小鼠ERb 基因片段的克隆及其在胚胎发育中的表达
肿瘤发生的分子基础培训课件
Theodor Boveri,一九一一
今天,大量de科学证据表明:
抑制细胞生长de染色体
抑癌基因
促进细胞生长de染色体
癌基因
肿瘤发生de分子基础
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肿瘤抑制基因/抑癌基因 （Tumor Suppressor Gene ,TSG）
• 正常细胞中存在de一类调节细胞生长增殖
分化de基因,具有抑制肿瘤细胞增殖作用.
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均 质 染 色 区 （
HSR
） 和 双 微 （
DM
）
肿瘤发生de分子基础
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四 . 易位激活
染色体de易位类似于启动子de插入. 染色体de易 位导致癌基因de重排,从而激活癌基因.
最为典型de是 t ( 九q三四；二二q一一 ) t ( 八q二四；九q三二 )
肿瘤发生de分子基础
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肿瘤发生de分子基础
肿瘤发生de胞中原癌基因可以通过一些机制被 激活,导致基因表达或过表达,从而使 细胞癌变,不同de癌基因激活de机制 与途径不同,一般分为四类:
肿瘤发生de分子基础
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癌基因de激活机制:
• 点突变（point mutation） • 病毒诱导与启动子插入激活 • 基因扩增（gene amplification） • 染色体易位或重排
产物具有GTP酶de活性 ras ( H-ras；K-ras )
四 . 核蛋白类
产物与DNA 结合,与复制启动有关 myc ；fos；jun；erb-A
肿瘤发生de分子基础
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四、 原癌基因
原癌基因de分类
原癌基因de分类与病毒癌基因一样,根据其蛋白 质产物de功能、性质可以分为以下几类:
蛋白质激酶类: c-raf；c-mos； 信息传递蛋白类:c-ras 家族 生长因子类: c-sis 核蛋白类: c-myc；c-fos
新基因INMO2、TDRP的分子克隆及初步功能研究的开题报告
新基因INMO2、TDRP的分子克隆及初步功能研究的开题报告一、研究背景与意义新基因是指在已知基因组序列中没有注释出来的一类基因，具有很高的多样性和时序特异性，可能在某些生理、病理和环境因素下发挥重要的生物学功能。
近年来，随着高通量测序技术的广泛应用，不断有新基因被鉴定和注释，然而对于这些新基因的深入研究仍然十分有限。
INMO2（Intergenic Non-coding RNA Modulating OCRL Expression 2）和TDRP（Testis Development Related Protein）是近期我们实验室发现的两个新基因，它们的序列均未在人类或小鼠基因组中被注释，而且在某些组织或生理状态下表达显著上调，因此我们推测它们可能参与到一些特定的细胞信号调控过程中，研究其功能有助于深化我们对于新基因的认识和基因调控网络的理解。
特别是TDRP基因是一种高度保守的基因，与男性生殖系统发育有关，近年来流感病毒感染研究也发现其参与了病毒的复制和潜伏，其功能极具研究前景和应用价值。
本文拟对这两个基因的分子克隆、序列分析以及亚细胞定位和初步功能进行研究，为其进一步的研究奠定基础，同时对于新基因的研究也将有助于揭示基因调控网络的复杂性。
二、研究方法1. 分子克隆通过PCR扩增人类心肌组织中INMO2、TDRP基因的cDNA，将扩增产物进行酶切和连接，然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选并提取目的基因片段纯化后进行测序。
2. 序列分析使用DNAMAN软件拼接序列，对INMO2、TDRP基因序列进行多序列比对和同源性分析，预测编码蛋白的理化性质（分子量、等电点等）和亚细胞定位。
3. 亚细胞定位采用间接免疫荧光技术检测INMO2、TDRP在HeLa细胞中的亚细胞定位。
将表达INMO2、TDRP的质粒转染HeLa细胞，随后进行共染色体染色体荧光原位杂交（FISH）染色或采用抗体与荧光素配对，在荧光显微镜下观察目标蛋白与核酸或细胞器定位的情况。
转基因小鼠制备方法
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
bZIP转录因子在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用
