植物水分胁迫诱导蛋白研究进展

植物水分胁迫诱导蛋白研究进展

施俊凤1,孙常青2

　(1.山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所,山西太原030031;2.山西省农业科学院作物遗传研究所,山西太原030031)

摘要　干旱是影响植物正常生长发育的一种最主要的逆境因子,研究发现了大量的植物应答水分胁迫的蛋白。笔者综述了这些蛋白的特性和功能,以提高人们对于植物抗旱机理的认识。关键词　水分胁迫;功能蛋白;调节蛋白;植物中图分类号　S311 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)12-05355-03P rogress in P roteins R esponding to W ater Stress in P lants

SHI Jun 2feng et al (Institute of Farm Products S torage ,Shanxi Academ y of Agricultural Sciences ,T

aiyuan ,Shanxi 030031)Abstract Drought is an im portant stress factor ,which im pacts the grow th and developm ent of plants.At present ,a series of proteins responding to water -stress in plants have been reported.T he study summ arizes the characters and functions of these proteins for enhancing integrated understanding to the m echanism of proteins inv olved in the tolerance to water stress in plants.K ey w ords W ater stress ;Functional protein ;Regulatory protein ;Plant

作者简介　施俊凤(1977-),女,山西代县人,助理研究员,从事抗旱

分子研究。

收稿日期　2009202206

干旱在我国是影响区域最广、发生最频繁的气象灾害。植物在遭受干旱胁迫时,会做出各种反应来避免或减轻缺水对其细胞的伤害。随着分子生物学技术和理论的发展,抗旱相关基因不断被克隆,现已证明一些基因表达产物可增强植物的抗逆性。根据其功能,可分为调节蛋白和功能蛋白两大类。

1　调节蛋白

调节蛋白在逆境胁迫信号转导和功能基因表达过程中起调节作用。目前,已发现的主要有转录因子、蛋白激酶、磷脂酶C 、磷脂酶D 、G 蛋白、钙调素和一些信号因子等。

1.1　转录因子　转录因子对水分胁迫的响应非常迅速,一

般数分种即可达最高水平,转录因子C BF1、C BF2、C BF3、C BF4和DRE B1a 、DRE B1b 、DRE B1c 、DRE B2通过与顺式作用元件

CRT/DRE 结合,引起一组含顺式作用元件CRT/DRE 的抗旱

功能基因表达。在拟南芥等多种植物中,DRE 顺式作用元件普遍存在于干旱胁迫应答基因的启动子中,对干旱胁迫诱导基因的表达起调控作用。

转录因子A BF 和bZIP 可与顺式作用元件A BRE 特异结合,通过依赖A BA 的信号转导途径调控植物对冷害、干旱和高盐碱等环境胁迫的反应

[1]

;MY B 和MY C 可与MY BR 和

MY CR 特异结合,引起相应抗旱功能基因的表达;WRKY 调控

的目标基因启动子是具有W 框的顺式元件,在拟南芥中约有100个WRKY 成员,存在于根、叶、花序、脱落层、种子和维管组织中,参与植物胁迫反应的很多生理过程

[2]

。

1.2　蛋白激酶　目前已知的植物干旱应答有关的蛋白激酶

主要有受体蛋白激酶(RPK )、促分裂原活化蛋白激酶

(M APK )、转录调控蛋白激酶(TRPK )等。RPK 与感受发育和

环境胁迫信号相关;M APK 与植物对干旱、高盐、低温等反应的信号传递有关;TRPK 主要参与细胞周期、染色体正常结构维持等的基因表达[3]。

M AP 激酶级联信号转导途径由M AP 激酶(M APK )与M AP 激酶激酶(M APKK )和M AP 激酶激酶激酶(M APKKK )组

成。植物细胞感受环境胁迫(如损伤、干旱、低温等)后,通过受体蛋白激酶、M APK 4、蛋白激酶C 和G 蛋白等上游激活子顺次激活M APKKK 、M APKK 和M APK 。M APK 被激活后进入细胞核,通过激活特定转录因子引起功能基因的表达或停留在胞质中激活其他酶类如蛋白激酶磷酸酶、脂酶等,最终引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应。目前已经在植物中鉴定出多个由干旱胁迫所诱导的与M APK 信号通路有关的蛋白激酶,如A T MPK3、A T MEKK1和RSK 等。利用酵母双杂交系统,M iz oguchi 等证明A T MEKK1参与拟南芥对干旱、高盐、低温和触伤胁迫信号传递的M APK 级联途径[4]。

