献给初学者：大神教你瞬时转染快,准,狠

献给初学者：大神教你瞬时转染快，准，狠

一般情况下，瞬时转染是将DNA 导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。

转染的DNA 不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内（最多一周左右）收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测。

如果过表达基因用质粒，如果敲降用的是siRNA(在microRNA 实验中，过表达用的是mimics，敲降用的是inhibitor)。

通过瞬时转染，将目的基因敲降或者过表达（gain and loss 实验），观察下游靶基因的表达情况，或者细胞表型（phenotype）的变化，例如凋亡，周期，增殖，侵袭，转移等。那该怎么做呢

实验前准备

lipofectamine2000（转染试剂）（避光），Opti-MEMI 减血清培养基（避光），目的基因的质粒或者siRNA（以siRNA 为例），细胞，六孔板，培养基，以及一些细胞实验所需的普通物品。

步骤

1）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖。

2）细胞转染：

1.一般六孔板液体每孔在2ml 左右，不宜太多，或者太少。取两个1.5mlEP 管，记为A 管，B 管，每个EP 管加入250ul Opti-MEM I，然后A 管加入5-10ul lipofectamine 2000，B 管加入100pM-200pM 的siRNA（见买来的siRNA 说明书），然后静置5min，混合在一起，静置20min，用AB 混合液加入到1.5ml 的无血清培养基C 内，混匀；

2. 将六孔板里的细胞的液体吸出，用PBS 清洗两遍；

3. 将ABC 混合液2ml 加入六孔板中；

4.4-6h 后换成正常血清培养基（忌放抗生素），在培养箱内培养；

5.48h 后提取RNA 或者72h 提取蛋白，或者48h 后进行后续相关实验。

实验流程图04

答疑解惑

1.师兄, 转染为什么不能加抗生素？答：抗生素, 比如青霉素和链霉素, 一般对于真核细胞无毒, 但阳离子脂质体试剂

（Opti-MEMI）增加了细胞的通透性, 使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性, 导致转染效率低下。所以在转染的时候不允许加入抗生素。

2.师兄，转不进去怎么办?

答：有以下几种情况：

1）转染siRNA 设计的靶点不好，一般情况下公司都是三保一，所以有一些确实存在敲不下来，或者过表达的质粒太长，例如基因长度大于4000bp 的一般过表达效率不高。

2）这些质粒或者siRNA 过期了

3）转染的时间太短，或者siRNA 或者质粒给的浓度太低，可以延长转染的时间，例如4-6h 换液，改成8h 换液。或者加大质粒或者siRNA 浓度，例如之前给以5ul，现在可以加7.5 或者10ul。

3.师兄，转进去细胞全死了?

答：是不是细胞状态不好，还有可能lipofectamine2000 给多了，建议降低浓度，例如之前加了10ul, 现在改成7.5ul 或者5ul。还有可能是转染时间太长了，降低转染的时间。

4.师兄，48H 提蛋白行不行。

答: 可以的，48H（从转染的时刻开始计时）后基因就都表达了，所以是可以的。

5.如何看转染效率，师兄？答：如果你买的是带GFP，或者RFP 荧光的质粒或者siRNA，可以在48h 后在荧光显微

镜下观察，可以用发亮的程度代表转染的效率，但是最终还是要用PCR 或者western 验证效率。

围棋口诀二百句

围棋口诀 1、金角银边草肚皮盘上落子价值是：角最大（金角），边其次（银边），中腹最小（草肚皮）。 2、三线拆二有根基三线拆二能围住一定的根据地。 3、小目飞挂应尖飞对手小目低位来挂角，用小尖（定式）或者小飞（定式）来应对。 4、见机夹攻更有味机会合适时，用夹的定式也很有趣味。 5、小目高挂三线托对手如果对我小目在四线高位挂角，我可以选择在三线托它。 6、托退定式记一记继续走就是小目高挂托退定式，应该牢牢记住这个定式。 7、星位一挂关或飞我的星位对手来挂角，我可以用小飞或者单关定式来应对。 8、压长定式也可以压长定式也可以选择。 9、布局关键抢要点布局阶段要快速抢占三线四线上重要的点。 10、切莫贪吃走小棋不要去贪吃对方几个子而走价值小的棋。 11、分投定要位置好分投技术使用时一定要选择好位置（三线） 1

