实验六、大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测
6实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
7. 弃去收集液，加入720μl用乙醇稀释的DNA洗涤 缓冲液洗涤柱子，室温10,000×g离心1min，弃去 洗涤液。
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I：碱法提取质粒的原理和方法
(一)试剂等
1. SolutionⅠ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.· Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS
9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管 中，在吸附膜的中间部位加60-100 μl洗脱缓 冲液EB或双蒸水（洗脱缓冲液事先在65℃70℃水浴中加热效果更好）,室温放置1分钟， 13,000rpm离心1分钟洗脱质粒DNA，可立即 用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应 少于50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒 产量。
(四) 实验操作步骤
1.
2.
3.
收集1.5-3mL 菌液的沉淀于1.5 mL Eppenforf离心管中，加入100μl溶液1，振 荡至彻底悬浮。 加入150 μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管 数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体 变得清亮。随后将离心管放置于冰上1-2 分钟（时间勿超！）。 加入150 μl溶液3，立即温和颠倒离心管 数次，室温放置5分钟。12，000rpm 离心 12 分钟。
4. 加400μl溶液P3，立即温和的上下翻转
6-10次，室温放置5分钟。室温13， 000rpm离心10分钟，小心取上清。 5 . (将吸附柱安置于收集管上，加入500μl 溶液P4 ，室温13,000rpm离心1分钟， 弃滤液；) 将上一步所得上清液加入吸附柱AC中 （吸附柱放入收集管中）， 13,000rpm离心1分钟，弃滤液。
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。
2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。
3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。
4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。
5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。
6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。
7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。
8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。
9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。
10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。
结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。
•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。
•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。
•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。
结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。
•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。
•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。
实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。
•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。
•实验室内要保持清洁，避免污染样品。
•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。
参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
质粒DNA的提取实验
实验六质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。
它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。
当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）2、实验试剂(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；(5) 异丙醇、70%乙醇；四、实验步骤（一）提取质粒1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
（由老师完成）2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒提取实验报告
1. 学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术，用于检测提取的质粒DNA。
3. 熟悉实验室安全操作规程，提高实验技能。
二、实验原理质粒是细菌细胞质中独立于染色体之外的小型环状双链DNA分子，具有自主复制能力。
在基因工程中，质粒常作为载体携带外源基因进行扩增和表达。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA，其原理是利用碱性环境使细菌细胞壁和细胞膜破裂，蛋白质变性，从而使质粒DNA与蛋白质等杂质分离。
随后，通过酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤纯化质粒DNA。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌种（含有质粒）2. LB液体培养基3. 碱裂解液（含SDS、NaOH）4. 酚-氯仿5. 乙醇6. TE缓冲液7. 琼脂糖8. 电泳缓冲液9. DNA分子量标准10. 紫外线灯11. 凝胶电泳仪12. 离心机13. 微量移液器14. 玻璃棒1. 菌液制备：将含有质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2. 离心：取1.5ml菌液，4000r/min离心5min，弃上清液。
3. 碱裂解：向沉淀中加入100μl碱裂解液，混匀，室温放置5min。
4. 酚-氯仿抽提：取1/3体积的酚-氯仿，加入上述裂解液，混匀，室温放置10min。
5. 离心：4000r/min离心10min，取上清液。
6. 乙醇沉淀：向上清液加入等体积的乙醇，混匀，-20℃放置1h。
7. 离心：8000r/min离心10min，弃上清液。
8. 溶解：用50μl TE缓冲液溶解沉淀，即为提取的质粒DNA。
9. DNA琼脂糖凝胶电泳：取5μl提取的质粒DNA，加入1μl DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳。
10. 观察：打开紫外线灯，观察电泳结果。
五、实验结果1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的质粒DNA在相应位置出现条带，与DNA分子量标准相符。
2. 提取的质粒DNA纯度较高，无杂质。
六、实验讨论1. 碱裂解法提取质粒DNA操作简便，效率较高，是实验室常用的提取方法。
质粒DNA的提取与电泳检测
2008
分 子实 生验
物 学
2。质粒DNA的提取：
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA， 这些方法都含有以下3个步骤：
◆ 细菌培养物的生长。 ◆ 细菌的收获和裂解 ◆ 质粒DNA的纯化。
2008
分 子实 生验
物 学
三. 仪器和试剂
试剂:
1、质粒快速提取试剂盒
溶液1（SET缓冲液）、溶液2（Lysis Buffer)、溶液3（3M NaAc,Ph4.8)、结合缓冲 液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集 管
2008
分 子实 生验
物 学
(5)向吸附柱加入700ul漂洗液， 12000rpm离心 30秒。倒掉废液，装回吸附柱。
(6)重复（5），再次12000rpm离心2分钟以完全 去除漂洗液。
(7)回收质粒：将吸附柱移到一个新的1.5ml eppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul 洗脱 缓冲液（水浴预热至70度），溶解提取物,室 温放置2分钟，12000rpm离心2分钟.