最近,T aishi 等报道,在拟南芥中有一种蛋白激酶SRK 2C 可响应干旱胁迫诱导,将该基因敲除后的突变体srk2c 对干旱极敏感[5]。另外,用花椰菜病毒的35S 强启动子构建超表达SRK 2C 的转基因植株,其抗旱性也明显增强。

1.3　与第二信使生成有关的蛋白酶　P LC 是主要的磷酸二

酯酶,水解磷酸二酯键,根据水解的磷脂不同,可产生IP3、

DAG 、PA 等。IP3可提高细胞质溶质中的C a 2+浓度,诱导抗

性相关基因的表达[6]。DAG 和PA 可通过诱导活性氧(ROS )的产生,引起相关抗性基因的表达,从而增强植物抗旱性。

C a 2+是最受关注的第二信使,在保卫细胞中,干旱信号

导致C a 2+浓度增加,引起气孔关闭。C a 2+与其受体蛋白钙调素结合发生构象变化,通过C a 2+/C aM 依赖性蛋白激酶

(C DPK )起作用,使蛋白质的S er 或Thr 磷酸化,引起下游信号

传递,使抗旱相关基因表达。

2　功能蛋白　功能蛋白往往是整个水分胁迫调控通路的终

端产物,直接在植物的各种抗旱机制中起作用。当植物遭受水分胁迫时,其本身作为一个有机整体能从各方面进行防御。K azuk o 等将植物水分胁迫功能蛋白分为渗透调节相关蛋白、膜蛋白、毒性降解酶、大分子保护因子和蛋白酶5大类[7]。

2.1　渗透调节相关蛋白　当植物遭受渗透胁迫时,会积累

大量渗透调节物质,如脯氨酸、甘露醇、甜菜碱、可溶性糖和一些无机离子等。这些物质可使植物在胁迫条件下保持吸收水分或降低水分散失,维持一定的细胞膨压,保持细胞生长、气孔开放和光合作用等正常生理过程。现已发现很多渗

安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):5355-5357,5385 责任编辑　胡剑胜　责任校对　况玲玲

透调节物质合成的关键酶类以及糖类、脯氨酸的转运蛋白

等,并通过基因工程手段进行转基因研究,证实了这些基因

在植物抗旱过程中的作用。

目前,对参与渗透调节物质研究较多的是甘氨酸甜菜碱

(G B)合成中的关键酶类。甜菜碱由胆碱经两步合成,在藜科和苋科植物中,甘氨酸甜菜碱生物合成的第一步由胆碱单氧

化酶(C M O)催化,干旱和高盐都诱导C M O的表达,该酶的基

因已被克隆[8]。G B合成的第二步由甜菜碱醛脱氢酶

(BA LDH)催化[9];BA LDH是由核基因组编码的、定位于叶绿体中分子量为54267D的同源二聚体,渗透胁迫下BALDH在

大麦、菠菜、甜菜等植物中可被强烈诱导表达[10]。

与渗透调节相关的关键功能蛋白吡咯啉252羧酸还原酶

(P5CR)和吡咯啉252羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成中的关键酶。干旱胁迫时P5CR的基因表达受强烈诱导,复水时则

受抑,说明该酶为水分胁迫条件下脯氨酸代谢中的限制因子

之一,转入P5CS基因的植株可累积比对照多10～18倍的脯

氨酸,使植株的抗旱和抗盐能力显著提高[11]。有文献指出,

普通菜豆脯氨酸合成酶基因PvP5CS2(Phaseolus vulgaris P5CS2)的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导,脯氨酸积累受PvP5CS2基因转录水平的调控[12]。