12、左右逢源最适宜左右应该都可以有拆二的点才最好。 13、立二拆三搭配好立起来的两个子，可以拆三。这个结构很好。 14、高高低低合棋理围地时应该高（四线）和低（三线）搭配才合理。 15、定要扳住两了头碰到两个子的头，一定要扳住它。 16、逃要关来追要飞逃跑的时候用单关；追击对方时用小飞。 17、扭十字要长一边碰到对方扭我十字时，不要打吃，而是要长一边的子。 18、对杀定要算好气在双方互相包围，对杀的时候，一定要仔细的计算双方的气。 19、几子将死请暂放如果有几个子被对手围住不好跑时，可以先放着不动。 20、一旦走尽无余味如果非要走到死，再没有利用的机会了。 21、棋精再少要保护重要的棋子（棋精）很少也要保护。 22、轻子该弃就要弃无关紧要的棋子可以考虑弃掉。（不要了）23、宁失几子不失先宁可丢掉几个棋子，但不能失去先手。（走棋的权利） 2

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

围棋必胜口诀100句及详解

围棋必胜口诀100句及详解 1、金角银边草肚皮盘上落子价值是：角最大（金角），边其次（银边），中腹最小。（草肚皮） 2、三线拆二有根基三线拆二能围住一定的根据地。 3、小目飞挂应尖飞对手小目低位来挂角，用小尖（定式）或者小飞（定式）来应对。 4、见机夹攻更有味机会合适时，用夹的定式也很有趣味。 5、小目高挂三线托对手如果对我小目在四线高位挂角，我可以选择在三线托它。 6、托退定式记一记继续走就是小目高挂托退定式，应该牢牢记住这个定式。 7、星位一挂关或飞我的星位对手来挂角，我可以用小飞或者单关定式来应对。 8、压长定式也可以压长定式也可以选择。 9、布局关键抢要点布局阶段要快速抢占三线四线上重要的点。 10、切莫贪吃走小棋不要去贪吃对方几个子而走价值小的棋。 11、分投定要位置好分投技术使用时一定要选择好位置（三线） 12、左右逢源最适宜左右应该都可以有拆二的点才最好。 13、立二拆三搭配好立起来的两个子，可以拆三。这个结构很好。 14、高高低低合棋理围地时应该高（四线）和低（三线）搭配才合理 15、定要扳住两了头碰到两个子的头，一定要扳住它。 16、逃要关来追要飞逃跑的时候用单关；追击对方时用小飞、 17、扭十字要长一边碰到对方扭我十字时，不要打吃，而是要长一边的子。 18、对杀定要算好气在双方互相包围，对杀的时候，一定要仔细的计算双方的气。 19、几子将死请暂放如果有几个子被对手围住不好跑时，可以先放着不动。 20、一旦走尽无余味如果非要走到死，再没有利用的机会了。

21、棋精再少要保护重要的棋子（棋精）很少也要保护。 22、轻子该弃就要弃无关紧要的棋子可以考虑弃掉。（不要了） 23、宁失几子不失先宁可丢掉几个棋子，但不能失去先手。（走棋的权利） 24、先刺多数占便宜刺一下对方一般都能够占到便宜。 25、莫压四路休爬二不要压着对方爬四路，自己不要在二路爬。 26、七子沿边活也输爬二路就算你爬了7个子活了，但所得到的“地”太少你还是要输的。 27、要走正着走大棋堂堂正正的走棋，要走价值大的场所。 28、不走废棋不撞气不要走没有用的棋（废棋）不要把自己棋子的气给撞少了。 29、双单形见定靠单碰到“单双”这样的形状，一定要靠住单子。 30、逢方必点逢镇飞看到“方”要点一下；遇到“镇头”用飞来应对。 31、七死八活是常识二路爬的子七个是死的；八个是活的，这是常识。 32、滚打包收是妙棋能走出“滚打包收”的棋很漂亮。 33、连走三同四要变连续走了三步一样的着法，第四步就要变一下。 34、左右同形中为宜左右相同的形状走在中间一般都是要点。 35、拆逼都是宽处拦对方三线下一个子，我拆开逼住它一般都选择走在宽的一边。 36、迫敌靠近我活棋逼迫敌方的棋子靠近我强大的棋。 37、压强不要去压弱压迫敌人“强”的棋子；不去碰他“弱”的棋子。 38、声东目的在击西压迫他强的棋子是为了攻击他弱的棋子。 39、出头舒畅争中腹双方纠缠的时候一定要把“头”走向中腹。 40、当心仅活被封棋不能光顾着做活而被对方轻易封锁。 41、虚镇实尖灵活用镇头，很宽松，但挡住了对方逃跑的路；小尖，步子很慢，却能阻止对方渡过。 42、棋成愚形效率低行棋不要走愚蠢的形状，那样效率很低。 43、边攻击来边围空通过攻击对方来达到围空的目的。（空是指用子围住的地盘）