(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.
2008
分 子实 生验
物 学
五、试验结果 六、结果分析
2008
分 子实 生验
物 学
一. 实验目的
1.通过质粒DNA的提取和检测，掌握提取 质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质 粒DNA的方法。
2008
分 子实 生验
物 学
二. 实验原理
1.质粒概述:
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单 位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线 菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程 中质粒常被用做基因的载体。
(3)裂解：加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打 混匀后, 加入150ul溶液2（用完立即拧紧瓶盖）,温和颠 倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒 5-10次,放置5分钟. 12000rpm离心5分钟
基因工程实验报告
基因工程实验报告生命学院生技114班摘要：一、本次试验内容概况如下：（1）准备植物材料：小麦幼苗（2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。
（目的蛋白的大小会知道，高诱导。
证明符合预期结果。
说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。
）（5）用Weatern杂交去证明。
因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养具体实验过程：一、<一>小麦总RNA提取1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I：碱法提取质粒的原理和方法
(一)试剂等
1. SolutionⅠ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0)
3. 加250 μl的溶液P2，温和的上下翻转6-10 次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。
温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免 质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如 果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。
4. 加400μl溶液P3，立即温和的上下翻转
一、实验目的
了解高纯质粒小量制备试剂盒和 碱法提取质粒的原理
掌握百泰克高纯质粒小量制备试 剂盒方法提取质粒的方法
二、实验原理
(百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法)
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
一、原理简介 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞， 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值 状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA， 再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细
10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH
1% SDS
3. Solution Ⅲ（100 ml）：
5mol/L KAc 60 ml
冰醋酸
11.5 ml
水
28.5 ml
配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋 酸 （pH 4.8）。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用 菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量 丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue 和DH5α等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。
提取质粒实验报告
一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和步骤。
2. 熟悉质粒DNA提取过程中所用试剂和仪器的使用方法。
3. 学习通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒DNA是一种双链闭环的DNA分子，存在于细菌细胞质中，独立于细胞染色体之外。
碱裂解法是提取质粒DNA的一种常用方法，其原理是利用DNA在不同pH值下的变性和复性差异，将质粒DNA从细菌细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 大肠杆菌（含有质粒DNA）- LB液体培养基- 无菌水- 10% SDS溶液- 5M NaCl溶液- 1M Tris-HCl（pH 8.0）溶液- 0.5M EDTA（pH 8.0）溶液- 70% 乙醇- 琼脂糖- DNA标准分子量Marker- 电泳缓冲液- 紫外线灯2. 实验仪器：- 恒温摇床- 台式离心机- 热水浴- 琼脂糖凝胶电泳仪- 移液器- 移液管- 微量离心管四、实验步骤1. 将含有质粒DNA的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2. 取适量培养物，离心（4000r/min，2min）收集菌体。
3. 将菌体悬浮于5M NaCl溶液中，涡旋混匀。
4. 加入10% SDS溶液，涡旋混匀。
5. 加入1M Tris-HCl（pH 8.0）溶液和0.5M EDTA（pH 8.0）溶液，涡旋混匀。
6. 将混合液放入65℃热水浴中，保温15min，使DNA变性。
7. 将变性后的混合液冷却至室温，加入等体积的70% 乙醇，混匀。
8. 离心（12,000r/min，5min）收集沉淀。
9. 将沉淀用70% 乙醇洗涤，离心（12,000r/min，5min）收集沉淀。
10. 将沉淀溶于适量TE缓冲液中，即为提取的质粒DNA。
11. 使用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的质粒DNA在紫外灯下呈现出明亮的目的条带，与DNA标准分子量Marker对应。
质粒DNA的提取与检测
质粒DNA 的提取与电泳检测22100934 程雅楠摘要：将培养的细菌菌种，即含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，通过碱裂解法提取大肠杆菌中的质粒DNA ，并利用琼脂糖凝胶电泳法来检测所提取到的质粒DNA ，通过整个实验流程，初步掌握常用LB 液体/固体培养基和质粒提取试剂的配制方法和技术、碱裂解法提取质粒的技术以及琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。
关键词：质粒DNA ，碱裂解，琼脂糖凝胶电泳人们使用碱与SDS 裂解法从.E.coli 中分离制备质粒DNA 已经有20 多年的历史。
质粒是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA 。
带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。
将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA 探针技术及检测质粒的PCR 技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。
质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。
琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA 的片断的有效方法。
琼脂糖凝胶可分辩0.1-6.0kb 的双链DNA 的片段。
琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。