糖类也是保护生物体免受干旱损伤的主要物质。Shen

等证明了转甘露醇212磷酸脱氢酶的编码基因mtlD的烟草抗

旱性增强[13]。H olmstrom等将编码酵母海藻糖262磷酸合成酶

亚基(56kD)的tp s1基因转入烟草得到的转基因植株,抗旱性

也明显强于对照[14]。

2.2　膜蛋白　植物遭受水分胁迫的基本伤害是原生质膜的损伤,目前研究较多的与水分胁迫相关的膜蛋白有水孔蛋

白、转运蛋白、离子通道蛋白等。

质膜质子泵H+2A TPase可将质子泵出细胞而形成跨膜质子动力势,影响离子运输和代谢物出入细胞。研究表明,

质膜H+2A TPase受多种逆境条件的影响,可能是逆境的作用位点C as7[15]。关于该酶受水分胁迫诱导表达的大量研究资

料表明,干旱胁迫下植物P M H+2A TPase活性变化因植物种类、品种、组织器官或生育时期而异。胁迫较轻、时间较短的条件下,抗旱的作物、品种或器官,P M H+2A TPase活性高,且干旱胁迫使酶活性有所上升;而胁迫严重、时间较长的条件下,对水

分敏感的作物或品种P M H+2A TPase活性下降[16-17]。

脂转蛋白(LTP)可与磷脂的两个酞基链结合并提高体外

膜间磷脂的转移,可参与膜的生物发生及胞内脂肪酸库的调

节[18]。尽管LTP基因对发育和环境信号的响应很复杂,但

干旱条件下,植物中LTP大量表达的证据已有报道[19]。

水孔蛋白(AQP)不仅可促进水分长距离运输和细胞内

外的跨膜水运输,还可调节细胞胀缩。可分为4类:质膜内

在蛋白(PIPs)、液泡膜内在蛋白(TIPs)、N LM蛋白(N LMs)和小

碱性内在蛋白(SIPs)[20]。在适宜环境下,烟草NtAQP1的表

达对植株水分的吸收无明显作用,但在水分胁迫(PEG处理)

下,反义株快速萎蔫,而正常株体内的NtAQP1大量表达[21]。Long等的报道也表明,水分胁迫下,抗旱性较强的旱稻的水孔蛋白基因RWC3的mRNA表达增加,而抗旱性较弱的水稻RWC3的表达没有明显变化;超表达RWC3的转基因水稻的根渗透水导度、水势及蒸腾等都得到改善[22],因此RWC3的表达可缓解水分胁迫对水稻的影响。但是,Aharon等通过对转拟南芥PIP1b的转基因烟草的研究发现,水分充足时,PI2 Plb的超表达可显著提高植株的生长速率、蒸腾速率、气孔密度和光合速率;而在干旱胁迫和盐胁迫下,PIPlb超表达只有负作用,植株萎蔫的速度更快。因此,他们认为PIPlb在不当的时间空间超表达会产生对植株有害的作用。由此可见,水分胁迫下AQP的表达调控存在较大差异[23]。

2.3　毒性降解酶　在水分胁迫下,活性氧(ROS)的过量积累可造成膜系统、蛋白质和DNA分子结构损伤,尤其对线粒体和叶绿体产生伤害。所以,植物活性氧清除系统中酶活性的高低往往决定着植物抗逆能力的大小。目前已知的主要包括超氧化物歧化酶(S OD)、过氧化氢酶(C A T)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等。

S OD被视为植物抗氧化系统的第一道防线,它能迅速将超氧阴离子歧化为H2O2。大量文献报道,水分胁迫下植物体内S OD含量与其抗性呈正相关。M ckersie等将烟草Mn2S OD 的cDNA导入苜蓿后,抗旱性明显提高,且转基因植株对大田的适应性也明显增强。同时也证明了转基因苜蓿中Mn2S OD 的表达可通过调控叶绿素荧光、电解质渗漏和茎尖再生来减弱水分亏缺的伤害[24-25]。但Van等研究发现,在干旱条件下,叶绿体中Mn2S OD