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。三、培养基配制和灭菌本次实验使用（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

少儿围棋口诀(200句)

少儿围棋口诀（200句）一般棋子在三、四线比较合适，三线利于占地，叫占地线；四线利于取势，叫取势线；所以开始棋总是走在三、四线，能进退自如，二线位置太低，可称为失败线；一线叫死亡线． 1、金角银边草肚皮 2、三线拆二有根基 3、小目飞挂应尖飞 4、见机夹攻更有味 5、小目高挂三线托 6、托退定式记一记 7、星位一挂关或飞 8、压长定式也可以 9、布局关键抢要点10、切莫贪吃走小棋 11、分投定要位置好 12、左右逢源最适宜13、立二拆三搭配好 14、高高低低合棋理 15、定要扳住两了头16、逃要关来追要飞 17、扭十字要长一边 18、对杀定要算好气19、几子将死请暂放 20、一旦走尽无余味 21、棋精再少要保护22、轻子该弃就要弃 23、宁失几子不失先 24、先刺多数占便宜25、莫压四路休爬二 26、七子沿边活也输 27、要走正着走大棋28、不走废棋不撞气 29、双单形见定靠单 30、逢方必点逢镇飞 31、七死八活是常识 32、滚打包收是妙棋 33、连走三同四要变34、左右同形中为宜 35、拆逼都是宽处拦 36、迫敌靠近我活棋37、压强不要去压弱 38、声东目的在击西 39、出头舒畅争中腹40、当心仅活被封棋 41、虚镇实尖灵活用 42、棋成愚形效率低43、边攻击来边围空 44、自己勿活要补棋 45、能立则立曲则曲46、多弃一子能出棋 47、两二被打定要长 48、金鸡独立有骨气49、棋过一半要冷静 50、判断形势定大计 51、若是胜势莫贪心52、稳扎稳打操胜棋 53、若是败势别灰心 54、乘早侵袭找弱棋55、刺打断托点利用 56、弃子造劫借借气 57、挑起纠纷比智力58、力争败局转棋细 59、双先官子抢着走 60、收官需慎莫大意 61、布局常形十二种 62、中国流和二连星 63、对角小目一三五64、星三三和双三三 65、同型小目错小目 66、宇宙流和对角星67、小林流和星小目 68、各型特点要熟记 69、布局掌握三原则70、空守挂角是次序 71、再占急所与大场 72、借势开拆是大棋73、选用定式看全局 74、上下左右搭配齐 75、自己已活可脱先76、抢占要点别犹豫 77、看准敌弱要搜根 78、迫敌走成飘浮棋79、挂星被夹点三三 80、弃子活角两有利 81、弃角取势争模样82、飞封定式要熟记 83、无忧角上两路托 84、试探应手是真意85、敌强欲削宜浅侵 86、进退有路方为宜 87、自己断点常记心88、适时护断别忘记 89、先活自己再杀敌 90、一味贪杀反被欺 91、两块活棋不必断 92、友邻浮子要联系 93、断后敌孤定要断94、该断不断勿成棋 95、冲断扭断反打断 96、挖断跨断寻战机

miRNA及其inhibitor转染方法

miRNA及其inhibitor转染方法 1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。分装后于－80 ℃保存。 2经过调整，细胞状态较好。晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。 3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 min b 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min （2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min b用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min （3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。（4）用无血清的DMEM将培养皿中的细胞清晰干净，至少2次（5）向培养皿中加入3 ml无血清DMEM （6）向培养皿中加入a和b的混合液（成点状均匀加入）（7）放入细胞培养箱作用6 h。 4 下午三点对转染细胞进行换液：弃去无血清DMEM后每个60 mm培养皿加入4 ml 含10%血清的DMEM，18 h后接毒。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

