土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶
1.
土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在
pH4-9的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，
磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷
素生物转化方向与强度的指标。
2.
Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。测定
磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通称为有机
基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。所以，测定酸性、中性和碱性反
应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶
常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液
（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘
油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
（用缓冲液配制）；
取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇
溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；
－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；
－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；
取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、
0.0006、0.0010、0.0014、
-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲0.0018、0.0022
和0.0026mg?g
线。
5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL
0.5％磷酸
苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐
缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。后于培养液中加100mL 0.3％硫酸
铝溶液并过滤。
吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸
缓冲液时，
呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。
磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。
cts，，50,1 酚（）＝mgg,m
-1 －标准曲线上查得的酚浓度,mg?mL；
－显色液体积，mL；
－分取倍数（这里是40＝（20+100）/3）
－土壤质量，g。
方法来源：关松荫. 土壤酶及其研究法. 北京: 农业出版社, 1986.
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数
碱性磷酸酶米氏常数的测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
土壤酸性磷酸酶活性测定
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求 掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。 2．方法原理 酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。 3．主要实验仪器及材料 干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。 4．掌握要点 掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。 5．实验内容 （1）酶液提取。称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。 （2）活力测定。取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。 （3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。 酶活性nmol/min.mg= ） （ ） （ 试样的 g W V V A ? ? ? min 10 1 1.3 019 .0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019； 3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol化为nmol乘上1000； V为酶制剂总体积； V1为每次用酶体积。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。
土壤中性磷酸酶(S-NP)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2901 规格：100管/96样土壤中性磷酸酶（S-NP）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH的显著影响，根据最适PH范围，一般把土壤磷酸酶分为中性、酸性和碱性三种类型。 测定原理： 中性环境中，S-NP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出NP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加576μL无水乙醇（自备），24μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体×1支，0.5 μmol/mL酚标准液，4℃保存。 催化反应： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加400μL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 显色反应： 1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30min，于660nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后室温25℃30 min，于660nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 第1页，共2页
实验三+酸性磷酸酶的组织器官定位
实验三植物体内酸性磷酸酶的组织定位 一、实验目的 1、掌握植物体内酸性磷酸酶的金属盐―铅法染色进行组织定位的原理与技术。 2、掌握制作徒手切片的技术。 二、实验原理 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体的标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。 酸性磷酸酶金属盐―铅法，其基本原理是在酸性环境下，底物β―甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕褐色硫化铅沉淀。 三、实验材料、试剂和仪器 1、实验材料：甘蓝叶片与小白菜叶片。 2、实验试剂：丙酮、β―甘油磷酸钠溶液、2%硫化铵等。 3、实验用品：刀片、镊子、培养皿、托盘等。 四、实验步骤 1、甘蓝叶脉染色 （1）徒手切片的制作：在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住甘蓝叶脉，右手平稳地拿住刀片。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，自左前方向右后方均匀地拉切。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用于材料染色。 （2）将一部分材料薄片铺在载玻片上，滴加蒸馏水铺平材料，加入1滴冰的丙酮溶液，固定15min。固定完成后，用蒸馏水水洗，一边滴加蒸馏水，一边用吸水纸吸，反复2-3次。用滴管慢慢的将切片挑起来，放置在含有10ml的底物溶液中，37℃保温1h。将切片用蒸馏水水洗2~3次后，放置在含有2% 的硫化铵溶液中1-2min，蒸馏水水洗2-3次。将染色的切片盖上盖玻片，制作成临时玻片。显微镜下观察，拍照记录染色结果。 （3）将另一部分切片放置蒸馏水中加热用作空白对照。其余操作同上。 2、小白菜根系染色 （1）将小白菜的根系蒸馏水洗净后，用刀切开，一半用于组织染色，另一半放在蒸馏水中加热煮死，作为空白对照。 （2）将根系放置在含有冰的丙酮溶液中固定15min，用蒸馏水水洗2~3次。固定完