bZIP转录因子在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用目录一、内容描述 (2)1. bZIP转录因子的研究背景与意义 (3)2. bZIP转录因子在植物中的分布与分类 (4)二、bZIP转录因子的基本特性 (5)1. bZIP蛋白的结构与功能 (6)2. bZIP转录因子的稳定性与活性调节 (8)三、bZIP转录因子在植物逆境胁迫响应中的作用 (9)1. bZIP转录因子对干旱胁迫的响应 (10)节水机制 (11)抗旱基因的表达调控 (12)2. bZIP转录因子对盐碱胁迫的响应 (14)盐碱适应机制 (15)盐碱抗性基因的表达调控 (16)3. bZIP转录因子对低温胁迫的响应 (17)低温适应机制 (18)低温抗性基因的表达调控 (19)4. bZIP转录因子对病虫害胁迫的响应 (20)病虫害防御机制 (21)抗病虫害基因的表达调控 (22)四、bZIP转录因子在植物生长发育中的作用 (23)1. bZIP转录因子对植物生长发育的调控 (24)生长激素的合成与信号传导 (25)光合作用与呼吸作用的调节 (27)2. bZIP转录因子对植物抗逆性的影响 (28)抗逆基因的表达与调控 (30)抗逆性的遗传与表观遗传 (31)五、bZIP转录因子的应用与展望 (33)1. bZIP转录因子在育种中的应用 (34)育种材料的创制 (35)育种性状的改良 (37)2. bZIP转录因子在基因工程中的应用 (39)抗逆基因的克隆与表达 (40)基因编辑技术的应用 (41)3. bZIP转录因子研究的未来趋势与挑战 (42)六、结论 (43)1. bZIP转录因子在植物逆境胁迫响应和生长发育中的重要作用.442. 对未来bZIP转录因子研究的展望 (46)一、内容描述本研究旨在探讨bZIP转录因子在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用。
bZIP是一种重要的RNA结合蛋白，参与了多种生物学过程，包括基因转录调控、蛋白质稳定性维持等。
细胞的克隆技术和胚胎发育
细胞克隆技术基于细胞的全能性和增殖能力。在适宜的培养条件下， 单个细胞可以经过多次分裂，形成大量遗传物质相同的细胞群体。
发展历程及现状
发展历程
细胞克隆技术自20世纪初开始发展，经历了从简单的细胞培养到复杂的克隆动 物的过程。1997年，世界上第一只克隆羊“多莉”的诞生标志着细胞克隆技术 进入了新的时代。
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细胞克隆技术与胚胎发育 的伦理道德问题
人类克隆技术争议
禁止克隆人
目前，全球范围内普遍禁止克隆人的研究和实践，因为这涉 及到人类生命的尊严、人权和社会伦理道德等重大问题。
治疗性克隆与生殖性克隆
治疗性克隆旨在利用克隆技术生产人体细胞和组织，用于治 疗疾病；而生殖性克隆则是为了复制一个完整的人类个体， 这是目前伦理道德争议最大的领域。
利用干细胞具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力，探索其在 治疗各种疾病中的应用。
临床试验与评估
对干细胞治疗方法进行严格的临床试验和评估，确保其安全性和有 效性。
推动相关法律法规完善
立法保障
制定和完善相关法律法规，明确 细胞克隆技术和胚胎发育的合法
地位和应用范围。
监管机制
建立有效的监管机制，对涉及细 胞克隆技术和胚胎发育的研究和 应用进行严格监管，确保其符合
02
加强对克隆胚胎和克隆动物的安全性评估，确保技术应用对人
类健康和生态环境无害。
伦理道德考量
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在推进技术发展的同时，充分考虑伦理道德因素，确保技术应
用符合社会伦理道德规范。
探索新型干细胞来源及治疗方法
开发新型干细胞来源
研究不同组织类型的干细胞，寻找具有再生医学潜力的新型干细 胞来源。
干细胞治疗研究
01
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小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【摘要】BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism. OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs fromC57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and pro tein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.%背景:孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关,但与骨代谢的关系尚不明确.目的:探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用.方法:采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化,采用油红O染色,茜素红染色对其分化能力进行鉴定.在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0,7，14天,采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化.结果与结论:①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主,呈典型的漩涡样生长.油红O染色及茜素红染色呈阳性;②在成骨诱导的第0,7,14天,Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势,而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势,提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)017【总页数】6页(P2625-2630)【关键词】干细胞;骨髓间充质干细胞;成骨分化;核受体;Rev-erbα;Rorα【作者】林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【作者单位】西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学公共卫生学院,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市646000;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院正畸科,四川省成都市 610041【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。
