实验十二-菠菜色素的提取和分析
实验十二- 菠菜色素的提取和分析
菠菜色素的提取和分离
实验目的
1、通过绿色植物色素的提取，学习天然物质的提取方法；
2、通过薄层色谱分析，掌握有机物色谱分析的原理和方法。
二、 实验原理
1 菠菜色素的提取
绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿） 、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等 多种天然色素。
叶绿素 存在两种结构相似的形式即叶绿素 a （C 55H 72O 5N 4Mg ）和叶绿素 b
（C 55H 70O 6N 4Mg ），其差别仅是叶绿素 a 中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶 绿素 b 。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物， 是植物进行光合作用所必需的 催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些 极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（ C 40H 56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即 - 胡 萝卜素、β -胡萝卜素和γ - 胡萝卜素，其中β -胡萝卜素含量最多，也最重要。 在生物体内， β- 胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素 A 。目前β -胡萝卜素已可进 行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（ C 40H 56O 2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝 卜
素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
叶绿素 a （R
=
CH ）
CH 3 CH 3 CH 3
OO
CH 3 CH 2
CH R
N N
Mg
N
N H 3C
CH 2CH 3 CH 3 CO 2CH 3 2 CH 3
H3C R
维生素 A
2 薄层色谱原理
常用 TLC 表示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。 3 薄层色谱的用途：
1）化合物的定性检验。（通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定）在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（ Rf 值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
溶质最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离
2、快速分离少量物质。（几到几十微克，甚至 0.01 μg）
3、跟踪反应进程。在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消
失，来判断反应是否完成。
4、化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。）
此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的
物质
β-胡萝卜素（R = H）叶黄素（R = OH）
CH3 CH3
H3C CH3CH2OH
CH3
4 薄层色谱的操作步骤
1、吸附剂的选择
薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。
1）、硅胶：
“硅胶 H ”—不含粘合剂；
“硅胶 G ”—含煅石膏粘合剂；
其颗粒大小一般为 260 目以上。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而R f 值较小。
酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃
本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶 G。
2、薄层板的制备（湿板的制备）
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g 硅胶 G，加
入 5—6ml 0.5% 的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。本实验用此法制备薄层板 4 片。
3、薄层板的活化将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110℃活化 30min 。氧化
铝板在200℃烘 4h 可得到活性为Ⅱ级的薄板，在 150—160℃烘 4h 可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
4、点样
先用铅笔在距薄层板一端 1cm 处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过 2mm 。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距
离应为 1。点样要轻，不可刺破薄层。
5、展开薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，
可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过 1cm 将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算 Rf 值。
6、显色被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。
本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。
三、主要试剂和仪器
1 试剂：硅胶 G, 95% 乙醇 , 石油醚（60—90℃）, 丙酮 , 无水 MgSO4, 菠菜
2 仪器：层析板（25mm×75mm）, 125ml 广口瓶 , 研钵 , 分液漏斗
四、实验步骤
1 菠菜色素的提取
称取 5g无水的新鲜菠菜叶，用研钵研碎，加入 15 ml 石油醚-乙醇溶剂（3：2）研磨至桨，抽滤，滤液放至分液漏斗中，加入 5ml饱和 NaCl 水溶液，分层，上层再用饱和 NaCl 水溶液洗涤，有机层用无水 MgSO4干燥，滤去 MgSO4后，滤液放入小烧杯中，水浴蒸去溶剂（控制温度（60°-70 ℃），浓缩至 2.5ml 左右为止。
2 薄层层析
取活化后的层析板，点样，小心放入盛有展开剂（ 7：3 石油醚- 丙酮）的广口瓶内，样点不能浸到展开剂中，盖好瓶盖，待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，在空气中晾干，计算三种色素（叶绿素、叶黄素和胡萝卜素）的 Rf 值。
注：叶绿素会出现两点（叶绿素 a，叶绿素 b）。叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度小，从嫩绿叶中得到提取液，叶黄素会显很少。
五、注意事项
注意薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用
六、思考题
1、如何利用 Rf 值来鉴定化合物？
2、薄层色谱法点样应注意些什么？
3、常用的薄层色谱的显色剂是什么？