酸性磷酸酶的临床意义
酸性磷酸酶的临床意义 酸性磷酸酶是一种广泛存在于人体组织内的一种物质，主要存在于细胞和体液里面，血液里面的酸性磷酸酶，主要来源于前列腺，来源于血小板，白细胞等，其中在前列腺里面，含量是最丰富的。在日常的医疗检查当中，通过对酸性磷酸酶的检查，能够取得前列腺癌的辅助诊断的作用，另外对于血液病、骨类疾病也有一定的诊断的作用和效果。 ★临床意义 正常人血清中的酸性磷酸酶来源于骨、肝、肾、脾、胰等组织，故不论男女老幼，其含量大致相同。而前列腺患者以及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力都会升高。为了鉴别血清中增加的酸性磷酸酶是来自前列腺还是来自其他器官，必须加以区别。为此可进一步采用某些抑制剂进行选择性抑制作用。例如：乙醇和酒石酸对前列腺酸性磷酸酶有显着的抑制作用，而对红血球酸性磷酸酶的抑制作用较弱。
ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。 (1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对前列腺癌的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：粒细胞白血病、高雪病、尼曼匹克病、原发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多发性骨髓瘤及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。 (5)其他：甲状腺功能亢进，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP
活性可增高。 正常男性血清中酸性磷酸酶1/3～1/2来自于前列腺，女性血清中的酸性磷酸酶主要来自肝脏、红细胞和血小板。酸性磷酸酶有20种同工酶，临床测定的同工酶大致为两大类：一类是前列腺酸性磷酸酶；另一类是非前列腺酸性磷酸酶。酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。
碱性磷酸酶测定
碱性磷酸酶测定 一、试剂配制 1、甲苯 2、pH9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：称取20g纯氯化铵，溶于 少量水（我配200ml，用一百多毫升水溶40g氯化铵）， 然后加入浓氨水润洗烧杯和定容至100ml，用pH试纸测 pH，pH为10即可，不用刻意调pH。（氨水很臭，需要带 口罩在通风橱配） 3、8%铁氰化钾溶液（只能用一周，放冰箱保存）：取8g铁氰 化钾，用水定容至100ml。 4、2%4-氨基安替比林（只能用一周，放冰箱保存）：取2g4- 氨基安替比林，用水定容至100ml。 5、0.5%磷酸苯二钠溶液（用pH9.4硼酸缓冲液配） （1）先配制pH9.4硼酸盐缓冲液：称取4.768g硼砂（十 水合四硼酸钠）和0.44g纯氢氧化钠，用蒸馏水定容至 1000ml。（硼砂需要用电炉加热配制，硼砂用称量纸称量， 氢氧化钠需要用烧杯称量,基本不用配pH，pH试纸测为9） （2）称取5.05g磷酸苯二钠，用pH9.4硼酸缓冲液定容 至1000ml。 6、酚标准溶液： 酚溶液：称取1g苯酚用水溶至1L，保存于暗色瓶中。（苯酚还是需要水浴加热，详细配法看脲酶测定，但由于1g很难准确称量，
并在我配完发现天平托盘上结了一层苯酚，但测量后不影响标线的准确程度，R值为三个9） 酚工作液：取10ml原液用水稀释至1L(1ml中含0.01mg/mL) 二、测定过程 1、称取5g过1mm筛的土样于绿色塑料瓶（每个样需要3个 重复，前两个重复和第三个重复分开放，第三个重复为 无基质重复，每天做两个无土样重复，此重复加甲苯、 磷酸苯二钠溶液），加5滴甲苯（用滴管加5滴），盖盖 盖子后用震荡机低速震荡15min（我选择160的速度）， 然后给第三个重复加入20ml蒸馏水，给前两个重复加入 20ml磷酸苯二钠，盖上盖子后充分摇匀后在37摄氏度恒 温箱培养2小时。 2、培养结束后过滤，过滤后取5ml滤液加入50ml容量瓶（用 5ml枪加，由于过滤液体没那么多，每加一个样用两遍蒸 馏水润洗枪），加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢 氧化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾 溶液（用1ml枪加），每加一种都要充分摇匀。立即显色， 立即定容。 3、标准液是吸取1,3,5,7,9,11,13ml氮的工作液，移至50ml容 量瓶，加水加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢氧 化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾溶 液。（和第二条同步）
土壤五种酶的测定方法
参考文献： 1、关松荫等，编著. 土壤酶及其研究法[M].农业出版社，1986. 2、周礼凯，编著. 土壤酶学[M].科学出版社 关松荫等，1986 蔗糖酶：比色法(1) P274-276 脲酶：比色法P294-297 蛋白酶：比色法9(1) P302-304 磷酸酶：磷酸苯二钠法(2) P312-313 过氧化氢酶：容量法P323 蔗糖酶 比色法 1、试剂 (1) 苯甲酸溶液0.25% (2) 3,5-二硝基水杨酸 (3) pH5.5磷酸缓冲液 (4) 8%蔗糖溶液 (5) 甲苯 2、操作步骤 5克风干土→50mL三角瓶→15mL 8%蔗糖溶液→5mL pH5.5磷酸缓冲液→5滴甲苯 →摇匀放入恒温箱→37℃培养24h →取出迅速过滤→吸取滤液1mL →流水冷却3min →蒸馏水稀释至50mL →508nm比色 3、结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡糖糖（毫克）= a×4 式中a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数 标准曲线：以光密度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标。 Y=0.229×（－0.0209）R２=0.9961
注意： Y值为吸光度值，相当于表中的A平均 X值为根据上述公式计算的结果，相当于a值 葡萄糖含量为a* 4 （毫克） 蛋白酶 比色法（1） 1.试剂 （1）1%酪素溶液 （2）0.1N硫酸 （3）20%硫酸钠 （4）2%茚三酮液 （5）甲苯 （6）甘氨酸标准溶液 2.操作步骤 4g风干土→50ml三角瓶→20ml1%酪素液→1ml甲苯→30℃恒温箱24h → 2ml0.1N硫酸→12ml20%硫酸钠液→15min(6000转/min)离心→上清液2ml 50ml容量瓶→1ml茚三酮→沸水浴10min→蒸馏水稀释至刻度→500nm比色 3.结果计算 蛋白酶活性，以24h后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。 NH2-N(mg)=a*5 式中 a——从标准曲线查得氨基氮毫克数 b——换算成1g土的系数 标准曲线：以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标。 Y=2.8236x+0.011R2=0.9968 X=（y - 0.011）/2.8236 过氧化氢酶
土壤碱性磷酸酶活性测定试剂盒
