除掉小标签，只要是带组氨酸、色氨酸、或者半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附，如果需要，纯化条件可以选择将蛋白变性，然后在柱上复性。
His-Tag表达蛋白纯化原理
His-Tag表达蛋白纯化原理组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年 Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
His-Tag 表达蛋白纯化原理组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去( IMAC )纯化。
2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath etal.1975 年用固定IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987 年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25 作用力更强，此前在1986 年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987 年Hochuli etal. 发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽，1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986 年Porath etal. 还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA 也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2 影响IMAC 纯化结果的因素：2.2.1 填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
2.2.2 填料的配基种类、密度、金属离子种类填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA 填料的亲和力要比NTA 的强，所以NTA 上不能吸附的样品可以选择IDA 为配基的填料。
螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。
因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。
相同金属离子，IDA 的强于NTA 。
螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。
同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。
因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA 琼脂糖凝胶.2.2.2 蛋白本身的结构和样品来源IMAC 原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附，所以要想得到好的纯化效果，必须选择好纯化的条件，通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA 琼脂糖凝胶吸附，但是如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露，这样就难纯化，如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附，可以在样品和平衡缓冲液中加1-2M 脲，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不会变性，对于本身就是变性的蛋白如果8M 脲不能吸附，改用6M 盐酸胍溶解样品就可以被吸附，因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。
当然如果有二硫键最好加1-2mMDTT 也可以更好解决吸附的问题。
此外也可以把标签换到另外一端。
2.2.3 缓冲体系，pH 及盐浓度对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl 等，适当提高缓冲液pH 可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH 洗脱一些咪唑洗不去的杂带。
为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M 氯化钠，而在平衡缓冲液添加00.1-0.5% 吐温或者triton 可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附2.2.4 表面活性剂及其他添加剂添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度，降低疏水相互作用，这样使纯化的结果更好，在实验表明在平衡缓冲液中加0.5-1% 的吐温可以使电泳的背景更清晰，杂带减少。
对一些难溶解的样品也可以加乙醇或者甘油。
在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯基苏木糖醇，它们如果浓度过高或者上样量过大，会导致镍离子还原甚至脱落，使填料失效，如果要在这样的环境下，那最好选择螯合价位高的填料如镍NTA 琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度，通常1-2mM 是没问题的。
如果一定要选择高浓度的还原剂，也可以把镍离子还成钴离子，它不怕还原，把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可。
以下是破碎及提取、纯化操作和常见问题解决方法：破碎方法样品的处理对纯化是很重要的，重要的原则是破碎要温和，不能使蛋白断裂或者降解，否则一些片段同样也带有标签，这样增加了纯化的难度。
需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间大肠杆菌的破碎方法：1）收集培养发酵液，4 度7000-8000g 离心10 分钟，收集沉淀的菌体（如果不是马上破碎可以放-70 度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。
）2）取1-2 克菌体加10ml 破碎缓冲液（pH7.4 的50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl ，0.5mg/ml 溶菌酶，1mM PMSF ，1mM MgCl2 ，1.7units/ml Benzonase, 其中的菌酶，1mM PMSF ，1.7units/mlBenzonase 现加）在冰上混合45 分钟，如果pH 不在7-8 ，需要用0.5MNaOH 一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml 混合时间可以缩短到10 分钟.3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20 秒种,总共四次,中间间隔要保持2 分钟冷却破碎液,检测pH, 如果不在7-8,还是用0.5MNaOH 一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500 克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1 升,破碎三次,压力为800 bar.4) 破碎的液4 度12000g 离心10 分钟，如果要让溶液更澄清，可以4 度50000g 离心30 分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。
5) 破碎离心的上清加2M 咪唑溶液0.12ml 使终浓度为20mM，样品的总体积为10ml。
过柱子的样品最好过0.45 ^m 的滤膜，避免堵柱。
2．可溶性蛋白的纯化1 )平衡缓冲液：pH7 . 4 的50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl ，含20mM 咪唑。
2) 洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCI , 含500mM 咪唑。
3) 取1ml 镍琼脂糖凝胶FF 或镍NTA 琼脂糖凝胶FF 预装柱，用10ml 平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml 样品以0.5ml/min 上样，然后2ml/ 管分管收集。
4) 用15ml 平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min ，2ml/ 管收集。
5) 用5 ml 洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min ，2ml/ 管收集。
6) 再用5ml 平衡缓冲液平衡柱子，灌满20% 乙醇，封闭，以备下次使用。
7) 此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优化的办法是洗脱可以用50mM ，100mM ，300mM ，500mM 分阶段洗脱，各洗脱5 个柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。
8) 收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA 法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。
3．常见问题及解决方法1) 蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH ，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，避免沉淀。
2) 蛋白不吸附：这是最常见的，通常的原因有1 是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，2 可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA 琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。
3 样品的pH 过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH 要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。
3) 难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM 咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM 咪唑加到6M 盐酸胍去洗脱。
4) 电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5 的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5% 吐温或Triton 可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。
还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM 巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍NTA 琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。
包涵体蛋白的纯化及复性包涵体破碎1、大肠杆菌的破碎方法：1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体（如果不是马上破碎可以放-70 度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。
2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH8.5 50mMTris-HCl ，2mM EDTA ，100mM NaCl ，0.5% Triton X-100 ，1mg/ml 溶菌酶。
）在冰上混合45 分钟。
3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次, 中间间隔要保持2 分钟冷却破碎液,检测pH, 如果不在8.5, 还是用1MTris 溶液一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500 克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1 升,破碎三次,压力为800 bar.4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4 度50000g 离心30 分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。