小鼠遗传学及其分类命名
BALB/cByJ
A 278bps deletion of the acyl-Coenzyme The Jackson A dehydrogenase, Laborator y short chain, (Acads )locus The NIH Locus intact
小鼠遗传学及分类命名
顾鹏宇 2008-8
• • • • •
遗传学基础知识 实验小鼠起源 实验小鼠的分类及其命名 遗传监测 繁育体系
分子遗传学
基因（GENE）
•编码特定蛋白产物的DNA序列 •基因可能存在可变形式，称为等位基因（allele）
等位基因(Alleles)
homozygous heterozygous hemizygous
实验小鼠起源
家鼠起源
M. musculus 各亚种的地理分布
History of the Laboratory Mouse
• • • • • • • 1100 BC- color-variant mice (China) 1909first inbred strain 1929The Jackson Laboratory 1962nude mouse 1980first transgenic mouse 1989first knockout mouse 1990sconditional/inducible knockouts, knock-in, mouse genome project • 2002RNA interference knockouts?
近交系的命名
• 基于毛色
DBA (Dilute Brown nonAgouti, first inbred mouse) 基于起源 NZW (New Zealand White) 基于表型 NOD (Non-Obese Diabetic) 其它 BALB/c, C57BL, 129
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达
小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达李娟;张君;张毓【摘要】目的:将小鼠Aire基因定向连入MigR1-GFP质粒,得到长期稳定的Aire 逆转录病毒表达载体,收集逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞,为研究Aire在胸腺细胞终末分化中的作用奠定基础.方法:以小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板扩增得到Aire的ORF片段;将该片段连接入MigR1-GFP质粒;将构建成功的Aire-MigR1-GFP质粒转染293T细胞,收集逆转录病毒上清;使用逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9,流式细胞仪检测感染效率,Western blot确定Aire蛋白的表达.结果:(1)成功得到Aire的ORF片段.(2)构建的Aire逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白.(3)逆转录病毒上清成功感染胸腺基质细胞系MTEC9.结论:成功构建了小鼠Aire逆转录病毒表达载体,并实现了Aire蛋白在胸腺基质细胞系中的强制性表达.%Objective: To construct a recombinant retroviral vector bearing murine Aire gene and establish a thymic epithelial cell line for stable expression of Aire. Methods: Aire ORF was amplified by PCR using the cDNA of mouse thymic stromal cells freshly isolated as template, and subcloned into MigRl-GFP vector to obtail MigRl-Aire-GFP vector. After introducing the MigRl-Aire-GFP into 293T package cells, the cell culture supernatant was used to infect MTEC9. The efficiency of infection was determined by FACS. Western blot was used to detect the expression of Aire. Results:(1) The full-length Aire ORF was obtained. (2)The constructed MigRl-Aire-GFP vector successfully expressed Aire. (3)The retroviral supernatant successfully infected MTEC9. Conclusion: The recombinantretroviral vector bearing murine Aire gene is successfully constructed, and the expression of Aire in mouse stromal cell line is implemented.