它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA 分子带负电荷，从负极向正极移动。
根据DNA 分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。
借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA 结合的作用，利用EB 染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA 的片段的位置。
1.材料和方法1.1实验仪器与用具电子天平、pH 酸度计、磁力搅拌器、TOMY SS-325/245自动蒸汽灭菌锅（用于LB 液体/固体培养基和质粒提取试剂的配制）；恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、移液枪（用于碱裂解法提取质粒DNA ）； 微波炉、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪（检测质粒DNA ）。
凝胶电泳系统 pH 酸度计凝胶电泳槽1.2实验试剂与培养基1.2.1 培养基的配制•LB液体/固体培养基LB液体培养基：将10g胰蛋白胨（typtone）、5g酵母提取物（yeast extract）、10g氯化钠完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
质粒DNA的提取及检测实验报告
四川大学实验报告题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
噬菌体、M133.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性1 / 9四川大学实验报告（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。
提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。
鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。
根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。
同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。
通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
实验六、大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测
实验步骤
3.琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳） （1）凝胶制备
①取琼脂糖0.8g，加入100ml的1×TAE电泳缓冲液，配成浓 度为0.8%的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶 解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至 60℃左右时，加 入溴化乙锭至终浓度为0.5μ g／ml，倒进制胶模具中。 ②室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶 的模具放置于电泳槽中。
实验原理
• 琼脂糖凝胶电泳检测
• 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反 的电极移动的现象称为电泳。
•在pH8.0的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电 荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正 极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反 比（仅适于线性分子）。
•通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA 片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即 可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。
（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6）
（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8）
（4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris·Cl
1 mmol/L EDTA （8）上样缓冲液（溴酚蓝 （9） 溴化乙锭（1mg/ml）
碱裂解法实验原理
利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上 的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形 成蛋白质-SDS复合物。同时，在pH12.0~12.5的碱性条件下，线 状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两 条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高 盐缓冲液使pH降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅 速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互 补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结 构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染 色体DNA网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一 起沉淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步 抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
125
四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验步骤
3.琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳） （1）凝胶制备 ①取琼脂糖0.8g，加入100ml的1×TAE电泳缓冲液，配成浓 度为0.8%的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶 解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至 60℃左右时，加 入溴化乙锭至终浓度为0.5μ g／ml，倒进制胶模具中。
实验原理
同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同， 但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一 般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒 （SC）、线性质粒（L）、开环质粒（OC）。 质粒DNA的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的 特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法 有：碱裂解法、煮沸法。 几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒 →收集菌体裂解细胞→分离和纯化质粒DNA。
基础性实验
实验六
大肠杆菌质粒DNA的提取及检测
实验目的
• 掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理和方法。 • 掌握离心机、移液器、震荡培养箱的正确使用方法。 • 了解不同构型的质粒DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率细菌染色体外的能够自主复制的环状 DNA分子。大小在1~200kb之间，质粒DNA通常 以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条 件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色 体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由 于质粒DNA自身具有复制原点、可携带外源基因、 转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使 得质粒成为基因工程中最常用的DNA载体。
