5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
现代生化技术复习题
. 第一章提取与分离技术一、名词解释1、机械破碎法2、物理破碎法3、温度差破碎法4、压力差破碎法5、超声波破碎法6、渗透压变化法7、化学破碎法8、酶促（学）破碎法9、自溶法10、抽提11、盐溶12、盐析13、沉淀分离法14、分段盐析15、K S分段盐析16、β分段盐析17、等电点沉淀法18、有机溶剂沉淀法19、复合沉淀法20、金属盐沉淀法21、选择性变性沉淀法二、填空题1、细胞破碎的方法有、和。
2、机械破碎法按照使用机械的不同可分为、和。
3、常用的物理破碎法有、和等。
4、常用的压力差破碎法有、和等。
5、化学破碎法采用的表面活性剂有和两种。
其中之一按其带电荷性质又可分为和两种。
6、根据抽提时所采用的溶剂或溶液的不同。
抽提的方法主要有、、和等7、常用的沉淀分析法有、、、、和等。
8、常用的金属盐沉淀法有和。
9、蛋白质盐析时，带入大量盐离子杂质，可采用、和方法脱盐。
10、要分离和提纯核酸过程中，常用来沉淀DNA和RNA。
11、常用的使蛋白质沉淀的方法有、、、和等。
12、三、是非题（对的打√、错的打×）1、渗透压变化法可用于革兰氏阳性菌的破碎。
（）2、有机溶剂破碎细胞主要是使细胞膜磷脂结构破坏，从而使细胞膜的透过性增强。
（）3、用化学法破碎细胞提取酶时，经常用离子型表面活性剂。
（）4、用化学法破碎细胞提取酶时，用非离子型表面活性剂最好。
（）5、对于具有细胞壁结构的细胞采用酶法破碎时，应根据细胞壁结构选择不同的酶。
（）6、酸性物质易溶于酸性溶剂中，碱性物质易溶于碱性溶液中。
（）7、在等电点时两性电解质溶解度最小。
（）8、抽提两性电解质时应避开其等电点。
（）四、选择题1、利用突然降压法破碎革兰氏阴性大肠杆菌应选择期的细胞破碎效果最佳。
A 调整期B 对数生长期C 平衡期D衰退期2、提取膜结合酶采用法破碎细胞最佳。
A 高压冲击法B 突然降压法C 渗透压变化法3、超声波破碎法最适合于破碎。
A 动物细胞B 植物细胞C 微生物细胞4、利用超声波法破碎微生物细胞对期的细胞破碎效果最佳。
实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
3．浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶， 按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子， 上，立即插入梳子，将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4．样品预处理： 样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1 分钟。 混合，100℃加热1～2分钟。 5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 待浓缩胶聚合完全后， 梳子， 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上，上下槽各加入电极缓冲液。 6．加样： 加样： 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下， 将胶板垂直放于室温下，待分离胶 聚合完全后， 聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1．安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边，防止 要用琼脂进行封边， 凝胶泄露， 凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时，要将螺丝拧紧， 安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量一、实验目的：1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理：SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
三、仪器、原料和试剂1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
3、试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g 及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
sds-page测定蛋白质的相对分子量
03 SDS-PAGE测定蛋白质相 对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率 与其相对分子量成反比，即相对分子 量越大，迁移速度越慢。
在电场的作用下，SDS将蛋白质分子 包裹起来，消除了蛋白质分子间的电 荷差异，使相对分子量成为影响迁移 率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加 样孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳，注意控制电流 和电压，确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后，将凝胶取出，放入含有染色液的容器中，染色一定时间，以便观 察蛋白质条带。
脱色
染色完成后，将凝胶取出，放入含有脱色液的容器中，脱色一定时间，以便观 察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中，以促进蛋白 质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性，并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到玻璃板中 的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水，使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响，以 确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中，应将未使用的样品保存在低温环境中，以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性，影响实验结果，因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子 量范围的蛋白质，从低到高均可。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量数据处理(Excel教程)
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量数据处理（Excel教程）(免手工计算，免手工绘图，精确度高)
1.建立excel表格，并将实验数据输入
2.用f（x）=C4/4.5公式，计算出D5值，利用自动填充功能计算出
D列
3.相同方法，用LOG10（）公式计算出F列
4.按住Ctrl键，选中D列、F列，选择插入-散点图并用鼠标选中坐
标点，右击，选择添加趋势线，并显示公式(默认情况下，左列为x轴，右列为y轴)
5.用POWER()公式求得Mr
6.用单元格格式调整每一列的小数点后位数
7.打印即可
1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度（mg/ml）0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 A280 0 0.125 0.189 0.267 0.351 0.408 0.557 0.631
2．样品蛋白质浓度测定
1)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=38.9mg/ml
2)蛋白质（mg/ml）=1.127*30*100/90=56.35mg/ml
3)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=110.23mg/ml
4)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=312.4mg/ml
5)表3--SOD的分离纯化结果表。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。
SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。
蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。
测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。
在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。
染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。
另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。
蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定
蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定⼀、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳⼗⼆烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS - PAGE。
⽤于蛋⽩纯度及蛋⽩质亚基相对分⼦量（relative molecular mass, Mr）测定。
SDS是⼀种阴离⼦去污剂，带有⼤量负电荷，与蛋⽩质结合后使蛋⽩质所带负电荷⼤⼤超过了天然蛋⽩质原有的负电荷，因⽽消除或掩盖了不同种类蛋⽩质间原有电荷的差异。
SDS 破坏蛋⽩质氢键、疏⽔键，引起蛋⽩质构象改变，使蛋⽩质－SDS 复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋⽩质分⼦量成正⽐。
因此，蛋⽩质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋⽩质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋⽩质分⼦量）有关。
蛋⽩质的迁移率与分⼦量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分⼦量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分⼦量的标准蛋⽩质的迁移率对分⼦量对数作图，可获得⼀条标准曲线，未知蛋⽩质在相同条件下进⾏电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分⼦量。
（2）分离效应：PAGE根据其有⽆浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）：采⽤相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）：采⽤不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分⼦筛效应不连续PAGE：电荷效应；分⼦筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为⼤孔径的浓缩胶，下层为⼩孔径的分离胶。
①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成⼀条窄带，然后再进⼊分离胶进⾏分离。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2、掌握垂直板电泳的操作方法。
3、运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
l二、实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2、PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
6 、染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短 玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴 酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带 清晰，即可计算相对迁移率。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：
有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么？
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
轻轻插入梳齿至浓缩胶内，避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合。
3、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
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实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量
一、目的
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
三、试剂和器材
（一）试剂
1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，
定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容
至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：
2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）
0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml
甘油 2.0 ml
质量浓度10%SDS 4.0ml
质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml
β-巯基乙醇 1.0 ml
总体积10 ml
6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。
开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20℃保存。
临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下：
兔磷酸化酶B 97 400
牛血清白蛋白 66 200
兔肌动蛋白 43 000
牛碳酸酐酶 31 000
胰蛋白酶抑制剂 20 100
鸡蛋清溶菌酶 14 400
8. 质量浓度为10%过硫酸铵：（临用前配制）
9. 染色液：
0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。
10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。
11. 待测蛋白样品。
12. 1%琼脂糖（最好用电极液配）
13 TEMED
（二）器材
1. 直流稳压电泳仪。
2. 垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等）。
3. 移液器（1.0ml、200μl、20μl）。
4. 微量注射器（20μl）。
5. 烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺。
6. 脱色摇床
四、操作步骤
1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。
安装后用1%琼脂糖封玻璃板两侧及底部。
2、分离胶的选择和配置方法
1）按照待分离蛋白质的大致分子量选用不同浓度的胶。
2
3、
按照上表左边操作。
因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。
留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。
用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水。
4、浓缩胶的灌制（等分离胶聚合后配制）
按照上表右边操作。
混匀后灌注在分离胶上。
小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约40min）。
5、样品的制备
1）标准蛋白样品的制备（样品约5-10μg，最好离心取上清加样）
取分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷却。
2）待测样品的制备（同标准蛋白质样品处理）
6、电泳
1）待浓缩胶完全聚合后，标记好加样孔位置，将电泳槽注满电极缓冲液，小心拔出梳齿，用电极缓冲液冲洗加样孔数次。
2）用微量注射器按次序向加样孔内加样。
3）接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。
打开电源，调节电流至20～30mA并保持电流强度恒定。
待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
7、染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中。
加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率（R）：
相对迁移率 = 样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（cm）
以标准蛋白质M r的常用对数（lg M r）对相对迁移率作图，得到标准曲线。
根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分子量。