比对照明显减轻,但在线粒体中这一现象并不明显[26]。

C A T可将S OD的作用产物转化为H2O和氧分子。C A T、S OD和POD共同组成生物体内活性氧防御系统[27],在清除超氧自由基和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。有人曾将大肠杆菌过氧化氢酶转入烟草叶绿体中获得转基因植株,这些植株分解活性氧能力明显增强,在接近沙漠阳光的强光照射下5d后叶片仍不枯黄,而普通烟草2d后叶片变枯黄[28]。

其他的一些毒性降解酶类,如叶绿体内抗坏血酸过氧化物酶(APX),可降低叶绿体中的H2O2浓度,保护光合机构[29];干旱条件下叶绿体谷胱甘肽还原酶(G R)的大量表达不仅有利于H2O2的清除,还能使作为铁氧还蛋白电子受体的NADP得以再生,从而确保电子传递的正常进行[30]。

2.4　大分子保护因子　在严重干旱条件下,有些严重脱水的植物在复水后又能迅速恢复生长,原因是这些植物失水时产生一些脱水保护蛋白。这类蛋白一般具有保守的序列单元,含有较多极性氨基酸,大多高度亲水,具有热稳定性,不易变性,创造了一种起保护作用的水相环境,防止其他蛋白进一步变性,甚至能帮助已变性的蛋白复性。

LE A蛋白是目前研究最多的脱水保护蛋白,最早在棉花子叶中发现,现已证明在干旱环境下很多植物能诱导产生LE A蛋白。S w ire等用酵母菌试验模型系统,研究小麦1族LE A蛋白家族中E m蛋白的功能,认为在酵母中该蛋白对细胞膜有渗透保护作用,在高渗浓度下,能够抑制或减缓生长,促进各种渗透物质的积累[31]。另外,一些旱生植物在脱水过程中,与LE A相关的蛋白家族能被诱导,在脱水状态下可长时间存活,Iuchi等发现高浓度盐胁迫可诱导黎豆cPRD22表达,而这一蛋白与2族LE A蛋白相关[32]。

6535 安徽农业科学 2009年

另外一些分子伴侣可通过与变性或异常蛋白质结合而防止其凝聚,或修补因水分胁迫产生的蛋白质错误折叠,恢复其天然构象,避免细胞结构损伤[33],如:热激蛋白、泛素等。有文献指出,玉米幼苗在受到水分胁迫时,热激蛋白的表达增强[34];而从拟南芥中分离的2个干旱诱导产物(Athsp7021和Athsp7022)的序列也与热激蛋白类似[35]。有人在小麦中发现了分子伴侣基因T a ABC1L,其对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和A BA处理均表现出应答反应[36]。

2.5　蛋白酶　蛋白酶在胁迫代谢中负责蛋白质的更新代谢及氨基酸的循环利用,对于植物受胁迫时要合成大量的新蛋白质来说尤其重要。如半胱氨酸蛋白酶、泛醌蛋白酶、硫醇蛋白酶、C lp蛋白酶等。

许多研究表明半胱氨酸蛋白酶(CP)不仅在环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫条件下mRNA会累积,还和植物细胞程序化死亡有关[37-38]。另外,它还可降解光合作用必需酶Ru2 bisco(1,52二磷酸核酮糖脱羧/加氧酶)的大亚基,在遭受水分胁迫而衰老的植物叶片中,半胱氨酸蛋白酶起主要作用[39]。在马铃薯中发现的TI265主要定位于干旱诱导的叶细胞的细胞核、叶绿体和原生质中,而其相应基因tdi265只受干旱诱导,而不受A BA诱导[40]。

植物在干旱条件下,光合途径由不利于保持水分的C3途径转变为夜间气孔开放而白天气孔关闭的景天酸代谢(C AM)途径。在干旱和高温胁迫时,午时花C AM途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸丙酮酸水合酶的高水平表达促进了其光合作用的C3途径向C AM途径的转变[41]。