（8）上样缓冲液（溴酚蓝
（9） 溴化乙锭（1mg/ml）
实验步骤
1. 菌体的培养与收集 （1）从LB平板上挑细菌单菌落，接种于5ml附加相应抗生 素的LB液体培养基中，37℃250r/min，过夜培养（用对 数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的 OD620=0.2～0.6时为对数期的菌液。也可取1/100的过夜 菌液，继续摇瓶培养2.5h，此时菌液达对数期）。 （2）取1.2ml菌液放在1.5ml的离心管中，5000r/min 4℃ 离心10min，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代 谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内 切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除 干净，最好用STE或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集菌 体后选择以下方法提取质粒。
实验材料、主要仪器及试剂
• 实验材料 prok2系列质粒 • 主要仪器和用具 超净工作台、振荡培养箱 、 微量移液器、 离心机、涡旋 振荡器、制冰机、 离心管架、 1.5mL离心管、吸头、PE手 套、储冰盒、电泳槽、电源、 微波炉、凝胶成像系统。
• 试剂
（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris· HCl（pH8.0）
实验步骤
④ 12 000 rpm离心10 min，将上清液转移至另一新离心管 中。 ⑤ 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。 ⑥ 12 000 rpm离心10 min，弃上清。 ⑦ 加入500 μ l 70％乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管 以洗涤沉淀。 ⑧ 12 000 rpm离心2 min，用移液器吸走上清，打开管盖 于室温下放置10-15 min，使酒精挥发干净。 ⑨ 待沉淀干燥后，加入50 μ l TE缓冲液溶解质粒DNA。
质粒DNA 电泳检测过程示意图
称琼脂糖
加TAE
加热溶解
加EB
灌胶
凝固
放入电泳槽
加溴酚蓝
点样
电泳
观察拍照
质粒DNA
注意事项
• 溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，致癌物质， 并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带 手套。 • 电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，DNA 从阴极向阳极泳动。
思考题
（1）质粒DNA有哪几种构型？其电泳时的泳 动速率如何？ （2）碱裂解法提取质粒DNA的原理是什么？
②室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶 的模具放置于电泳槽中。
（2）上样
在DNA样品中加入1／6体积的上样缓冲液，充分混匀。用 移液器将DNA样品加入样品孔中。
（3）电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑 色，DNA样品由负极往正极泳动。电压降选择为l～5V／cm （长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据不 同的胶浓度与胶长度而异。 （4）观察结果 电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照,观察。对 比标准DNA条带和未知DNA条带，观察其带型和迁移距离， 即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。
碱裂解法实验原理
利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上 的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形 成蛋白质-SDS复合物。同时，在pH12.0~12.5的碱性条件下，线 状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两 条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高 盐缓冲液使pH降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅 速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互 补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结 构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染 色体DNA网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一 起沉淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步 抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。
实验步骤
2.质粒DNA的提取（碱裂解法） ①将收集的细菌沉淀悬浮于100μ l冰预冷的溶液Ⅰ中，强 烈振荡混匀； ②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管 5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上 放置3min. ③加入150μ l预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10 次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将 管置于冰上5～10min。
10 mmol/L EDTA（pH8.0）
灭菌后4℃保存 （2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6） （3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8） （4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris· Cl 1 mmol/L EDTA
实验原理
• 琼脂糖凝胶电泳检测
• 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反 的电极移动的现象称为电泳。
•在pH8.0的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电 荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正 极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反 比（仅适于线性分子）。
•通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA 片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即 可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。
实验原理
质粒DNA分子具有3种不同的构型： SC构型：共价闭合环形DNA（cccDNA），质粒的 两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构； OC构型：开环DNA（ocDNA），质粒的两条多核苷 酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一 处至多处断裂； L构型：线性DNA（linear DNA），质粒DNA发生双 链断裂而形成线性分子。