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2011(017)004【总页数】5页(P443-446,463)【关键词】小鼠;Aire;MigR1;胸腺基质细胞【作者】李娟;张君;张毓【作者单位】天津医科大学免疫学教研室,天津300070;北京大学医学部免疫学系,北京100191;北京大学医学部免疫学系,北京100191【正文语种】中文【中图分类】Q7Aire（autoimmune regulator）是一种自身免疫调节因子，其基因发现于1997年，由于Aire基因突变导致自身免疫性多内分泌病变-念珠菌病-外胚层营养不良（autoimmune polyendocri-nopathy candidiasis and ectodermal dystrophy，APECED），近几年引起人们的广泛关注。
多西环素诱导表达下IL23基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血
文章编号(Article ID):1009-2137(2003)04-0335-06・论著・多西环素诱导表达下IL23基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血蒋激扬,李爱玲,谢蜀生北京大学医学部免疫系,北京100083摘要 本研究探讨用多西环素调控IL23基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用。
构建含小鼠IL23基因逆转录病毒载体系统,转染小鼠骨髓基质细胞系,获得QXMSC1Tet2on2IL23;体外加入多西环素诱导IL23基因表达并检测IL23表达活性;观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSC1Tet2on2IL23与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响。
结果表明:多西环素提高了QXMSC1Tet2 on2IL23细胞系IL23的表达,促进骨髓造血祖细胞克隆形成数;与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化。
结论:应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL23的表达,可促进造血。
关键词 多西环素;IL23;骨髓基质细胞;QXMSC1;造血干细胞;基因转染中图分类号 R392.4;R33112文献标识码 AThe Enhancing E ffects of IL23G ene T ransfected Murine Bone Marrow Stromal Cells on H ematopoiesis under Control of DoxycyclineJ IAN G Ji2Yang,L I Ai2Ling,XIE Shu2ShengDepart ment of I m m unology,Peki ng U niversity Health Science Center,Beiji ng100083,Chi naAbstract To study enhancing effect of IL23gene transfected bone marrow stromal cell which can be induced b y doxycycline(Dox)to express IL23cytokine on the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cell,retrovirus vector system contained mIL23cDNA was established and bone marrow stromal cell line was transfected,and obtained QXMSC1Tet2on2IL23,in which expression level of IL23can be modulated by Dox.The activities of IL23were measured under different Dox concentrations.The numbers of hemato poietic progenitors(CFU2GM,CFU2E,CFU2GEMM and L TC2IC)were measured and the ca pacity of QXMSC1Tet2on2IL23sustaining hematopoietic progenitor cell growth was evaluated.The results showed that IL23gene transfected stromal cell line QXMSC12Tet2on+IL23expressed high concentration of IL23in vit ro under control of Dox.The su pernatant of QXMSC12Tet2on+IL23was able to increase the number