3　前景与展望

关于植物水分胁迫应答蛋白的研究已取得了一些进展。但植物对水分胁迫的响应是一个非常复杂的生理生化过程,受多基因控制。植物在水分胁迫下的分子机制和很多细节尚未完全研究清楚。如:①植物遭受水分胁迫时,细胞如何对逆境胁迫信号进行识别、转导,细胞内信息是如何传递的;

②水分胁迫应答蛋白活性的改变或表达量的改变如何与植物所表现出的抗旱性相联系;③水分胁迫应答蛋白中哪些起主导作用;④这些蛋白可以在多大程度上提高植物的抗旱性。相信随着分子生物学技术和方法的不断发展,以及植物逆境生理学、基因组学、蛋白质组学及生物信息学等相关学科的迅速发展,全面阐明植物的抗旱机制,有效地发掘和利用抗旱基因,培育优良的抗旱作物品种将成为现实。

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(下转第5385页)

7535

37卷12期 施俊凤等　植物水分胁迫诱导蛋白研究进展

用提供试验依据。通过RT 2PCR (图2),发现在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏5种组织中均有扩增,片段大小为232bp ,与预计相符,说明在这些组织中,H 2F AB P mRNA

有表达。

　注:1～5分别为肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肺脏总RNA 。　N ote :1-5are total RNA of kidney ,heart liver ,spleenand lung.

图1　总RNA 经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图

Fig.1　Agarose gel electrophoresis o f total denatured RNA w ith 1%

form aldehyde

表1　松辽黑猪脏器组织总RNA 提取浓度

T ab le 1　E xtracting concentration o f total RNA in organ tissues o f Liaosong

b lack pig

组织名称

T issue nam es 稀释倍数Dilution multiple

OD 260

OD 280OD 260/OD 280

浓度∥ng/m l

C oncentration

心脏Heart

200.3150.159

1.98125

2.0

肾脏kidney

200.4580.247 1.854366.4肝脏Liver 20 2.342 1.184 1.9781

873.6肺脏Lung 200.2630.1400.879210.4脾脏S pleen

20

1.5780.304

1.901

1262.4

　注:RNA 浓度=OD 260×40ng/m l ×稀释倍数。

　N ote :RAN concentration OD 260×40ng/m l ×dilution multiple.

3　讨论

为获得高质量的RNA ,最重要的问题是防止RNA 酶对

RNA 的降解,通常采取的措施有在无RNA 酶的环境下进行

操作、抑制内源性RNA 酶的活性和使用RNA 酶的特异抑制剂。其中,RNA 酶抑制剂对其他核酸工具酶无影响,而对

RNA 酶有很强的特异性抑制效果[7]。脏器组织中含有丰富

的蛋白和核糖核酸酶,因此,有效地抑制核糖核酸酶活性和去除蛋白质的污染是获得高质量脏器RNA 的关键。另外,还要保证组织充分裂解、操作迅速、避免DNA 和蛋白的污染

　注:1～5分别为肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肺脏扩增结果;M 为

M arker D L 2000。

　N ote :1-5are PCR am plification results of kidney ,heart liver ,spleen

and lung.

图2　H 2FABP 基因目的片段PCR 扩增结果

Fig.2PCR amp li fication resu lt o f target fragm ent o f H 2FABP gene

等,这样才能获得高质量的RNA 。试验中所用耗材均用

0.1%的DEPC 水浸泡24h 以上;组织样品的研磨在液氮中进

行;加入400μl 新鲜氯仿离心后小心吸取300μl 上清液,从而避免了蛋白和DNA 污染。整个操作过程用时大约50m in 。

综上所述,笔者采用增加氯仿的量减少抽提次数,增加离心转速减少离心时间的方法提取了松辽黑猪脏器组织的

总RNA 。结果显示,所提取的总RNA 质量能完全能满足如

cDNA 文库的构建、RT 2PCR 、RNA 序列分析、差异显示、代表

性差异分析、抑制性消减杂交、N orthern 印迹分析等各种基因表达和定量检测试验的需要。参考文献

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83537卷12期 马倩等　松辽黑猪脏器总RNA 提取方法的改进及应用