围棋教学口诀

围棋教学口诀、儿歌汇编 ——小朋友:用儿歌口诀学围棋可轻松多了,有趣多了! 围棋歌谣: 小朋友,学围棋, 少儿学棋拍手歌: 围棋好处很神奇. 你拍一我拍一, 初学棋手要牢记; 第一可使脑子灵, 你拍二我拍二, 金角银边草肚皮学习功课不费力; 你拍三我拍三, 开局占角再走边; 第二为国争荣誉, 你拍四我拍四, 断点补上不出事; 拿回冠军多得意; 你拍五我拍五, 做眼多走尖和虎; 有的同学不爱棋. 你拍六我拍六, 并二连三跳着走; 课余玩得没意义; 你拍七我拍七, 对杀要从外紧气; 玩弹球,拍画片; 你拍八我拍八, 凡扳必粘连回家; 时间浪费多可惜, 你拍九我拍九, 十种死活会攻守; 小朋友,多宣传; 你拍十我拍十, 收官抢先不能迟. 大家都来学围棋. 功课抓紧成绩好; 课余学习有意义. 围棋儿歌: 你拿黑棋, 先人后己; 我拿白棋, 没有关系; 黑棋先走, 不要客气; 白棋跟上, 不要忘记; 颗颗棋子, 放对位置; 一人一步, 互相交替; 棋子放好, 都不能移; 棋品第一, 输赢其次. 棋盘的口诀横排十九竖十九, 棋盘口诀（二）：小小棋盘四四方，相交三百六十一; 横竖都是十九行。九颗星星排整齐, 九颗星星天上挂，中间天元别忘记. 中间一颗是天元。落子口诀; 黑子先行白子后, 单双决定第一手. 轮流落子不能改. 要想悔棋不能够. 行棋口诀: 黑子先走白子后, 棋子走了不能移. 走棋先在哪儿走, 金角银边草肚皮. 用兵口诀: 棋盘好比是战场, 棋子就是你的兵. 你当司令来指挥, 巧妙布阵善用兵

气的口诀（一）：气的口诀（二）：一口气，要逃跑，中间一子四口气, 两口气，有危险，边上一子三口气; 三口气，没关系。角上一子两口气. 气的口诀（三）：中间一子四口气，堵住鼻子没有气，边上一子三口气。如果棋子没有气，角上一子两口气，就从棋盘拿出去。. 要想长气连接起。吃子口诀: 从上面打到下面, 从外面打到里面. 让它气越来越少, 最后把它全提掉. 打吃口诀: 一口气时叫打吃, 你不逃跑我就提, 如果打吃要提子, 快快逃跑长出气. 提子口诀: 如果棋子没有气, 就从棋盘拿出去. 拿出死子就叫提. 请你千万别忘记. 连接口诀(一) 一个两个连成片, 连接口诀(二): 子要连, 不让对方切断线, 断要补, 两个三个连成排, 团结起来力量足. 休想把我分断开. 分断口诀: 分断就像切西瓜, 进攻吃子都靠他. 逃子口诀: 棋子危险莫心急, 想想办法来逃棋. 逃跑方向要正确, 方法正确逃出棋. 吃棋口诀: 要想吃棋围上去, 围得没气赶快提. 棋子散散好处多, 断开分别包围起. 双打吃口诀; 双打吃,真奇妙,总有一处逃不掉. 门吃口诀: 抱吃.枷吃.关门吃,就像关窗捉小鸟. 关门吃口诀: 关门吃,真厉害. 小朋友,手眼快, 抓住机会关住门. 敌人休想逃出来. 抱吃口诀: 抱吃也是关门吃. 小鸟飞进休想出,. 看好先关哪扇门, 眼疾手快全逮住.

烟草瞬时转化相关文献

Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y

各种转染试剂的中文转染方法

各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参