of CFU2GM,CFU2E and CFU2GEMM.The total numbers of nucleated cells and long2term cultured colonies increased in L TC2IC assay.It is concluded that in the culture of QXMSC12Tet2on+IL23cells,Dox actually enhancedIL23expression,and thus augmented the proliferation and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells invit ro. K ey w ords doxycycline;IL23;bone marrow stromal cell;QXMSC1;hemato poietic stem cell;gene transfectionJ Ex p Hem atol2003;11(4):335-340影响异基因骨髓移植后造血和免疫功能重建的原因较多,其中骨髓移植前的放、化疗对骨髓造血微环境的损伤是重要原因之一。
克隆选择学说
引子：首先，人们发现不管什么抗原（甚至人工合成的抗原），人体（或动物）总能产生出一个特异性的抗体。
难以置信的是大千世界万物都可以是抗原，而且每个蛋白还可能有多个抗原决定点，那机体要预先准备好那么多的抗体需要多少基因！把整个基因组都用上还不够编码免疫系统的！这个抗体的多样性产生的基础是什么？机理又是什么？Burnet在提出假说时把一个很头痛的问题搁置起来了：多样化的抗体的遗传机理。
首先，他假设机体有一种神奇的机制可以用少量的基因给无数多的抗体编码（这后来被另一位诺贝尔奖获得者证实是VDJ重组），然后几乎所有可能的排列组合都有抗体产生，但是绝大多数的克隆都在免疫发生过程中夭折了。
这些克隆之所以被“选择掉”是因为一旦放他们到外周组织就会产生自身免疫。
克隆选择学说（亦无性繁殖选择学说）克隆又称无性繁殖细胞系或无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下具有完全相同的遗传结构。
是澳大利亚免疫学家F.M.伯内特于1957年提出的抗体形成理论。
现在已知，淋巴细胞不需要抗原的作用，就已分化为多种带有不同抗体的细胞了。
一种抗原侵入人体后，在无数种淋巴细胞中，只有表面本来就带有和这种抗原互补的受体的少数淋巴细胞能和抗原结合。
一经结合，这种淋巴细胞就恢复了分裂的能力，连续分裂产生大量带有同样抗体的淋巴细胞群。
这一群细胞由于是同一来源的，所以称为克隆(clone)，这就是克隆选择学说。
同时该学说强调决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变或修饰编码抗体的基因。
（便于理解比喻：打一个譬喻，教导说很像是做衣服的“量体裁衣”，根据体形大小，裁制合适的衣服；克隆选择学说不是量体裁衣，而是买“成品”，服装店早已备好合乎各种体型的衣服了。
自己不能改变)获得诺贝尔奖（因为免疫耐受方面的贡献）克隆选择学说示意图免疫耐受（b细胞：3种方式t：两种选择）与克隆选择伯内特与梅达沃在“免疫耐受现象”共同获得诺贝尔生理学或医学奖克隆选择学说的提出在五十年前是件不可思议的事。
外源基因在小鼠体内的表达
外源基因在小鼠体内的表达1980年至1982年三年的时间里，外源蛋白在小鼠体内表达的概念从一个想法变成现实。
在此期间几个实验室致力于引入新的基因和外源表达蛋白，首先是在小数的胚胎干细胞内，其次是成熟的小鼠体内。
拉尔夫Brinster和理查德Palmiter 是这一领域的先驱。
在1981年，他们首次演示了病毒基因在小鼠体内的表达。
背景：用一个有效的方法来研究基因和控制他所编码的蛋白在细胞和整个生物体的表达。
DNA重组技术问世之前，生物学家通过将外源的mRNA注入青蛙的卵母细胞来研究mRNA所编码蛋白的生物活性。
分子生物学革命使得基因被融合到特意的启动子上，从而使他们在所需的细胞系内表达。
使得生物学家可以研究人工培养细胞的基因的功能，他们甚至想研究活机体的基因。
这需要特定外源基因在胚胎肝细胞内的表达，将外源基因引入到动物基因组中，并检测其在生物体内的功能。
在1970s初期，Brinster表明，外源基因可以通过将癌细胞注射到中年鼠的由早期囊胚形成的胚胎干细胞内，使其在小鼠体内表达的方法来实现。
然而这种方法使得外源基因在所需的细胞类型中表达是非常困难的。
这需要将外源基因导入小鼠的基因组内。
1980年生物学家表明可以将含有DNA的病毒质粒注入到小数的受精卵中，然后检测新生小鼠中的病毒序列。
这个实验是确定外源基因整合到小鼠基因组中形成的功能性蛋白能否表达。
实验：Brinster的挑战是设计这样一个方案，设计一个简单明了的实验证明外源蛋白存在于小鼠内。
要做到这一点，Brinster选择了一个表达容易测定的酶，而不是他的具有生物学意义的第一只转基因小鼠的蛋白，他选择的是单纯疱疹病毒（HSV）的酪氨酸激酶，这个选择有几个优点，首先，这个基因来源于人类病毒，其序列与小鼠的内源基因不同，可以更容易的整合的小鼠的基因组中。
其次磷酸酪氨酸激酶可以根据放射性标记的胸腺嘧啶脱氧核苷转化为胸苷一磷酸来测定。
最后HSV的胸苷激酶活性的抑制剂不能抑制小鼠內源酶的活性。
拟南芥AT-hook基序核蛋白介导体细胞胚胎发生和基因组复制PPT
Result6 AHL15 overexpression-induced polyploidy occurs by endomitosis dueቤተ መጻሕፍቲ ባይዱto chromosome missegregation.