货号: QS2902 规格：50管/48样 土壤碱性磷酸酶活性测定试剂盒 分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。 测定原理： 碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、蒸馏水、无水乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加50mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加1152μL无水乙醇（自备），48 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体1.5mL×1瓶，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 催化反应： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加400μL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 显色反应： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL蒸馏水，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL标准液，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL上清液，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 第1页，共2页
土壤酸性磷酸酶(Solid-acid phosphatase,S-ACP)活性测定试剂盒
货号：MS2900 规格：100管/96样土壤酸性磷酸酶（Solid-acid phosphatase，S-ACP）活性测定试剂盒 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。 测定原理： 酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加576 μL无水乙醇（自备），24 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 粗酶液提取： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4 mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 测定步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 S-ACP活性计算公式： 第1页，共2页
碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法) 简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。 碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。通过分光光度比色法测定510nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制标准品工作液：。按照下表稀释系列标准品溶液。 2、 准备样品： ① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离 心取上清，-80℃冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。 ② 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的 测定，尿液通常也可以直接用于测定，-80℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。 ③ 高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 编号 名称 TE0007 50T TE0007 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 25ml 50ml 4℃ 避光 试剂(C): 显色基液 75ml 150ml -20℃ 避光 试剂(D): Phenol 标准(1mg/ml) 1ml 2ml RT 试剂(E): ddH 2O 5ml 10ml RT 使用说明书 1份 0 1 2 3 4 5 Phenol(0.05mg/ml)(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ddH 2O(ml) 0.55 0.45 0.35 0.25 0.15 0.05 相当于金氏单位(U/L) 10 20 30 40 50
土壤酶的测定方法
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法 一、土壤蔗糖酶 3，5- 二硝基水杨酸比色法： 1、试剂的配制 ①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶 于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天） ②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠 （11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。 ③8%蔗糖溶液。 ④甲苯。 ⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真 空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。 标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入 15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混
合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。 从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。 无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。 3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫 克数表示。 葡萄糖（毫克）=a×4 式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数 二、土壤淀粉酶 3，5- 二硝基水杨酸比色法: 1、试剂配制 ①1%淀粉。 ②甲苯。
土壤磷酸酶测定方法
磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994) 1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。 2.试剂: （1）甲苯。 （2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。) （4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。 （5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2 ﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。 （6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。 （7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。配置工作曲线用的溶液。将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。 3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计 4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。轻摇混匀并塞上瓶塞，在37 C 条件下培养1h。培养结束后，取下盖子，加入1 ml的CaCL2溶液和4 ml NaOH 溶液，轻摇几秒钟后，滤纸过滤。需做对照：培养后加入底物溶液，其它同上。于400 nm－420 nm进行比色，测定溶液的吸光值（三次测定平行＋二次对照平行）。 5．计算 w＝m1/（m2×K） w：单位时间内对硝基苯酚的产生量 m1：测试溶液钟对硝基苯酚的质量 m2：样品质量 k：水分系数 注意事项：为消除土壤浸出液颜色的影响，应做对照。