从p35s:AHL15体细胞胚再生的多倍体植株 的相当频率提出了一个问题，即多倍体何 时被诱导，它是否与SE诱导相关？甚至被 SE诱导促进？
存在2,4-D： pAHL15:AHL15-GUS ahl15/+ pAHL15:AHL15-GUS
通过比较p35S:BBM-GR构建体在野生型 ahl15 ahl19amiRAHL20三重突变背景中诱 导SE的有效性，研究了BBM诱导SE中对AHL 基因的需求。
在野生型背景中的554个原始p35s:BBM-GR 转化子中，诱导了40个（7%）； 但在ahl15ahl19amiRAHL20三重突变背景 中背景中（351个原始转化子中诱导0个） 这一作用被完全消除。
Result4 AHL15 overexpression-mediated chromatin decondensation correlates with SE induction. AHL15在SE启动过程中调节了染色质结构
1、p35s:ahl15子叶原皮细胞染色体DNA碘化丙 啶（PI）染色显示异染色质明显分散(图4a）
由于强烈的染色质解聚，细胞多倍体 化发生在体细胞到胚胎重编程期间。 AHL15过度表达导致强烈的染色质解聚， 与体细胞中胚胎能力的诱导一致。这 阻止了某些细胞中的染色体分离，导 致产生多倍体胚胎细胞并随后产生多 倍体体细胞胚胎的内有丝分裂事件。
相比之下，2,4-D处理导致DAHL15表达 增强，该表达足以诱导体细胞到胚胎 重编程，但不足以诱导内有丝分裂所 需的染色质解聚水平。
《哺乳动物细胞克隆》PPT课件教学资料
研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到 原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的 发育能力会随着胚胎所达到的发育阶段 而改变。
如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘， 胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以, 在分割胚时应包括应滋养层细胞，否则 不足以引起妊娠产仔。
（1）卵裂球分离培养法
✓ 用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明 带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入 透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。
研究表明，以MⅡ期卵母细胞胞质为核移植 的受体细胞最好,目前应用也最普遍。
卵母细胞来源有两种：超排（数量少）、屠 宰场收集卵丘--卵母细胞复合体（COC）在体 外培养成熟后作为受体（数量大）。
第二,受体卵去核
图8-4 核受体成熟卵去核过程示意图
②核供体细胞的准备
核供体细胞主要有两大类三种：胚胎细 胞(胚胎细胞、胚胎干细胞)和体细胞 。
2 克隆羊 1996年7月5日，世界上第
一头由成年羊体细胞经过无性繁殖生成 的克隆羊多莉诞生
3、克隆老鼠Cumulina 1997年，夏 威夷科学家从成年小老鼠的细胞复 制出第一只克隆小老鼠，名叫 Cumulina。
4、克隆奶牛 日本石川县家畜研究中心在 世界上率先从体细胞复制牛，首两头克隆牛 分别名为“KAGA-号”和“NOTO一号”
严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复 制”。随着分割次数增加，发育成完整个 体的能力越差。
(1)基本原理
软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育的2 细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织， 在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就 不能发育成为一个完整胚胎。
大多数哺乳动物为调节发育类型:具有调节发育的能 力。特点： ➢第一,去掉早期胚胎的一半，其余部分可以调整发 育方向，仍可形成一个完整胚胎。 ➢第二，将两个胚胎融合在一起，仍发育成一个胚胎。 ➢第三，调整发育分化能力随胚胎发育的进行逐渐减 弱，组织发育方向变得愈来愈固定。直至调整能力完 全丧失。
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HEREDITAS (Beijing) 2008年3月, 30(3): 347―351 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2007−09−04; 修回日期: 2007−12−21基金项目: 江苏省属高校自然科学重大基础研究项目(编号：2007KJA36029)、江苏省青蓝工程中青年学术带头人培养项目(编号：2004)、江苏省药用植物生物技术重点实验室课题和徐州师范大学自然科学基金重点项目(编号:07XLA09)资助[Supported by the Major FundamentalResearch Program of Natural Science Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions of China (No.2007KJA36029), Grants from Qing Lan Project of Jiangsu Province, P. R. China (No.2004), Grants from Key Laboratory of Jiangsu Province, and Grants from Key Natural Sci-ence Foundation of Xuzhou Normal University (No.07XLA09)]作者简介:张子峰(1975−), 男, 江苏无锡人, 讲师, 硕士, 研究方向：动物分子遗传学、动物发育生物学。
E-mail: zhangzifengsuper@通讯作者:郑元林(1961−), 男, 江苏泰州人, 教授, 博士, 博士生导师, 研究方向：动物分子遗传学、动物发育生物学。
E-mail: ylzheng@DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00347小鼠ER β 基因片段的克隆及其在胚胎发育中的表达张子峰1,2, 樊少华1,2, 陆军2,3, 吴冬梅2, 单群1,2, 胡斌1,2, 李飞1, 郑元林1,21. 徐州师范大学生命科学学院, 徐州 221116;2. 江苏省药用植物生物技术重点实验室, 徐州 221116;3. 东南大学基础医学院, 南京 210000摘要：为探讨ER β在小鼠胚胎发育过程中的表达, 首先设计ER β引物并扩增ER β基因片段, 构建ER β/pGEM-3Z 重组质粒进行克隆, 分别用Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ进行酶切得到线性化DNA 片段, 以Sp6和T7聚合酶合成地高辛标记的(dig )正、反义RNA 探针。
然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ER β 在小鼠胚胎中的表达。
运用该探针检测到ER β 基因在10.5 dpc 胚胎的脑、脊神经管、生殖脊、心包、肢芽及颌弓部位表达, 在13.5 dpc 胚胎的端脑、中脑、延髓、脊髓、肢芽中表达。
推测ER β基因可能在小鼠胚胎性别分化过程中起调节作用; 可能在小鼠胚胎神经管的早期区域化过程中起作用并在3个原始脑泡进一步分化及脊髓的分化过程中起作用; 可能在小鼠胚胎肢芽中的骨与软骨的形成与分化中起调控作用; 可能在小鼠胚胎心脏发育过程中起作用, 可能在小鼠胚胎颌弓的表面分化过程中起调控作用。
关键词：雌激素受体β; 基因克隆; 整体原位杂交; 小鼠胚胎Cloning of gene fragment of estrogen receptor-β and its expression in mouse embryoZHANG Zi-Feng 1,2, FAN Shao-Hua 1,2, LU Jun 2,3, WU Dong-Mei 2, SHAN Qun 1,2, HU Bin 1,2, LI Fei 1, ZHENG Yuan-Lin 1,21. School of Life Science , Xuzhou Normal University , Xuzhou 221116, China ;2. Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province , Xuzhou 221116, China ;3. School of Basic Medical Science , Southeast University , Nanjing 210000, ChinaAbstract: In order to study the expression and regulation effects of estrogen receptor-β (ER β) in the development of mouse embryo, the primer of ER β was designed, the ER β fragment was first obtained by RT-PCR and subcloned into plasmids pGEM- 3Z, then the recombinant plasmids were linearized with the restriction enzymes of Eco R Ⅰand Hin d Ⅲ. Using Sp6 and T7 RNA polymerase, the digoxigenin(dig) labeled sense and anti-sense probes were transcriped in vitro , respectively. Then the expression of ER β in mouse embryo was examined with the probes by whole-mount in situ hybridization. The results indicated that ER β is expressed in the brain, spinal neural tube, genital ridge, pericardium, limb bud and mandibular arch of 10.5 dpc embryo, and is also expressed in the telencephalon, mesencephalon, medulla oblongata, spinal cord and348 HEREDITAS(Beijing) 2008第30卷limb bud of 13.5 dpc embryo. These results suggest that ERβmaybe play a role of regulation in sexual differentiation, pri-mal differentiation of neural tube, further differentiation of three primary cerebral vesicles and spinal cord, generation and differentiation of bone and cartilage of limb bud, development of pericardium and configuration differentiation of mandibu-lar in mouse embryo.Keywords: ERβ; gene cloning; whole-mount in situ hybridization; mouse embryo1996年, Kuiper等首先从大鼠前列腺组织中成功克隆出一种新型雌激素受体, 它由不同于雌激素受体α的基因编码, 因此命名为雌激素受体β(Estrogen Receptor β, ERβ)[1]。
人类ERβ基因定位于染色体14q22-24, 包括7个内含子和8个外显子。
ERβ由 530个氨基酸残基组成, 其相对分子质量为59 200, 其一级结构自N端到C端, 可分为A/B、C、D、E/F等4个功能区。
A/B区是转录调控区, 能调节ERβ与DNA的相互作用, 选择正确的雌激素应答元件(estrogen response element)及调控靶基因的表达。
ERβ被激活的途径有3条：(1)经典的雌激素激活途径, 作为一种配体(激素)依赖的转录因子,其激活后可形成二聚体, 与靶基因启动子区中的雌激素反应元件(ERE)结合, 在一系列共激活子和共抑制子作用下, 激活靶基因转录; (2)以膜受体的方式被激活, ERβ可以结合在细胞膜上, 介导膜启动的类固醇信号传送(membrane-initiated steroid signaling, MISS), 在表达 ER 的 CHO 细胞中, E2通过膜 ERβ激活JNK,而通过 ERα抑制这种激酶[2]; (3)ER还存在配体非依赖性激活的方式, 包括ER的磷酸化, 可与相关信号通路发生相互作用[3]。
ERβ在成体的生殖系统、中枢神经系统、心血管系统、骨骼及其他组织内有广泛的表达, 在这些组织中起生理调节功能[4~6]。
ERβ表达下降与乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌等肿瘤的发生相关[7, 8]。
Hong等[9]报道, 在人类未分化的胚胎干细胞中, ERβ表达明显, 认为ERβ对胚胎干细胞的分化具有调节作用。
然而ERβ在胚胎发育过程中的确切表达时期、部位及其功能尚未明确。
目前尚未见有关利用克隆的ERβ基因片段制备探针, 用胚胎整体原位杂交技术检测其在小鼠胚胎发育过程中表达的文献报道。
本实验通过克隆小鼠ERβ基因的片段, 制备地高辛标记的RNA探针, 运用胚胎整体原位杂交技术研究ERβ在小鼠胚胎发育几个时期的表达情况, 为进一步研究打下了基础。
1 材料和方法1.1材料1.1.1 动物健康的成年雌性小鼠及孕鼠, 由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂Trizol试剂购于Invitrogen公司, RTKit 购于Qiagen公司, T4 DNA连接酶、限制性内切酶Eco R Ⅰ、Hin dⅢ均购于MBI Fermentas公司, 小量质粒抽提Kit、pGEM-3Z载体、T7与Sp6 聚合酶均购于Promega公司, 胶回收 Kit购于Promega公司, 地高辛探针标记Kit购于Roche公司, DEPC购于Sigma 公司, 蛋白酶K购于MBICK公司, 甲酰胺购于Sigma公司, 酵母tRNA购于Invitrogen公司, 绵羊血清购于Chemicon公司, 封闭剂购于Boehringer Mannheim公司, 抗地高辛抗体购于Roche公司, NBT、BCIP购于Promega公司。